Doktoraty (WB)

Permanent URI for this collection

Browse

Recent Submissions

Now showing 1 - 20 of 251
  • Item
    Rola tuneli przejściowych w funkcjonowaniu enzymów z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi
    (2024) Thirunavukarasu, Aravind Selvaram; Brezovsky, Jan. Promotor
    Enzymy z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi mają prowadzące do nich ścieżki, które nazywane są tunelami. Skupiając się na rodzinie enzymów hydrolaz i podkreślając znaczenie wody w tych tunelach, niniejsze badanie zapewnia cenny wgląd w ich funkcjonalne implikacje. Dzięki wykorzystaniu symulacji dynamiki molekularnej i adaptacyjnych technik próbkowania, stany konformacyjne systemów są dokładnie badane. W szczególności obliczenia tuneli prowadzących do miejsca aktywnego są przeprowadzane dla wszystkich ramek obszernej symulacji, co prowadzi do identyfikacji wcześniej nierozpoznanych tuneli. Śledząc ruch cząsteczek wody z objętości do określonego regionu (miejsca aktywnego) białka, określane są ścieżki transportu wykorzystywane przez enzym podczas symulacji. Aby ułatwić analizę ogromnych ilości danych związanych z tunelami i cząsteczkami wody, opracowano moduł Python o nazwie TransportTools. Moduł ten roku usprawnia analizę obszernych danych dotyczących tuneli i cząsteczek wody. Pomaga w ocenie wykorzystania cząsteczek wody, wydajności transportu i funkcjonalności w strukturach białkowych. Narzędzie to odkryło nowe tunele transportujące wodę w enzymach takich jak dehalogenaza haloalkanowa, zwiększając nasze zrozumienie dynamiki tuneli. Ponadto odkryto, że cząsteczki wody mogą skutecznie poruszać się w wąskich regionach tuneli poprzez interakcje wiązań wodorowych. Odkrycia te zostały potwierdzone poprzez porównanie hydrolazy epoksydowej typu dzikiego z jej mutantem E470G, w którym zaobserwowano wzrost wykorzystania alternatywnych tuneli w mutancie. Co więcej, wybór jawnych modeli wody, takich jak OPC, TIP3P i TIP4P-Ew, znacząco wpływa na wykorzystanie tuneli enzymatycznych przez cząsteczki wody. Zaobserwowane różnice między trzema modelami wody można przypisać różnicom w ich właściwościach dyfuzyjnych i rozkładach ładunku. W przypadku modelu TIP3P migracja wody była zauważalnie przyspieszona, transportując około 2,5- i 2,0-krotnie więcej cząsteczek wody niż w przypadku modeli OPC i TIP4P-Ew. Zjawisko to wynika przede wszystkim z zaobserwowanych krótszych czasów przejścia i większej liczby cząsteczek wody jednocześnie migrujących przez tunele przy zastosowaniu modelu TIP3P. Spójność tych wyników dla różnych enzymów, takich jak oksydaza alditolowa i cytochrom P450 2D6, wraz z geometrią tuneli, podkreśla ich szersze znaczenie. Podkreśla to znaczenie modelu wodnego dla dokładnych symulacji enzymów z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich cykli katalitycznych, projektowania enzymów i przewidywania czasów przebywania leków. The enzymes with buried active sites have pathways leading to them which are called tunnels. By focusing on the hydrolase family of enzymes and emphasizing the importance of water within these tunnels, this study provides valuable insights into their functional implications. Through the utilization of molecular dynamics simulations and adaptive sampling techniques, the conformational states of the systems are thoroughly investigated. Notably, the calculation of tunnels leading to the active site is conducted for all frames of the extensive simulation, leading to the identification of previously unrecognized tunnels. By tracking the movement of water molecules from the bulk to the defined region (active site) of the protein, the transport pathways employed by the enzyme during the simulation are determined. To facilitate the analysis of vast amounts of data related to tunnels and water molecules, a Python module called TransportTools is developed. The module streamlines the analysis of extensive tunnel and water molecule data. It aids in assessing water molecule utilization, transport efficiency, and functionality within protein structures. This tool has uncovered new water-transporting tunnels in enzymes like haloalkane dehalogenase, enhancing our understanding of tunnel dynamics. Additionally, it is discovered that water molecules can effectively navigate narrow regions within the tunnels through hydrogen bonding interactions. These findings are validated through a comparison between wild type epoxide hydrolase and its mutant E470G, where an increase in the utilization of alternate tunnels is observed in the mutant. Moreover, the choice of explicit water models such as OPC, TIP3P, and TIP4P-Ew significantly impacts the utilization of enzyme tunnels by water molecules. The observed differences between the three water models can be attributed to variations in their diffusion properties and charge distributions. With TIP3P model, water migration was noticeably accelerated, transporting about 2.5– and 2.0-times more water molecules than with OPC and TIP4P-Ew models, respectively. This phenomenon primarily arises from the observed quicker transit times and more water molecules concurrently migrating through tunnels when employing the TIP3P model. The consistency of these findings across various enzymes, such as alditol oxidase and cytochrome P450 2D6, along with tunnel geometries, highlights their broader relevance. This emphasizes water model importance for accurate simulations of enzymes with buried active sites which are critical for understanding their catalytic cycles, enzyme design, and predictions of drug residence times.
