Browsing by Author "Brezovsky, Jan. Promotor"
Now showing 1 - 4 of 4
Results Per Page
Sort Options
Item Modelowanie molekularne zależności struktura-dynamika-funkcja w białkach(2023) Surpeta, Bartłomiej; Brezovsky, Jan. PromotorCiągły postęp w nauce, metodach obliczeniowych i technologii umożliwia coraz lepsze badanie białek. Na przestrzeni dziesięcioleci stało się jasne, że białka są dynamicznymi jednostkami i aby dokładnie zbadać ich funkcję, nie wystarczy spojrzeć tylko na strukturę, ale także na nieodłączny składnik dynamiczny. W moich badaniach doktoranckich skupiłem się na wygaszaniu kworum, które pozwala na zakłócenie komunikacji bakteryjnej, zmniejszając w ten sposób czynniki wirulencji. Można to osiągnąć enzymatycznie, a zatem takie enzymy były głównym przedmiotem mojej rozprawy doktorskiej. Praca składa się z czterech artykułów. W pierwszym zbadałem szczegóły dynamicznych składników, które determinują i ograniczają aktywność wygaszania kworum w N-końcowych hydrolazach serynowych. Drugi to przegląd literatury podsumowujący podejścia w inżynierii białek, które uwzględniają dynamikę jako kluczową podczas procesu projektowania. Trzecia część przedstawia bibliotekę TransportTools, oprogramowanie opracowane w naszym laboratorium w celu sprostania wyzwaniu spójnej analizy przestrzeni wewnętrznych w danych zespołu białek pochodzących z masowych symulacji dynamiki molekularnej. Ostatnia część rozprawy obejmuje racjonalne projektowanie wariantów acylazy penicyliny G E. coli o ulepszonej aktywności i modulowanej specyficzności wobec cząsteczek sygnałowych różnych patogennych gatunków bakterii. Ongoing advances in science, computational methods, and technology make it possible to study proteins better and better. Over the decades, it has become clear that proteins are dynamic entities, and to accurately study their function, it is not enough to look only at the structure, but also at the inherent dynamic component. In my Ph.D. research, I focused on quorum quenching, which allows the disruption of bacterial communication, thereby reducing virulence factors. It can be achieved enzymatically, and thus such enzymes were the main interest of my dissertation. The thesis consists of four articles. In the first, I investigated details of the dynamic components that determine and limit the quorum quenching activity in N-terminal serine hydrolases. The second is a literature review summarizing approaches in protein engineering that consider dynamics as crucial during the design process. The third part presents the TransportTools library, software developed in our laboratory to address the challenge of consistent analysis of internal spaces in protein ensemble data resulting from massive molecular dynamics simulations. The last part of the thesis covers the rational design of E. coli penicillin G acylase variants with improved activities and modulated specificities towards signaling molecules of different pathogenic bacterial species.Item Rola tuneli przejściowych w funkcjonowaniu enzymów z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi(2024) Thirunavukarasu, Aravind Selvaram; Brezovsky, Jan. PromotorEnzymy z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi mają prowadzące do nich ścieżki, które nazywane są tunelami. Skupiając się na rodzinie enzymów hydrolaz i podkreślając znaczenie wody w tych tunelach, niniejsze badanie zapewnia cenny wgląd w ich funkcjonalne implikacje. Dzięki wykorzystaniu symulacji dynamiki molekularnej i adaptacyjnych technik próbkowania, stany konformacyjne systemów są dokładnie badane. W szczególności obliczenia tuneli prowadzących do miejsca aktywnego są przeprowadzane dla wszystkich ramek obszernej symulacji, co prowadzi do identyfikacji wcześniej nierozpoznanych tuneli. Śledząc ruch cząsteczek wody z objętości do określonego regionu (miejsca aktywnego) białka, określane są ścieżki transportu wykorzystywane przez enzym podczas symulacji. Aby ułatwić analizę ogromnych ilości danych związanych z tunelami i cząsteczkami wody, opracowano moduł Python o nazwie TransportTools. Moduł ten roku usprawnia analizę obszernych danych dotyczących tuneli i cząsteczek wody. Pomaga