Browsing by Author "Sobczak, Krzysztof. Promotor"
Now showing 1 - 8 of 8
Results Per Page
Sort Options
Item Identyfikacja nowych modyfikatorów niekanonicznej biosyntezy toksycznego białka poliglicynowego ze zmutowanego mRNA FMR1(2024) Tutak, Katarzyna; Sobczak, Krzysztof. Promotor; Baud, Anna. Promotor pomocniczyChoroby związane z premutacją łamliwego chromosomu X (FXPAC) wynikają z mutacji w genie FMR1 na chromosomie X, który odpowiada za produkcję białka FMRP. Rejon regulatorowy genu FMR1 zawiera między 25–35 powtórzeń trójki nukleotydowej CGG, natomiast patologiczna ekspansja w zakresie od 55 do 200 powtórzeń leży u podstaw FXPAC, prowadząc do chorób takich jak zespół drżenia/ataksji związanej z łamliwym chromosomem X (FXTAS) i przedwczesne wygasanie funkcji jajników (FXPOI). Patomechanizmy zaangażowane w wywołanie i progresję FXPAC obejmują sekwestrację białek do toksycznego RNA tworzącego struktury drugorzędowe, kotranskrypcyjne powstawanie tzw. pętel R powodujących uszkodzenie DNA oraz związaną z powtórzeniami translację typu RAN, która prowadzi do produkcji toksycznych białek, zwłaszcza białek poliglicynowych FMRpolyG agregujących w mózgu pacjentów. Głównym celem pracy doktorskiej była identyfikacja nowych modyfikatorów translacji RAN. W badaniu zidentyfikowano ponad 60 białek wiążących się ze zmutowanym mRNA FMR1 i wśród nich scharakteryzowano czynniki regulujące translację RAN. W szczególności zubożenie niektórych białek, w tym RPS26, RPS25, DHX15, DDX21 i ALYREF, wpłynęło na poziom i agregację FMRpolyG, podkreślając ich rolę w patologii FXPAC. Praca to dostarcza wglądu w mechanizmy FXPAC i identyfikuje nowe modyfikatory translacji RAN, co sugeruje, że skład podjednostki 40S ma kluczowe znaczenie w regulacji tego procesu. Fragile X-premutation-associated conditions (FXPAC) stem from mutations in the FMR1 gene on the X chromosome, which affects the fragile X messenger ribonucleoprotein 1 protein (FMRP) production. Normal FMR1 genes have 25–35 CGG repeats, but expansions to 55–200 repeats cause FXPAC, leading to conditions like fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) and primary ovarian insufficiency (FXPOI). FXPAC pathology involves toxic RNA forming secondary structures, co-transcriptional R loops causing DNA damage, and repeat-associated non-ATG (RAN) translation producing harmful proteins, notably FMRpolyG, which aggregates in the brain. The main aim of PhD thesis was to identify novel RAN translation modifiers. The study identified over 60 proteins binding to mutant FMR1 mRNA, with some regulating RAN translation. Specifically, depletion of certain proteins, including RPS26, RPS25, DHX15, DDX21, and ALYREF, impacted FMRpolyG levels and aggregation, highlighting their role in FXPAC pathology. This research provides insights into FXPAC mechanisms and identifies novel RAN translation modifiers, suggesting the 40S subunit's composition is crucial in CGG-related RAN translation regulation.Item Oddziaływania RNA z białkami MBNL – podstawy strukturalne, potencjalne inhibitory oraz implikacje funkcjonalne(2017) Taylor, Katarzyna; Sobczak, Krzysztof. PromotorBiałka MBNL (Muscleblind-like) należą do czynników regulatorowych wiążących się z RNA oraz zaangażowanych w wiele procesów związanych z jego metabolizmem, w tym regulację alternatywnego splicingu prekursorowych mRNA. Rodzinę białek MBNL stanowią trzy paralogi, których poziom ekspresji różni się znacząco na etapach embrionalnego i postnatalnego rozwoju organizmu. Posiadają one domenę wiążącą RNA, składającą