  • Item
    Różnice międzyosobnicze a pasożyty: wpływ zachowania, użytkowania przestrzeni i cech fizycznych żywiciela na liczebność ektopasożytów myszy leśnej (Apodemus flavicollis)
    (2024) Zduniak, Milena; Zwolak, Rafał. Promotor
    Dysertacja porusza temat różnic międzyosobniczych w dzikiej populacji myszy leśnych i ich wpływu na liczebność pasożytów zewnętrznych. Badania wykazały, że samce miały więcej kleszczy niż samice, lecz było to spowodowane różnicami w masie ciała, nie płci żywicieli. Ponadto, związek między eksploracją w otwartym polu, a wskaźnikami użytkowania przestrzeni uzyskanymi z danych z odłowów był bardziej złożony niż zakładały pierwotne przewidywania. Kuracja przeciwpasożytnicza skutecznie zmniejszyła liczebność ektopasożytów, lecz nie wpłynęła na eksplorację zwierząt w otwartym polu. Spośród wskaźników użytkowania przestrzeni tylko prawdopodobieństwo złowienia wzrosło w odpowiedzi na zastosowaną kurację sugerując działanie negatywnego sprzężenia zwrotnego. The dissertation explores the inter-individual traits of a wild population of yellow-necked mice and how they affect ectoparasite infestation. It found that male mice had more ticks than females, but this disparity was due to differences in host body mass rather than sex itself. Moreover, the relationship between exploration in the open field and trapping-derived indices of space use was more complex than initially predicted. The antiparasitic treatment effectively reduced ectoparasite abundance, but it did not affect open field exploration. Among space use indices, only trappability increased in response to the antiparasitic treatment, suggesting the existence of negative feedback.
  • Item
    Poszukiwanie markerów starzenia się niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis
    (2024) Nagwan, Amit Kumar; Kmita, Hanna. Promotor; Kaczmarek, Łukasz. Promotor
    Zakłada się, że starzenie się jest nieuniknione, nieodwracalne i postępujące, ale dostępne dane wskazują, że starzenie się niesporczaków może być opóźnione przez kryptobiozę. Możliwość tę uwzględnia hipoteza Śpiącej Królewny. Weryfikacja tej hipotezy wymaga zastosowania wielopoziomowych markerów starzenia się niesporczaków. Dlatego celem tej pracy doktorskiej było wskazanie potencjalnych markerów starzenia się niesporczaków. Aby osiągnąć ten cel, przeanalizowano dostępne publikacje pod względem możliwych markerów i opracowano odpowiedni model do ich eksperymentalnej walidacji, obejmujący samice i samce niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis w różnym wieku. Wyniki pozwoliły na wskazanie następujących markerów starzenia się niesporczaków: żywotność, średnia liczba złożonych jaj przez samicę, przeżywalność warunków ekstremalnych (tj. anhydrobioza i pole hipomagnetyczne), poziom potencjału błony wewnętrznej mitochondriów (Δψ ) i poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS). Weryfikacja przydatności wymienionych markerów może przyczynić się do wykorzystania niesporczaków także jako organizm modelowy w biologii starzenia. Wraz z weryfikacją hipotezy Śpiącej Królewny może to przyczynić się do opracowania strategii przeciwstarzeniowych i skutecznych rozwiązań dotyczących konserwacji materiałów biologicznych. Niemniej jednak uzyskane wyniki należy poddać dalszej weryfikacji w odniesieniu do innych dwupłciowych gatunków niesporczaków, co pozwoli na lepsze zrozumienie obserwowanych różnic międzypłciowych. It is assumed that aging is inevitable, irreversible, and progressive but available data indicate that tardigrade aging might be delayed by cryptobiosis. The possibility is addressed by the Sleeping Beauty hypothesis. However, the hypothesis verification requires multilevel markers of tardigrade aging. Therefore, the aim of the thesis was to indicate potential tardigrade aging markers. To implement the aim available relevant papers were searched for the putative markers and suitable tardigrade model comprising Paramacrobiotus experimentalis females and males of different age was developed for the markers validation. The results allowed for indication of the following tardigrade aging markers: the vitality rate, average number of laid eggs per female, survival of the extreme conditions (i.e., anhydrobiosis and hypomagnetic field), the level of the mitochondrial inner membrane potential (Δψ) and the level of intracellular reactive oxygen species (ROS). Verification of usability of the mentioned markers could open the opportunity for tardigrades to be also a model organism for aging biology. Together with verification of the Sleeping Beauty hypothesis, this might contribute to developing of anti-aging strategies and efficient approaches for preservation of biological materials. Nevertheless, the obtained results should be further verified for other dioecious tardigrade species which will allow for a better understanding of the observed differences between the sexes.
