Browsing by Author "Skrzypczak, Tomasz"
Now showing 1 - 1 of 1
Results Per Page
Sort Options
Item Genomika funkcjonalna składników kompleksu gamma-sekretazy Arabidopsis thaliana(2015-10-08) Skrzypczak, Tomasz; Wojtaszek, Przemysław. PromotorKompleks gamma-sekretazy wykazuje aktywność proteazy wewnątrzbłonowej i jest odpowiedzialny za powstawanie neurotoksycznego β-amyloidu. Do podstawowych podjednostek kompleksu należą cztery integralne białka błonowe: presenilina 1 lub 2, APH-1, PEN-2 oraz nikastryna. Homologii wszystkich podjednostek kompleksu występują również w komórkach roślinnych. Do tej pory wykazano m.in. że oddziałują one za sobą i lokalizują w obrębie systemu błon wewnętrznych. Nie poznany jest jeszcze żaden substrat roślinnej γ-sekretazy. W badaniach opisanych w tej rozprawie wykazano, że β-amyloid może powstawać w komórce roślinnej w sposób niezależny od presenilin. Ludzka presenilina 1 okazała się nie oddziaływać z podjednostkami γ-sekretazy A. thaliana, ale kolokalizowała z roślinną presenilina 1. Eksperymenty TAP-tagging, gdzie oczyszczano presenilinę 2, oraz koimmunoprecypitacji PEN-2 umożliwiły wytypowanie białek potencjalnie oddziałujących z podjednostkami roślinnej γ-sekretazy. Wśród zidentyfikowanych białek znalazły się m.in. takie białka, jak białka z rodziny retikulonów oraz EMP70, inhibitor proteaz typu Kunitz, białka zaangażowane w procesy ERQC Do dalszej analizy wybrano interakcję presenilin z retikulonem RTNLB1. Zastosowanie metod mikroskopii konfokalnej pozwoliło na potwierdzenie kolokalizacji presenilin z RTNLB1, ale już nie bezpośredniego oddziaływania między tymi białkami. Zbadano także relację pomiędzy presenilinami a receptorem flageliny FLS2 – preseniliny, w odwrotności do RTNLB1, nie wpływały na transport FLS2 do błony, ani nie oddziaływały z FLS2. Metoda FRET-FLIM umożliwiła opisanie interakcji presenilin z białkiem TIRP należącym do rodziny białek TIR-X oraz z białkiem podobnym do R-SNARE. Oba te białka wykazują się pojedynczą domeną transbłonową i są potencjalnymi substratami γ-sekretazy. Nadekspresja TIRP w epidermie tytoniu powodowała zamieranie komórek w liściu N. benthamiana. Taki efekt jest często obserwowany w przypadku białek zaangażowanych w reakcje roślin na atak patogenów, w tym także wśród białek z domeną TIR. Obecność domeny transbłonowej TIRP okazała się zbędna żeby TIRP oddziaływało z preseniliną 1. Potwierdzono także oddziaływanie TIRP z RTNLB1. Analiza BN-PAGE prób pochodzących z protoplastów z nadekspresją podjednostek γ-sekretazy wskazuje że kompleks ten może mieć w komórkach roślinnych wielkość ok. 700 kDa.