w ocenie wykorzystania cząsteczek wody, wydajności transportu i funkcjonalności w strukturach białkowych. Narzędzie to odkryło nowe tunele transportujące wodę w enzymach takich jak dehalogenaza haloalkanowa, zwiększając nasze zrozumienie dynamiki tuneli. Ponadto odkryto, że cząsteczki wody mogą skutecznie poruszać się w wąskich regionach tuneli poprzez interakcje wiązań wodorowych. Odkrycia te zostały potwierdzone poprzez porównanie hydrolazy epoksydowej typu dzikiego z jej mutantem E470G, w którym zaobserwowano wzrost wykorzystania alternatywnych tuneli w mutancie. Co więcej, wybór jawnych modeli wody, takich jak OPC, TIP3P i TIP4P-Ew, znacząco wpływa na wykorzystanie tuneli enzymatycznych przez cząsteczki wody. Zaobserwowane różnice między trzema modelami wody można przypisać różnicom w ich właściwościach dyfuzyjnych i rozkładach ładunku. W przypadku modelu TIP3P migracja wody była zauważalnie przyspieszona, transportując około 2,5- i 2,0-krotnie więcej cząsteczek wody niż w przypadku modeli OPC i TIP4P-Ew. Zjawisko to wynika przede wszystkim z zaobserwowanych krótszych czasów przejścia i większej liczby cząsteczek wody jednocześnie migrujących przez tunele przy zastosowaniu modelu TIP3P. Spójność tych wyników dla różnych enzymów, takich jak oksydaza alditolowa i cytochrom P450 2D6, wraz z geometrią tuneli, podkreśla ich szersze znaczenie. Podkreśla to znaczenie modelu wodnego dla dokładnych symulacji enzymów z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich cykli katalitycznych, projektowania enzymów i przewidywania czasów przebywania leków. The enzymes with buried active sites have pathways leading to them which are called tunnels. By focusing on the hydrolase family of enzymes and emphasizing the importance of water within these tunnels, this study provides valuable insights into their functional implications. Through the utilization of molecular dynamics simulations and adaptive sampling techniques, the conformational states of the systems are thoroughly investigated. Notably, the calculation of tunnels leading to the active site is conducted for all frames of the extensive simulation, leading to the identification of previously unrecognized tunnels. By tracking the movement of water molecules from the bulk to the defined region (active site) of the protein, the transport pathways employed by the enzyme during the simulation are determined. To facilitate the analysis of vast amounts of data related to tunnels and water molecules, a Python module called TransportTools is developed. The module streamlines the analysis of extensive tunnel and water molecule data. It aids in assessing water molecule utilization, transport efficiency, and functionality within protein structures. This tool has uncovered new water-transporting tunnels in enzymes like haloalkane dehalogenase, enhancing our understanding of tunnel dynamics. Additionally, it is discovered that water molecules can effectively navigate narrow regions within the tunnels through hydrogen bonding interactions. These findings are validated through a comparison between wild type epoxide hydrolase and its mutant E470G, where an increase in the utilization of alternate tunnels is observed in the mutant. Moreover, the choice of explicit water models such as OPC, TIP3P, and TIP4P-Ew significantly impacts the utilization of enzyme tunnels by water molecules. The observed differences between the three water models can be attributed to variations in their diffusion properties and charge distributions. With TIP3P model, water migration was noticeably accelerated, transporting about 2.5– and 2.0-times more water molecules than with OPC and TIP4P-Ew models, respectively. This phenomenon primarily arises from the observed quicker transit times and more water molecules concurrently migrating through tunnels when employing the TIP3P model. The consistency of these findings across various enzymes, such as alditol oxidase and cytochrome P450 2D6, along with tunnel geometries, highlights their broader relevance. This emphasizes water model importance for accurate simulations of enzymes with buried active sites which are critical for understanding