  • Item
    Symulacje procesów wiązania ligandów w białkach
    (2024) Sarkar, Dheeraj Kumar; Brezovsky, Jan. Promotor
    Procesy biologiczne są wewnętrznie regulowane przez małe cząsteczki i ich interakcje, szczególnie w postaci kompleksów białko-ligand. Transport ligandów w białkach odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w transdukcji sygnału, katalizie enzymów oraz transporcie składników odżywczych i metabolitów. Dlatego zrozumienie procesów wiązania ligandu ma ogromne znaczenie dla opartego na strukturze projektowania leków i inżynierii ulepszonych katalizatorów enzymatycznych. W szczególności znaczna część enzymów ma swoje aktywne miejsce zakopane w głębokich zagłębieniach, a wyzwania polegają na udanym uchwyceniu procesów wiązania i niewiążenia ligandu, ponieważ dostęp do tych wnęk przez małe cząsteczki jest ogólnie ograniczony przez tunele białkowe i bramy. Zmiany w tunelach białkowych często mogą prowadzić do zmiany aktywności, selektywności, rozwiązłości i stabilności. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, w moim doktoracie. w badaniach przyczyniłem się do zbadania właściwości termicznych i kinetycznych poprzez ocenę wykorzystania małych cząsteczek przez tunele transportowe w białkach z zakopanymi aktywnymi miejscami. Zastosowano metody zwiększonej dynamiki molekularnej (MD), aby skutecznie ocenić termodynamikę i kinetykę procesów wiązania ligandu, jednocześnie rozumiejąc leżące u podstaw mechanizmy molekularne. Teza składa się z trzech rękopisów. Pierwsza część pracy koncentruje się na opracowaniu metody poprzez zaprojektowanie opartych na wiedzy schematów siewu w celu skutecznego badania procesów interakcji ligandu w dehalogenazie haloalkanu. Metoda wykorzystuje adaptacyjne symulacje próbkowania do wysokoprzepustowego próbkowania zjawisk wiążących, kierowany przez modele stanu Markowa (MSM) w celu generowania znaczących modeli kinetycznych opisujących stany związane z białkami-ligandem i niezwiązane stany długowieczne oraz ich procesy konwersji. W drugiej części rozprawy masowe wykorzystanie tuneli molekularnych w celu ułatwienia transportu ligandu zostało ocenione i określone ilościowo, aby uzyskać bardziej szczegółowy wgląd w procesy transportu ligandu, pokazując zastosowanie opracowanego przez siebie narzędzia programowego. Wreszcie trzecia część pracy dotyczy dostępności aktywnego miejsca cytochromu c dla zatłoczonych hydrotropów oraz roli ich wiązania ze stabilnością termiczną tego enzymu. Proces badano w dwóch temperaturach obejmujących trzy różne kompozycje hydrotropów, stosując adaptacyjne symulacje próbkowania prowadzone przez modele Markowa. Ujawniono kilka spostrzeżeń na temat roli rozpuszczalników hydrotropowych w zapewnianiu stabilności funkcjonalnym częściom cytochromu c i regulacji dynamiki stanów otwartych i zamkniętych. Ogólnie rzecz biorąc, teza reprezentuje zastosowanie, ocenę, oraz opracowanie wysokoprzepustowego protokołu symulacje wykorzystującego kompleksy białko-ligand do badania procesów wiązania ligandu i jego roli w lepszym zrozumieniu sprzężenia między dynamiką a funkcją enzymów. Biological processes are intrinsically regulated by small molecules and their interactions, particularly in the form of protein-ligand complexes. The transport of ligands in proteins plays a crucial role in many biological processes, including signal transduction, enzyme catalysis and the transport of nutrients and metabolites. Therefore, understanding ligand binding processes is of great importance for the structure-based design of drugs and the engineering of improved enzyme catalysts. Notably, a significant fraction of enzymes have their active site buried in deep cavities, and the challenges lie in successfully capturing the ligand binding and unbinding processes, as access to those cavities by small molecules is generally restricted by protein tunnels and gates. Changes in protein tunnels can often lead to altered activity, selectivity, promiscuity, and stability. To address these shortcomings, in my Ph.D. research, I contributed to investigating thermal and kinetic properties by assessing the utilization of small molecules via transport tunnels in proteins with buried active sites. Enhanced molecular dynamics (MD) methods were applied to effectively assess the thermodynamics and kinetics of ligand binding processes while understanding the underlying molecular mechanisms. The thesis consists of three manuscripts. The first part of the thesis focuses on developing a method by designing knowledge-based seeding schemes to study ligand interaction processes in haloalkane dehalogenase