się z czterech palców cynkowych. Wiązanie MBNL do RNA uwarukowane jest rozpoznawaniem konkretnego motywu sekwencyjnego w RNA, a także strukturą II-rzędową RNA, w którą zaangażowany jest rozpoznawany motyw. Niedobór MBNL w komórkach skutkuje zaburzeniem alternatywnego splicingu, co obserwowane jest u osób cierpiących na dystrofię miotoniczną (DM). Dzieje się to na skutek sekwestracji MBNL w jądrze komórkowym przez zmutowany transkrypt. Celem badań opisanych przeze mnie w rozprawie doktorskiej było zarówno określenie strukturalnych podstaw oddziaływania białek MBNL z docelowymi fragmentami RNA jak i poszukiwanie inhibitorów tworzenia patogennych kompleksów MBNL/RNA oraz zbadanie funkcjonalnych następstw ich działania w modelowych komórkach DM. Przeprowadzając szereg analiz zidentyfikowałam zarówno nowe i funkcjonalne regiony regulatorowe dla białek MBNL w pre-mRNA, jak i udowodniłam rozpoznawanie tych samych substratów RNA oraz miejsc wiązania przez trzy paralogi należące do rodziny MBNL. Ponadto, scharakteryzowałam właściwości inhibicyjne potencjalnych związków terapeutycznych jakimi były antysensowne oligonukleotydy oraz związki niskocząsteczkowe, względem toksycznych kompleksów RNA/MBNL tworzących się w komórkach pacjentów cierpiących na DM i zaburzających poprawny metabolizm RNA.Item Określenie funkcjonalnych miejsc oddziaływania białek MBNL z RNA z zastosowaniem oligonukleotydów antysensowych(2018) Cywoniuk, Piotr; Sobczak, Krzysztof. PromotorRodzinę białek Muscleblind-like tworzą trzy paralogi (MBNL1, 2 i 3) będące regulatorami alternatywnego splicingu kluczowymi podczas rozwoju wielu tkanek, głównie mięśni i komórek nerwowych. Białka MBNL mają również związek z patomechanizmem dystrofii miotonicznej (DM), choroby degeneracyjnej mięśni, w której dochodzi do sekwestracji białek MBNL na mRNA zmutowanego genu, co prowadzi do masowej deregulacji alternatywnego splicingu w komórkach pacjentów. W trzech publikacjach składających się na moją rozprawę doktorską przedstawiłem połączenie strategii AON i minigenów hybrydowych, jako wydajnej metody do weryfikacji potencjalnych miejsc wiązania dla MBNL wyłonionych na drodze głębokiego sekwencjonowania RNA. Podejście to umożliwiło też potwierdzenie hipotezy o rozpoznawaniu tych samych fragmentów RNA przez wszystkie paralogi MBNL. Konstrukty bazujące na minigenie hybrydowym zostały także wykorzystane w badaniach nad aranżacją strukturalną RNA miejsc wiązania dla białek MBNL jak i opracowaniu testu dla poszukiwania lub walidowania potencjalnych inhibitorów sekwestracji MBNL w DM. Ponadto, wykazano antagonistyczną rolę białek MBNL1 i SRSF1 w regulacji alternatywnego splicingu. Analiza dystrybucji trzech alternatywnych eksonów w transkryptach genów MBNL wykazała ich zróżnicowane włączanie do mRNA w poszczególnych tkankach na różnych etapach rozwoju oraz zaburzenie tego procesu w mięśniach pacjentów z DM. Z kolei w projekcie wykazującym wpływ organizacji miejsc wiązania w RNA na aktywność regulatorową MBNL dostarczyłem danych o poziomie ekspresji poszczególnych badanych białek MBNL.Item Określenie wpływu nieprawidłowości splicingu mRNA czynnika transkrypcyjnego NFIX na patomechanizm dystrofii miotonicznej oraz opracowanie narzędzia terapii genowej dla tej choroby(2023) Rogalska, Zuzanna; Sobczak, Krzysztof. PromotorDystrofia miotoniczna typu 1 (DM1) jest dziedziczną, dominującą chorobą genetyczną, spowodowaną ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń CTG w genie DMPK. Nadmiernie wydłużone powtórzenia CUG (CUGexp) w zmutowanym