Browsing by Author "Kozak, Maciej. Promotor"
Now showing 1 - 7 of 7
Results Per Page
Sort Options
Item Badania procesu amyloidogenezy w obecności surfaktantów gemini oraz z wykorzystaniem technik mikrofluidycznych(2017) Gospodarczyk, Witold; Kozak, Maciej. PromotorJedną ze specyficznych form agregacji białek jest amyloidogenna agregacja (amyloidogeneza), w której łańcuchy polipeptydowe, przechodząc zmiany konformacyjne, łączą się w charakterystyczne długie, włóknopodobne agregaty zwane fibrylami. Podstawowe badania molekularne nad tym procesem mają ogromne znaczenie praktyczne, gdyż ta forma agregacji jest odpowiedzialna za rozwój poważnych chorób człowieka, m.in. choroby Alzheimera, choroby Parkinsona i wielu innych. W dążeniu do przybliżenia się do poznania dokładnego mechanizmu molekularnego agregacji amyloidowej w niniejszej pracy jako cel postawiono zbadanie wpływu przepływu roztworów białka lizozymu oraz peptydu Aβ42 w układzie mikrofluidycznym na tempo tworzenia się amyloidogennych agregatów tych biopolimerów. Przepływ w kanale o niewielkiej średnicy w pewnym stopniu imituje przepływ cieczy w naczyniach krwionośnych organizmu; znaczeniem tych badań było zatem stwierdzenie, czy taka długotrwała cyrkulacja i towarzyszące jej siły ścinające mogą stanowić czynnik ułatwiający formowanie amyloidogennych agregatów. Wyniki tych badań wskazują wyraźnie, że pod wpływem przepływu mikrofluidycznego amyloidogeneza badanych białek zachodziła w diametralnie krótszym czasie. W pracy zbadano także wpływ surfaktantów gemini, interesującej klasy surfaktantów, na amyloidogenną agregację białka lizozymu oraz peptydu Aβ42. Ustalono, że zastosowane surfaktanty wykazywały działanie prowadzące do zahamowania lub opóźnienia agregacji, lub do częściowego rozplatania utworzonych fibryli badanych biopolimerów.Item Badania strukturalne i spektroskopowe kompleksów czwartorzędowych soli bis-imidazoliowych z lipidami i kwasami nukleinowymi(2016-02-04) Kida, Wojciech; Kozak, Maciej. PromotorSystemy dostarczania leków muszą spełniać szereg wymogów, ale przede wszystkim muszą być bezpieczne (nietoksyczne) oraz skuteczne. Najprostszy system do transportu leków składa się z substancji leczniczej (cząsteczki leku, białka lub genu) zamkniętej w odpowiednio dobranym systemie dostarczania. W ramach niniejszej pracy przebadano układy bazujące na lipidach, surfaktantach oraz ich mieszaninach, jako nowe, obiecujące niewirusowe nośniki kwasów nukleinowych w terapii genowej. Celem badań była analiza wpływu czterech surfaktantów gemini na zachowanie strukturalne i fazowe wodnych roztworów fosfolipidu (DPPC), a następnie określenie możliwości zastosowania tych układów jako wektorów w terapii genowej. Układy te scharakteryzowano za pomocą małokątowego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego (SAXS), różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), spektroskopii podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR). Spektroskopii dichroizmu kołowego, (CD), testów elektroforetycznych, a także przeprowadzono testy cytotoksyczności badanych surfaktantów. Wyniki przeprowadzonych pomiarów pozwoliły ocenić związek między geometrią badanych surfaktantów dikationowych, a tworzonymi przez nie strukturami w układach dwu- i trój-składnikowych. Badania strukturalne wykazały, że surfaktanty destabilizują struktury lamelarne typowe dla DPPC i indukują formowanie innych faz strukturalnych. Badania kompleksowania kwasów nukleinowych wykazały, że najbardziej skuteczny jest surfaktant gemini z heksadecylowymi łańcuchami bocznymi oraz dłuższym - heksanowym łącznikiem.Item Badania strukturalne wybranych białek uczestniczących w obronie przeciwko patogenom u Hordeum