effectively. The method employs adaptive sampling simulations for high-throughput sampling of binding phenomena, guided by Markov State Models (MSMs) to generate meaningful kinetic models describing protein-ligand bound and unbound long-lived states and their interconversion processes. In the second part of the thesis, the massive use of molecular tunnels to facilitate ligand transport was evaluated and quantified to gain more detailed insights into ligand transport processes, showcasing the applicability of the in-house developed software tool. Finally, the third part of the thesis deals with the accessibility of the Cytochrome c active site for crowded hydrotropes and the role of their binding on the thermal stability of this enzyme. The process was studied at two temperatures involving three different compositions of the hydrotropes using adaptive sampling simulations guided by Markov models. Several insights were revealed into the role of hydrotropic solvents in providing stability to functional parts of Cytochrome c and regulating the dynamics of the open and closed states. Overall, this thesis represents the application, evaluation, and development of a high-throughput simulations protocol using protein-ligand complexes to study ligand binding processes and its role in improving the understanding of the coupling between the dynamics and function of enzymes.
  • Item
    Poszukiwanie markerów starzenia się niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis
    (2024) Nagwani, Amit Kumar; Kmita, Hanna. Promotor; Kaczmarek, Łukasz. Promotor
    Zakłada się, że starzenie się jest nieuniknione, nieodwracalne i postępujące, ale dostępne dane wskazują, że starzenie się niesporczaków może być opóźnione przez kryptobiozę. Możliwość tę uwzględnia hipoteza Śpiącej Królewny. Weryfikacja tej hipotezy wymaga zastosowania wielopoziomowych markerów starzenia się niesporczaków. Dlatego celem tej pracy doktorskiej było wskazanie potencjalnych markerów starzenia się niesporczaków. Aby osiągnąć ten cel, przeanalizowano dostępne publikacje pod względem możliwych markerów i opracowano odpowiedni model do ich eksperymentalnej walidacji, obejmujący samice i samce niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis w różnym wieku. Wyniki pozwoliły na wskazanie następujących markerów starzenia się niesporczaków: żywotność, średnia liczba złożonych jaj przez samicę, przeżywalność warunków ekstremalnych (tj. anhydrobioza i pole hipomagnetyczne), poziom potencjału błony wewnętrznej mitochondriów (Δψ ) i poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS). Weryfikacja przydatności wymienionych markerów może przyczynić się do wykorzystania niesporczaków także jako organizm modelowy w biologii starzenia. Wraz z weryfikacją hipotezy Śpiącej Królewny może to przyczynić się do opracowania strategii przeciwstarzeniowych i skutecznych rozwiązań dotyczących konserwacji materiałów biologicznych. Niemniej jednak uzyskane wyniki należy poddać dalszej weryfikacji w odniesieniu do innych dwupłciowych gatunków niesporczaków, co pozwoli na lepsze zrozumienie obserwowanych różnic międzypłciowych. It is assumed that aging is inevitable, irreversible, and progressive but available data indicate that tardigrade aging might be delayed by cryptobiosis. The possibility is addressed by the Sleeping Beauty hypothesis. However, the hypothesis verification requires multilevel markers of tardigrade aging. Therefore, the aim of the thesis was to indicate potential tardigrade aging markers. To implement the aim available relevant papers were searched for the putative markers and suitable tardigrade model comprising Paramacrobiotus experimentalis females and males of different age was developed for the markers validation. The results allowed for indication of the following tardigrade aging markers: the vitality rate, average number of laid eggs per female, survival of the extreme conditions (i.e., anhydrobiosis and hypomagnetic field), the level of the mitochondrial inner membrane potential (Δψ) and the level of intracellular reactive oxygen species (ROS). Verification of usability of the mentioned markers could open the opportunity for tardigrades to be also a model organism for aging biology. Together with verification of the Sleeping Beauty hypothesis, this might contribute to developing of anti-aging strategies and efficient approaches for preservation of biological materials. Nevertheless, the obtained results should be further verified for other dioecious tardigrade species which will allow for a better understanding of the observed differences between the sexes.