mRNA są toksycznym produktem zmutowanego genu. Zmutowany mRNA sekwestruje czynniki splicingowe takie jak MBNL, a następnie w wyniku funkcjonalnego niedoboru tych białek wywołuje globalne zmiany w alternatywnym splicingu w mięśniach szkieletowych, sercu i mózgu, czego efektem są objawy charakterystyczne dla DM1. Nieprawidłowości w alternatywnym splicingu są kluczową molekularną przyczyną rozwoju DM1. Profil alternatywny splicingu wielu genów zaangażowanych w homeostazę mięśni i ich prawidłowe funkcjonowanie jest istotnie zaburzony. Niemniej jednak, molekularne konsekwencje zaburzeń alternatywnego splicingu większości genów są nadal nieznane. Jednym z eksonów zależnych od MBNL, którego efektywność włączenia do mRNA w procesie splicingu jest istotnie podwyższona w mięśniach szkieletowych DM, jest ekson 7 NFIX, genu kodującego czynnik transkrypcyjny niezbędny do prawidłowego rozwoju mięśni. Pierwszym celem niniejszej pracy było lepsze zrozumienie patomechanizmu DM w kontekście zaburzeń splicingowych NFIX poprzez zrozumienie wpływu włączenia eksonu 7 na aktywność transkrypcyjną NFIX. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zastosowano dwa alternatywne podejścia. Pierwszym z nich było stworzenie dwóch stabilnych linii komórkowych z indukowalną nadekspresją izoform NFIX z eksonem 7 i bez eksonu 7 (NFIX+7 lub NFIX-7) w oparciu o komórki HEK z funkcjonalnym nokautem endogennego NFIX (NFIX-KO). Nieoczekiwanie wyniki RNA-seq nie wykazały znaczących różnic w aktywności transkrypcyjnej tych dwóch izoform w stworzonych modelach komórkowych, być może z powodu niewłaściwego dopasowania poziomu ekspresji egzogenów (zbyt wysoki). Drugie podejście opierało się na manipulacji włączania egsonu 7 do endogennie eksprymowanego mRNA NFIX przy użyciu antysensownego oligonukleotydu (AON) nakierowanego na połączenie eksonu 7 z intronem 7. W ludzkich komórkach mięśni szkieletowych, w których dominuje izoforma NFIX+7, zastosowany AON indukował efektywne pomijanie eksonu 7 i produkcję głównie izoformy NFIX-7. Takie podejście umożliwiło wygenerowanie modelu komórkowego w kontekście środowiska, w którym NFIX jest naturalnie zaangażowany w proces prawidłowego rozwoju mięśni, ale także w patogenezę DM1. W tych komórkach ekspresja NFIX jest stosunkowo wysoka i jest regulowana przez natywny promotor. Wyniki eksperymentów RNA-seq ujawniły setki genów, których ekspresja uległa istotnym zmianom po traktowaniu AON, co sugeruje, że obie izoformy splicingowe - NFIX+7 i NFIX-7 - różnią się znacząco aktywnością transkrypcyjną. Analiza ontologii genów (GO) wykazała znaczne wzbogacenie klas genów, które są wrażliwe na te dwie izoformy NFIX, ale także zaobserwowano istotną zmianę ich ekspresji w mięśniach pacjentów z DM1. Wśród 5641 genów, których ekspresja jest znacząco zmieniona w tkankach DM1 (P<0,05) zidentyfikowano 2070 genów, których ekspresja była znacząco zmieniona w komórkach mięśniowych poddanych działaniu AON zmieniającemu splicing NFIX. Głównymi terminami GO wzbogaconymi w obu porównaniach (w pierwszym – geny wrażliwe na poziom NFIX oraz na obecność jego izoform splicingowych, w drugim – geny wrażliwe na izoformy splicingowe NFIX oraz zmienione w tkankach pacjentów DM1) były geny składników strukturalnych macierzy zewnątrzkomórkowej i geny białek wiążących się z kolagenami. Są to geny niezmiernie istotne dla prawidłowej budowy i aktywności mięśni szkieletowych, a zatem zaburzenie splicingu NFIX może stanowić istotny element patogenezy DM1. Podsumowując tę część pracy można stwierdzić, że nieprawidłowa