vulgare(2015-06-19) Taube, Michał; Kozak, Maciej. PromotorRośliny nieustannie narażone są na ataki ze strony patogenów takich jak bakterie, wirusy czy grzyby. Jednym z elementów molekularnych mechanizmów obronnych rośliny są receptory R. Białka R rozpoznają patogenne cząsteczki wewnątrz komórki roślinnej i uruchamiają odpowiedź obronną. Do poprawnego pełnienia swojej funkcji białka R potrzebują udziału kompleksu białek HSP90-SGT1-RAR1. W niniejszej pracy zostały przedstawione wyniki badań nad strukturą poszczególnych białek kompleksu w roztworze za pomocą małokątowego promieniowania rentgenowskiego oraz spektroskopii dichroizmu kołowego. Analiza otrzymanych wyników pozwoliła na wymodelowanie niskorozdzielczej struktury badanych białek oraz wykazanie, że białka SGT1 i RAR1 mają dynamiczną konformację w roztworze. Jednocześnie wykazano, że dimeryzacja domeny TPR białka SGT1 z jęczmienia, rzodkiewnika pospolitego oraz drożdży zależy od siły jonowej, która nie ma wpływu na strukturę i stan oligomeryczny domeny TPR ludzkiego homologa. Zbadano również wpływ wiązania nukleotydów, temperatury i siły jonowej na dynamikę konformacyjną białka HSP90 z pszenicy. Zarówno siła jonowa i temperatura powodują przesunięcie równowagi w stronę konformacji otwartej. Wiązanie nukleotydów nie powoduje natomiast dramatycznych zmian konformacyjnych. Określono także, niskorozdzielczą strukturę kompleksu białek HSP90-SGT1ΔSGS z ADP. W kompleksie tym białko HSP90 ma otwartą konformację. Wiązanie białka HSP90 powoduje dysocjację dimeru białka SGT1. Jednocześnie monomer białka SGT1 wiąże się w sposób asymetryczny do białka HSP90 w stosunku stechiometrycznym 1:2.Item Badania strukturalne wybranych, potencjalnie neurotoksycznych oligomerów ludzkiej cystatyny C (HCC)(2015-10-28) Murawska, Magdalena; Kozak, Maciej. PromotorW ramach niniejszej pracy doktorskiej postawiłam sobie za cel uzyskanie modeli struktur potencjalnie neurotoksycznych oligomerów ludzkiej cystatyny C (HCC). Aby osiągnąć ten cel przeprowadziłam charakterystykę strukturalną stabilizowanych kowalencyjnie form oligomerycznych HCC przy użyciu czterech wybranych metod badawczych: SAXS z wykorzystaniem promieniowania synchrotronowego (DESY, Hamburg), TEM, AFM oraz dynamiki molekularnej. Analiza wyników otrzymanych za pomocą wyżej wymienionych metod ujawniła, że wyższe formy oligomeryczne HCC (dekamery, dodekamery) przyjmują kształt płaskiego pierścienia (donatu) z pustą przestrzenią w centralnej części struktury. Grubość pierścienia wynosząca około 2 nm koresponduje z wysokością jednej podjednostki HCC. Zbudowane modele struktury dekameru i dodekameru HCC wykazywały w trakcie dynamiki molekularnej dużą stabilność, która przejawiała się dobrym stopniem zachowania struktury drugorzędowej testowanych modeli, obecnością trwałych wiązań wodorowych tworzących się pomiędzy podjednostkami cystatyny w oligomerach oraz osiągnięciem plateau na wykresie zmian energii potencjalnej w trakcie symulacji dynamiki molekularnej. Z kolei analiza danych SAXS dla mniejszych form oligomerycznych stabilizowanego kowalencyjnie HCC (dimeru, trimeru) pozwoliła wykazać, że dimer HCC przyjmuje w roztworze formę zgiętą, odpowiadającą strukturze krystalograficznej dimeru w fazie regularnej (PDB: 1G96), natomiast niskorozdzielczy model 3D trimeru HCC ujawnił, że jego molekuła charakteryzuje się strukturą domkniętą o trójkrotnej osi symetrii.Item Badania struktury i dynamiki konformacyjnej lipopleksów na bazie surfaktantów gemini jako nanonośników do terapii genowej(2013-11-12) Pietralik, Zuzanna; Kozak, Maciej. PromotorNiezwykle istotny w terapii genowej jest system dostarczania kwasu nukleinowego (tzw. wektor), który ma zwiększyć wydajność