their catalytic cycles, enzyme design, and predictions of drug residence times.Item Ścieżki transportu ligandów w białkach(2023) Borja, Carlos Eduardo Sequeiros; Brezovsky, Jan. PromotorAnaliza tuneli białkowych ewoluowała od wizualnej identyfikacji w strukturach statycznych do wykorzystania symulacji dynamiki molekularnej, co prowadzi do obfitości danych. Stanowi to jednak wyzwanie ze względu na ograniczenia zasobów i czasu. W ramach moich badań doktoranckich opracowałem narzędzia i metodologie, aby rozwiązać te problemy. Pierwsza publikacja oferuje zintegrowane podejście do analizy geometrii tunelu i transportu ligandów, zapewniając powtarzalność i niesubiektywne wyniki. Druga publikacja umożliwia szybką i opłacalną analizę tuneli w dużych zbiorach danych, eliminując potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu. Ponadto odkrywa wcześniej przeoczone wąskie tunele przy użyciu mniejszej sondy. W sekcji praktycznych zastosowań, trzecia publikacja bada selektywny transport transportera ABCG46, demonstrując, w jaki sposób modyfikacje tuneli wpływają na translokację ligandów. Czwarty artykuł bada transport wody w enzymach hydrolazowych, ujawniając znaczenie wąskich tuneli, które mogą pomieścić cząsteczki wody mniejsze niż ich promień wąskiego gardła. Protein tunnel analysis has evolved from visual identification in static structures to using molecular dynamics simulations, leading to an abundance of data. However, this poses challenges due to resource and time constraints. In my doctoral research, I developed tools and methodologies to address these issues. The first publication offers an integrative approach for tunnel geometry and ligand transport analysis, ensuring reproducibility and non-subjective results. The second publication enables fast and cost-effective analysis of tunnels in large datasets, eliminating the need for specialized hardware. Additionally, it uncovers previously overlooked narrow tunnels using a smaller probe. In the practical applications section, the third publication investigates the selective transport of the ABCG46 transporter, demonstrating how tunnel modifications impact ligand translocation. The fourth paper explores water transport in hydrolase enzymes, revealing the significance of narrow tunnels that can accommodate water molecules smaller than their bottleneck radii.Item Symulacje procesów wiązania ligandów w białkach(2024) Sarkar, Dheeraj Kumar; Brezovsky, Jan. PromotorProcesy biologiczne są wewnętrznie regulowane przez małe cząsteczki i ich interakcje, szczególnie w postaci kompleksów białko-ligand. Transport ligandów w białkach odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w transdukcji sygnału, katalizie enzymów oraz transporcie składników odżywczych i metabolitów. Dlatego zrozumienie procesów wiązania ligandu ma ogromne znaczenie dla opartego na strukturze projektowania leków i inżynierii ulepszonych katalizatorów enzymatycznych. W szczególności znaczna część enzymów ma swoje aktywne miejsce zakopane w głębokich zagłębieniach, a wyzwania polegają na udanym uchwyceniu procesów wiązania i niewiążenia ligandu, ponieważ dostęp do tych wnęk przez małe cząsteczki jest ogólnie ograniczony przez tunele białkowe i bramy. Zmiany w tunelach białkowych często mogą prowadzić do zmiany aktywności, selektywności, rozwiązłości i stabilności. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, w moim doktoracie. w badaniach przyczyniłem się do zbadania właściwości termicznych i kinetycznych poprzez ocenę wykorzystania małych cząsteczek przez tunele transportowe w białkach z zakopanymi aktywnymi miejscami. Zastosowano metody zwiększonej dynamiki molekularnej (MD), aby skutecznie ocenić termodynamikę i kinetykę procesów wiązania ligandu, jednocześnie rozumiejąc leżące u podstaw mechanizmy molekularne. Teza składa się z trzech rękopisów. Pierwsza część pracy koncentruje się na opracowaniu metody poprzez zaprojektowanie opartych na wiedzy schematów siewu w celu skutecznego badania procesów interakcji ligandu w dehalogenazie haloalkanu. Metoda wykorzystuje adaptacyjne symulacje próbkowania do wysokoprzepustowego próbkowania zjawisk wiążących, kierowany