dystrybucja eksonu 7 NFIX spowodowana sekwestracją białek MBNL na RNA ze zmutowanym CUGexp wywołuje liczne zmiany ekspresji genów zachodzących w mięśniach szkieletowych, które to mogą być odpowiedzialne za kształtowanie fenotypu chorobowego obserwowanego u pacjentów z DM1. DM jest chorobą nieuleczalną. Kiedy liczba powtórzeń osiąga wysoki poziom (od setek do tysięcy), występujące objawy kliniczne są cięższe oraz wzrasta wydajność sekwestracji zależnej od długości powtórzeń. Proponowane wcześniej strategie terapeutyczne prowadzące do podwyższenia poziomu MBNL1 za pomocą narzędzi terapii genowej wiążą się z występowaniem wielu niepożądanych konsekwencji. Długotrwała, niekontrolowana nadekspresja MBNL1 u myszy prowadzi bowiem do zmniejszenia masy ciała, zwiększonej śmiertelności i uszkodzenia mięśni, w tym mięśnia sercowego. Terapia genowa prowadząca do podwyższenia poziomu MBNL1 u pacjentów z DM1 wiąże się również z wieloma innymi ograniczeniami. Jednym z nich jest niejednorodność sekwestracji MBNL spowodowana mozaicyzmem somatycznym długości powtórzeń CTG w komórkach tego samego pacjenta oraz pomiędzy różnymi osobami ze zdiagnozowanym DM1. Aby sprostać tym ograniczeniom, zaprojektowałam i wygenerowałam autoregulowany konstrukt do nadekspresji MBNL1, który umożliwia produkcję białka MBNL1 dostosowaną do poziomu aktywnej puli endogennych białek MBNL w komórce. Ta strategia terapeutyczna daje więc możliwość przezwyciężenia ograniczeń wynikających z niejednorodności ekspansji powtórzeń CTG i w konsekwencji różnego stopnia niedoboru MBNL w różnych komórkach czy włóknach mięśniowych. Konstrukt ten zawiera sekwencję kodującą MBNL1 przedzieloną fragmentem pre-mRNA ATP2A1 z alternatywnym eksonem wrażliwym na poziom MBNL, który zawiera kodon stop w ramce odczytu dla MBNL1. Włączenie tego eksonu prowadzi więc do tworzenia nieaktywnej, skróconej formy białka, natomiast jego wyłączenie, następujące przy niedoborze MBNL, powoduje wzrost produkcji w pełni aktywnej formy MBNL1. Takie podejście umożliwia ograniczoną i ściśle kontrolowaną nadekspresję MBNL1, w zależności od stopnia niedoboru białka, a zarazem może odpowiadać na niejednorodność długości powtórzeń CUG. Podsumowując tę część pracy można powiedzieć, że przeprowadzone badania wykazały, że nadekspresja MBNL1 ze stworzonego konstruktu genetycznego podlega autoregulacji i ma potencjał terapeutyczny prowadzący do korygowania nieprawidłowości alternatywnego splicingu, co wykazano dla komórek pochodzących od pacjentów z DM1. Myotonic dystrophy type 1 is a hereditary, autosomal disease caused by expansion of trinucleotide CTG repeats in DMPK gene. Expanded CUG repeats in mutant mRNA is a major toxic product of mutant gene. It sequester MBNL splicing factors and due to functional insufficiency of these proteins trigger global changes in alternative splicing in skeletal muscles, heart and brain, which result in symptoms characteristic for DM1. The abnormalities in alternative splicing are crucial molecular feature of DM1. The alternative splicing of many genes engaged in muscle homeostasis and proper functioning is impaired. Although, the molecular consequence of majority of genes with altered splicing pattern is still unknown. One of the MBNL-dependent exons, which inclusion is significantly higher in skeletal muscles of DM, is exon 7 of NFIX, a gene encoding for transcription factor essential for muscle development. First aim of this study was to better understand the pathomechanism of DM in case of abnormalities in the splicing of