transportu nowego DNA do komórek i chronić materiał genetyczny przed uszkodzeniem. Obiecującą alternatywą dla obecnie stosowanych wektorów wirusowych wydają się być systemy oparte na związkach amfifilowych. Wśród nich dobrymi kandydatami są surfaktanty gemini (składające się z dwóch hydrofobowych łańcuchów i dwóch kationowych głów powiązanych przez grupę łącznikową). Badania przeprowadzono na trzech typach systemów: fosfolipid/surfaktant, fosfolipid/surfaktant/kwas nukleinowy oraz surfaktant/kwas nukleinowy (DNA i siRNA). Zostały one charakteryzowane za pomocą małokątowego rozpraszania promieniowania synchrotronowego (SAXS), różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), spektroskopii podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR), spektroskopii dichroizmu kołowego (CD) i elektroforezy w żelu agarozowym. Badana grupa surfaktantów powoduje obniżenie temperatur przemian fazowych w układach z fosfolipidem oraz destabilizację formowanych przez niego struktur lamelarnych indukując przy tym powstawanie faz unilamelarnych, a także fazy regularnej. W układach z DNA, przy wartości stosunku ładunku dodatniego do ujemnego p/n > 1, obserwowano kondensację kwasu nukleinowego i utworzenie stabilnych kompleksów. Wykazano także zdolność surfaktantów do kompleksowania jednoniciowego i dwuniciowego oligomeru siRNA. Otrzymane wyniki pozwoliły wytypować układy będące najbardziej obiecującymi kandydatami do zastosowania w terapii genowej do transportu zarówno DNA jak i siRNA.Item Badania właściwości fizyko-chemicznych kompleksów dsDNA i siRNA z nowymi czynnikami transfekcyjnymi(2021) Andrzejewska, Weronika; Kozak, Maciej. PromotorJednym z aktualnych wyzwań stojących przed medycyną jest perspektywa skutecznego leczenia szerokiego spektrum chorób dotąd nieuleczalnych. Rozwiązaniem wydaje się być rozwijana w ciągu ostatnich dekad terapia genowa, polegająca na leczeniu chorób o podłożu genetycznym przy pomocy terapeutycznych fragmentów kwasów nukleinowych (np. siRNA). Pomimo dobrze określonych założeń teoretycznych oraz szeregu pomyślnie przeprowadzonych testów, swobodne i nieograniczone zastosowanie terapii genowej w celach terapeutycznych jest nadal ogromnym wyzwaniem. Skuteczne ominięcie mechanizmów odpowiedzi immunologicznej komórek docelowych pacjenta jest bardzo trudne. W obliczu tych faktów ważnym problemem okazuje się być pomyślne przeprowadzenie procesu transfekcji, czyli wprowadzenia materiału terapeutycznego do wnętrza komórek docelowych. Interesującą grupą związków chemicznych wykazujących pożądane właściwości są oligomeryczne surfaktanty kationowe. W ramach niniejszej rozprawy jako czynniki transfekcyjne testowano dwie serie surfaktantów typu dikationowego oraz dwa surfaktanty trikationowe. Na podstawie badań stwierdzono, że wszystkie te surfaktanty trwale kompleksują oligomery dsDNA i siRNA tworząc ich stabilne lipopleksy, przy czym najwydajniej proces ten zachodzi przy użyciu surfaktantów z grupy dichlorków amoniowych. Otrzymane wyniki są bardzo obiecujące i predestynują testowane surfaktanty oligomeryczne do dalszych badań nad ich potencjalnym zastosowaniem w terapii genowej.Item Fałdowanie i agregacja ludzkiego białka prionowego: biofizyczne badania oddziaływań z jonami metali oraz konstruktem peptydowym NCAM1-Aβ(2022) Gielnik, Maciej; Kozak, Maciej. Promotor; Wärmländer, Sebastian. Promotor pomocniczyProces nieprawidłowego fałdowania komórkowej formy białka prionowego (PrPC), jest związany z rozwojem śmiertelnych chorób neurodegeneracyjnych znanych jako pasażowalne encefalopatie gąbczaste, do których należy choroba Creutzfeldta-Jakoba występująca u ludzi lub choroba „szalonych krów” występująca u bydła. Proces ten nie jest