przez modele stanu Markowa (MSM) w celu generowania znaczących modeli kinetycznych opisujących stany związane z białkami-ligandem i niezwiązane stany długowieczne oraz ich procesy konwersji. W drugiej części rozprawy masowe wykorzystanie tuneli molekularnych w celu ułatwienia transportu ligandu zostało ocenione i określone ilościowo, aby uzyskać bardziej szczegółowy wgląd w procesy transportu ligandu, pokazując zastosowanie opracowanego przez siebie narzędzia programowego. Wreszcie trzecia część pracy dotyczy dostępności aktywnego miejsca cytochromu c dla zatłoczonych hydrotropów oraz roli ich wiązania ze stabilnością termiczną tego enzymu. Proces badano w dwóch temperaturach obejmujących trzy różne kompozycje hydrotropów, stosując adaptacyjne symulacje próbkowania prowadzone przez modele Markowa. Ujawniono kilka spostrzeżeń na temat roli rozpuszczalników hydrotropowych w zapewnianiu stabilności funkcjonalnym częściom cytochromu c i regulacji dynamiki stanów otwartych i zamkniętych. Ogólnie rzecz biorąc, teza reprezentuje zastosowanie, ocenę, oraz opracowanie wysokoprzepustowego protokołu symulacje wykorzystującego kompleksy białko-ligand do badania procesów wiązania ligandu i jego roli w lepszym zrozumieniu sprzężenia między dynamiką a funkcją enzymów. Biological processes are intrinsically regulated by small molecules and their interactions, particularly in the form of protein-ligand complexes. The transport of ligands in proteins plays a crucial role in many biological processes, including signal transduction, enzyme catalysis and the transport of nutrients and metabolites. Therefore, understanding ligand binding processes is of great importance for the structure-based design of drugs and the engineering of improved enzyme catalysts. Notably, a significant fraction of enzymes have their active site buried in deep cavities, and the challenges lie in successfully capturing the ligand binding and unbinding processes, as access to those cavities by small molecules is generally restricted by protein tunnels and gates. Changes in protein tunnels can often lead to altered activity, selectivity, promiscuity, and stability. To address these shortcomings, in my Ph.D. research, I contributed to investigating thermal and kinetic properties by assessing the utilization of small molecules via transport tunnels in proteins with buried active sites. Enhanced molecular dynamics (MD) methods were applied to effectively assess the thermodynamics and kinetics of ligand binding processes while understanding the underlying molecular mechanisms. The thesis consists of three manuscripts. The first part of the thesis focuses on developing a method by designing knowledge-based seeding schemes to study ligand interaction processes in haloalkane dehalogenase effectively. The method employs adaptive sampling simulations for high-throughput sampling of binding phenomena, guided by Markov State Models (MSMs) to generate meaningful kinetic models describing protein-ligand bound and unbound long-lived states and their interconversion processes. In the second part of the thesis, the massive use of molecular tunnels to facilitate ligand transport was evaluated and quantified to gain more detailed insights into ligand transport processes, showcasing the applicability of the in-house developed software tool. Finally, the third part of the thesis deals with the accessibility of the Cytochrome c active site for crowded hydrotropes and the role of their binding on the thermal stability of this enzyme. The process was studied at two temperatures involving three different compositions of the hydrotropes using adaptive sampling simulations guided by Markov models. Several insights were revealed into the role of hydrotropic solvents in providing stability to functional parts of Cytochrome c and regulating the dynamics of the open and closed states. Overall, this thesis represents the application, evaluation, and development of a high-throughput simulations protocol using protein-ligand complexes to study ligand binding processes and its role in improving the understanding of the coupling between the dynamics and function of enzymes.