NFIX. The examination of whether the contribution of exon 7 has an impact on NFIX transcriptional activity gave a deeper understanding of DM1 pathomechanism which is studied for a long time. To answer this question two alternative approaches were used. First of them was generation of two stable cell lines with inducible overexpression of NFIX isoforms with and without exon 7 (NFIX+7 or NFIX-7) based on a HEK cell with functional knockout of endogenous NFIX (NFIX-KO). Unexpectedly, RNA- seq results did not show significant differences in transcriptional activity of these two isoforms in developed cellular models, perhaps due to not well adjusted level of overexpression of exogenes (too high). The second approach based on manipulation of exon 7 inclusion of endogenous NFIX mRNA using the antisense oligonucleotide (AON) targeting (AON) targeting exon 7/intron 7 boundary. In human skeletal muscle cells, in which NFIX+7 isoform predominates, this AON induces efficient exon 7 skipping and production of NFIX-7 isoform. This approach gave the possibility to generate a model with an cellular environment where NFIX is engaged in the developmental process, but also in DM1 pathogenesis. The expression level of NFIX is relatively high in these cells and is driven by the native promoter. The results of RNA-seq revealed hundreds of genes which expression was significantly changed after AON treatment, suggesting that both splicing isoforms, NFIX+7 and NFIX-7, differ significantly in transcriptional activity. Gene ontology (GO) analysis showed significant enrichment of groups of genes that are sensitive to NFIX isoforms and abnormally expressed in DM1 patients. Among 5641 genes which expression is affected in DM1 (P<0.05), 2070 genes were identified which are also sensitive to treatment with AON modulating splicing pattern of NFIX. The major GO molecular function terms enriched in both comparisons (first: genes sensitive to the level of NFIX and its splicing isoforms; second: genes sensitive to the NFIX splicing isoforms and changed in DM1 tissues) were extracellular matrix structural constituent, and collagen binding. These functions are incredibly important for the proper structure and activity of skeletal muscle, therefore NFIX splicing abnormality may be essential trigger of DM1 pathogenesis. Taken together, these results showed that abnormal distribution of NFIX exon 7 caused by sequestration of MBNL proteins on CUGexp affects a subset of gene expression changes occurring in DM1 skeletal muscles, which may be responsible for the development of disease phenotype observed in DM1 patients. DM is an incurable disease. When the number of repeats reach a higher level clinical symptoms are more severe and the sequestration efficiency, which depends on the size expansion, increase. Previously proposed therapeutic strategies leading to increase of the MBNL1 level via gene therapy tools are associated with many undesirable consequences. Uncontrolled MBNL1 overexpression in mice leads to reduced body weight, increased mortality, or muscle damage, including heart muscle. The gene therapy leading to the increase of MBNL1 level is also associated with many limitations. One of them is heterogeneity in sequestration of MBNLs caused by somatic mosaicism of CTG repeat length in cells of the same patient and between individuals with DM1. To deal with these limitations I designed and generated the autoregulated MBNL1 overexpression construct which enables the production of MBNL1 adjusted to the level of active