zjawiskiem wyjątkowym: w odpowiednich warunkach wszystkie białka mogą ulec zmianie strukturalnej z dobrze rozpuszczalnego stanu natywnego do nierozpuszczalnego i włóknistego stanu amyloidowego. Takie błędne fałdowanie białek połączone z ich agregacją związane jest również z kilkoma innymi chorobami neurodegeneracyjnymi. Ludzkie białko PrPC jest zbudowane z 208 aminokwasów i składa się z dwóch strukturalnie różnych domen: nieustrukturyzowanej domeny N-terminalnej (DNT) oraz ustrukturyzowanej, głównie α-helikalnej, domeny C-terminalnej (DCT). DNT posiada ośmioaminokwasową powtarzającą się sekwencję (ang. octarepeat, OR), która poprzez reszty histydynowe wiąże jony metali Cu(II) i Zn(II). Wiele kofaktorów, włączając w to jony metali, wpływa na błędne fałdowanie białka PrPC. W niniejszej pracy zastosowałem różnorodne, komplementarne metody biofizyczne do zbadania strukturalnych skutków wiązania jonów Cu(II) i Zn(II) przez ludzkie białko PrPC oraz przez peptyd zawierający sekwencję OR. Wyniki spektroskopii dichroizmu kołowego (ang. circular dichroism, CD) sugerują, że peptyd OR wiąże cztery jony Cu(II) oraz dwa jony Zn(II). Bliskie stechiometrycznym stężenia jonów obu metali wywołują zmianę helisy poliprolinowej typu II w zwrot β, natomiast stechiometryczne stężenia obu jonów metali wywołują powstanie antyrównoległych arkuszy β. Symulacje dynamiki molekularnej peptydu OR związanego z jonami metalu wskazują formowanie struktur spinek do włosów posiadających antyrównoległe arkusze β. Bezpośrednie dodanie jonów Zn(II) do peptydu OR skutkuje wiązaniem barwników, charakterystycznych dla włókien amyloidowych takich jak tioflawina T oraz czerwień Kongo. Po inkubacji peptydu OR z jonami Zn(II) obrazowanie z zastosowaniem mikroskopii sił atomowych oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujawniło obecność włóknistych struktur. Charakterystyczny obraz dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego wykazał obecność poprzecznych arkuszy β, typowych dla włókien amyloidowych. W związku z powyższym wiązanie jonów Cu(II) i Zn(II) przez peptyd OR może prowadzić do powstania struktur amyloidowych. W przypadku ludzkiego białka PrPC wiązanie jonów Zn(II) przez region OR skutkuje oddziaływaniem pomiędzy DNT i DCT. Spektroskopia CD wskazuje na utratę struktury α-helikalnej na skutek wiązania jonów Zn(II), prawdopodobnie w obrębie helisy drugiej i trzeciej, zlokalizowanych w DCT, oraz powstanie zwrotów β, prawdopodobnie dokoła związanego jonu Zn(II). Wyniki miareczkowania z zastosowaniem spektroskopii fluorescencji oraz CD sugerują, że pozorna stała dysocjacji dla kompleksu PrPC·Zn(II) mieści się w granicy niskich stężeń mikromolowych, przez co można wnioskować, że takie oddziaływanie jest możliwe w warunkach fizjologicznych. Symulacje dynamiki molekularnej dla kompleksu PrPC·Zn(II) wskazują stabilizację trzeciej α-helisy, podczas gdy wyniki małokątowego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego sugerują bardziej kompaktowe zwinięcie białka PrPC związanego z cynkiem. Jako że wiązanie cynku do białka PrPC faworyzuje oddziaływanie międzydomenowe i stabilizuje trzecią α-helisę, cynk może hamować proces agregacji lub tworzenia włókien amyloidowych przez białko PrPC. Ponadto zbadano wpływ zaprojektowanego peptydu NCAM1-Aβ na agregację i tworzenie włókien amyloidowych przez ludzkie białko PrPC. Białko PrPC i peptyd NCAM1-Aβ same tworzą struktury amyloidowe, jednak ich wspólna inkubacja przez trzy dni skutkowała powstaniem wyłącznie niewielkich agregatów. Uzyskane wyniki sugerują bezpośrednie oddziaływanie peptydu NCAM1-Aβ z ludzkim białkiem prionowym, prawdopodobnie poprzezo ddziaływania hydrofobowe, oraz inhibicję agregacji białka PrPC.