pool of endogenous MBNLs. It was assumed that this therapeutic strategy gave the possibility to overcome the limitations caused by heterogeneity of CTG repeat expansions and as a consequence different levels of MBNL insufficiency in different cells/myofibers. This construct contains MBNL1-coding sequence separated by the fragment of ATP2A1 pre-mRNA with MBNL-sensitive alternative exon containing in frame stop codon. The inclusion of this exon leads to the arrangement of the inactive form of the protein but its exclusion, occurring during MBNL insufficiency, gives rise in production of fully active MBNL1. This approach enables the restricted expression of MBNL1 protein only if its level in cell is too low and potentially can be controlled by heterogeneity of CUGexp load. It was shown that expression of MBNL1 assembled from this construct is tunable and has therapeutic potential to correct the alternative splicing abnormalities in DM1 patients-derived cells.Item Potranskrypcyjna regulacja ekspresji genu CELF1 - wpływ na patomechanizm dystrofii miotonicznej(2016) Kajdasz, Arkadiusz; Sobczak, Krzysztof. PromotorDystrofia miotoniczna (DM) jest najczęstszą postacią dystrofii mięśniowej wśród osób dorosłych. Toksyczny RNA powstający w tej chorobie zaburza aktywność białek MBNL i CELF w DM typu 1 lub wyłącznie MBNL w DM typu 2. Funkcjami MBNL i CELF1 jest regulacja alternatywnego splicingu. Jedyną ze znanych przyczyn zwiększonego poziomu CELF1 w DM1 jest jego hiperfosforylacja. W pracy doktorskiej zostało wykazane, że w mięśniach DM oraz w tkankach w czasie ontogenezy dochodzi do regulacji alternatywnego splicingu regionów 5’ i 3’UTR CELF1. Zmiany te oraz analiza splicingu eksonów zależnych od CELF1 w mięśniach DM1 i DM2 sugerują, że podwyższona aktywność CELF1 w DM może być skutkiem alternatywnego splicingu 5’UTR CELF1 promującego translację aktywniejszej izoformy CELF1. Poziomy izoform 5’ i 3’UTR CELF1 są zależne od czynników MBNL i CELF. Izoformy 5’UTR CELF1 nie wpływają na wydajność translacji, ale mogą wpływać na jakość powstającego białka. Z mięśniowo-specyficznego eksonu alternatywnego rozpoczyna się synteza dłuższego białka CELF1, które wykazało niższą wydajność w regulacji alternatywnego splicingu. Funkcjonalny niedobór MBNL w DM może sprzyjać potranskrypcyjnym modyfikacją CELF1 promującym powstawanie aktywniejszej izoformy białka CELF1. Opisana potranskrypcyjna regulacja ekspresji genu CELF1 uzupełnia wcześniej poznaną potranslacyjną modyfikację produktu tego genu w DM1 i tłumaczy wzrost aktywności CELF1 w DM2. Wiedza o zmienności regionów UTR mRNA CELF1 może przyczynić się do opracowania i poszerzenia metod terapeutycznych DM ukierunkowanych na obniżenie poziomu i aktywności CELF1.Item Rola elementów regulatorowych cis w zmutowanym mRNA FMR1 zawierającym ekspansję powtórzeń CGG w tworzeniu struktur typu R-loop i regulacji niekanonicznej translacji patogennego białka(2023) Niewiadomska, Daria; Sobczak, Krzysztof. PromotorEkspansja niestabilnych powtórzeń CGG w regionie 5’ niepodlegającym translacji (5’UTR) genu FMR1 w zależności od wielkości ekspansji została powiązana z patogenezą wielu chorób związanych z łamliwym chromosomem X. Celem pierwszej części projektu było ustalenie roli struktur typu R-loop w procesie patogenezy chorób – FXTAS i FXS. Wyniki uzyskane w tej części pracy potwierdziły, że struktury R-loop tworzone w obrębie regionu 5’UTR genu FMR1 w warunkach FXTAS mają negatywny wpływ na transkrypcję FMR1, co może być częściowo osłabione poprzez zastosowanie ASO-CCG. Jednakże w odniesieniu do warunków FXS, zastosowanie ASO-CCG nie prowadziło do reaktywacji transkrypcji FMR1 w komórkach wyprowadzonych od pacjenta FXS, które charakteryzowały się całkowitym wyciszeniem FMR1. Natomiast traktowanie cząsteczkami ASO-CCG komórek pacjenta z FXS, które posiadały częściowo aktywne locus FMR1, prowadziło do wzmożenia transkrypcji FMR1 oraz zwiększenia puli mRNA FMR1 w cytoplazmie, co jednak nie spowodowało zwiększenia poziomu białka FMRP w tych komórkach. Druga część projektu dotyczyła roli elementów regulatorowych cis zlokalizowanych w regionie 5’UTR FMR1 w regulacji translacji toksycznego białka FMRpolyG inicjowanej z kodonów ACG lub GUG. Uzyskane wyniki wykazały, że zarówno kontekst sekwencyjny, jak i stabilna struktura drugorzędowa tworzona w obrębie mRNA FMR1 mają ogromny wpływ na inicjację translacji białka FMRpolyG, co sugeruje, że proces ten może być również regulowany przez wiele czynników trans wiążących się z regionami cis w obrębie sekwencji mRNA FMR1. The expansion of an unstable CGG repeat sequence within the 5’ untranslated region (5’UTR) ofFMR1 has been implicated in the pathogenesis of multiple fragile X-linked syndromes. The first part of the project aimed to establish the role of R-loops in the pathogenesis of FXTAS and FXS disorders. Results obtained in this part confirmed that R-loops forming within FMR1 5’UTR in FXTAS conditions have a negative effect on the FMR1 transcription which can be partially abolished by ASO-CCG. However, according to FXS, ASO-CCG treatment did not reactivate the FMR1 transcription from FXS cells which were characterized by full FMR1 silencing. On the contrary, ASO-CCG treatment of FXS cells which possessed partially active FMR1 locus resulted in the increased transcription rate of FMR1 and its enhanced mRNA pool in the cytoplasm. Nevertheless, elevated FMR1 mRNA level did not translate into increased FMRP level. The second part of the project was concerning the cis-regulatory elements within FMR1 5’UTR and their involvement in the regulation of initiation of toxic FMRpolyG synthesis from near-cognate ACG or GUG start codons. Obtained data showed that both sequence context as well as stable secondary structure within mRNA have enormous effect on the initiation of FMRpolyG translation suggesting that this process is potentially regulated by many cis- and trans-factors targeting various regions/elements within the FMR1 mRNA sequence.Item Udział białek MBNL w metabolizmie RNA(2015-12-08) Sznajder, Łukasz Jakub; Sobczak, Krzysztof. PromotorTrzy paralogi Muscleblind-like (MBNL) są białkami wiążącymi się do RNA, które odgrywają istotną funkcję w regulacji metabolizmu RNA, na przykład w alternatywnym splicingu. Sekwestracja białek MBNL na transkryptach zawierających wydłużone powtórzenia CUG (CUGexp), a co za tym idzie obniżenie ich dostępności w nukleoplazmie, jest przyczyną choroby genetycznej nazwanej dystrofią miotoniczną typu 1 (DM1). Celem niniejszego projektu doktorskiego było lepsze poznanie fizjologicznej funkcji trzech paralogów MBNL oraz ich izoform splicingowych, a także poznanie udziału tych białek w formowaniu patogennych oddziaływań z toksycznymi transkryptami CUGexp. W toku realizacji pracy doktorskiej stworzyłem wysokorozdzielcze mapy oddziaływania paralogów Mbnl z transkryptomem, które zostały zwizualizowane w postaci serwisu internetowego Mbnl Interactome Browser (MIB) dostępnego pod adresem MIB.amu.edu.pl. Następnie, skoncentrowałem się na zaburzeniu alternatywnego splicingu transkryptu genu NASP, kodującego białko o aktywności opiekuńczej histonów, które jest odpowiedzialne za prawidłowy przebieg cyklu komórkowego. Nadmierna reprezentacja izoformy splicingowej tNASP w DM1 może prowadzić do osłabienia potencjału proliferacyjnego komórek, co może być przyczyną upośledzonej regeneracji mięśni. W ostatnich dwóch projektach określiłem czynniki które wpływają na różnice w aktywności paralogów MBNL i ich izoform splicingowych. Przeprowadzone eksperymenty dowodzą, iż wszystkie badane białka regulują splicing tych samych alternatywnych egzonów i z różnym powinowactwem wiążą się do tych samych motywów sekwencyjnych. MBNL1 jest najsilniejszym, a MBNL3 najsłabszym regulatorem alternatywnego splicingu. Wykazałem również, iż jądrowe agregaty (foci) zawierające CUGexp są dynamicznymi strukturami z gęsto upakowanymi białkami MBNL, które zwiększają objętość foci oraz swobodnie wiążą się i oddysocjowują od tego makrokompleksu. Spośród trzech paralogów, MBNL1 jest najbardziej mobilnym, podczas gdy MBNL3 jest raczej statycznym białkiem w tych strukturach jądrowych. Alternatywne sekwencje aminokwasowe występujące w MBNL na skutek alternatywnego splicingu wpływają zarówno na aktywność splicingową, jak i mobilność białek w foci zawierających CUGexp.Item Zależność biogenezy cząsteczki miR-21 od dojrzewania jej prekursorów na poziomie alternatywnego splicingu oraz poliadenylacji(2021) Sekrecki, Michał.; Sobczak, Krzysztof. PromotorCząsteczki mikroRNA (miRNA) są to krótkie (20-22 nukleotydów), niekodujące RNA regulują poziom ekspresji niemal wszystkich genów kodujących białka, na drodze interferencji RNA. Jednym z lepiej poznanych jest miR-21. Pomimo dość dobrze opisanych szlaków w których zaangażowany jest miR-21, nadal słabo poznane są mechanizmy kontrolujące proces jego biogenezy. Alternatywny splicing (AS) oraz alternatywna poliadenylacja (APA) pierwotnych transkryptów są niezwykle ważnymi mechanizmami w regulacji ekspresji większości genów kodujących białka. Na dzień dzisiejszy niewiele prac badawczych skupiało się na udziale tych procesów w regulacji ekspresji genów miRNA. Głównym celem pracy było zbadanie zaangażowania AS oraz APA w proces biogenezy miR-21. Podczas pierwszego etapu badań wykazano, że pierwotny transkrypt pri-miR-21 powstaje niezależnie od pre-mRNA swojego genu-gospodarza VMP1 i może podlegać charakterystycznym dla pre-mRNA VMP1 procesom składania. W pracy, określono dużą zmienność w poziomie ekspresji pri-miR-21 w różnych ludzkich tkankach. Scharakteryzowano rozmaite izoformy pri-miR-21. Dodatkowo poprzez zastosowanie blokera oligonukleotydowego wiążącego się do określonych sekwencji RNA lub poprzez mutację tego miejsca w konstrukcie genetycznym wykazano, że aktywność alternatywnych sygnałów poliadenylacji (APAS) występujących w 3’UTR VMP1, ma wpływ na efektywność biogenezy miR-21. Badania wykazały bezpośredni wpływ PAS zlokalizowanego przed sekwencją kodującą miR-21 na ilość dojrzałej cząsteczki miR-21. W ostatnim etapie pracy postanowiono sprawdzić zależność efektywności biogenezy miR-21 od splicingu pri-miR-21. Poprzez zablokowanie lub mutagenezę miejsca składania RNA zlokalizowanego po stronie 3’ doprowadzono do zaburzenia splicingu pri-miR-21 oraz zaobserwowano istotny wzrost poziomu tej cząsteczki RNA, co przełożyło się na zwiększenie liczby dojrzałych cząsteczek miR-21. Uzyskane wyniki dowodzą, że obecność izoformy z retencją intronu poprzez bezpośredni wpływ na aktywność miejsca 3’ splicingu w 11 intronie VMP1, pozytywnie wpływa na biogenezę miR-21.