  • Item
    Rodzaj Paramacrobiotus(Tardigrada): taksonomia integratywna, biogeografia i oraz wpływ czynników stresowych na wybrane gatunki
    (2023) Kayastha, Pushpalata; Kaczmarek, Łukasz. Promotor; Mioduchowska, Monika. Promotor pomocniczy
    Paramacrobiotus stanowi jeden z rodzajów należących do typu Tardigrada (grupy zwierząt potocznie nazywanej niesporczakami lub misiami wodnymi). Rodzaj ten został utworzony ponad dekadę temu. Poprzednio, przedstawiciele tego rodzaju byli zaliczani do kompleksu richtersi-areolatus wewnątrz rodzaju Macrobiotus, by w końcu, przy pomocy technik analizy molekularnej i filogenetycznej zostać wyodrębnionymi jako nowy rodzaj. Jak sugeruje tytuł, celem niniejszej rozprawy były badania rodzaju Paramacrobiotus, z uwzględnieniem zastosowania taksonomii integratywnej w opisie nowych dla wiedzy gatunków, ustalenie potencjalnych zasięgów występowania gatunków partenogenetycznych oraz sprawdzenie zasadności hipotezy „wszystko jest wszędzie” względem badanych gatunków, zbadanie wpływu czynników stresowych na gatunek Pam. experimentalis, badania nad rozmieszczeniem poszczególnych gatunków, badania mikrobiomu, a także przyjrzenie się historiom życiowym poszczególnych gatunków z uwzględnieniem zdolności do anhydrobiozy. Ponadto sporządzony został nowy klucz diagnostyczny dla rodzaju Paramacrobiotus wykorzystujący cechy morfologiczne i morfometryczne osobników dorosłych i jaj. Wykorzystując techniki taksonomii integratywnej (klasyczna morfologia i morfometria oraz badania genetyczne), nowy gatunek, Pam. gadabouti, został opisany na podstawie materiału pochodzącego z Ribeiro Frio na Maderze. Ponadto, eksperymentalnie zbadano sposób rozmnażania się tego gatunku, co potwierdziło wzajemne powiązania między szerokim rozprzestrzenieniem a partenogenezą. W kolejnej pracy przeanalizowano rozmieszczenie oraz zróżnicowanie genetyczne dwóch partenogenetycznych gatunków z rodzaju Paramacrobiotus, tj. Pam. gadabouti oraz Pam. fairbanksi potwierdzając prawdziwość hipotezy „wszystko jest wszędzie” przynajmniej dla niektórych gatunków niesporczaków. Modelowanie niszy środowiskowych wykonane przy użyciu narzędzia MaxEnt, potwierdza szeroki zasięg obydwu partenogenetycznych gatunków. W kolejnej publikacji zbadano przeżywalność niesporczaków z gatunku Pam. experimentalis, wystawianych na działanie różnych stężeń (0,25%; 0,50% oraz 1,00%) nadchloranu magnezu (uwzględniając stężenia zaobserwowane w marsjańskim regolicie) w dwóch różnych przedziałach czasowych (24h i 72h). W próbach, w których osobniki zostały poddane 24-godzinnej ekspozycji, kolejno 33,3%; 16,7% oraz 0% osobników pozostało aktywnych w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00%. Jednakże, ponad 75% z nich powróciło do stanu aktywnego po przeniesieniu ich do medium hodowlanego (93,3%; 76,7% oraz 86,7% osobników w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00%). W próbach, w których osobniki zostały poddane 72-godzinnej ekspozycji, kolejno 30,0%; 26,7% oraz 0% osobników pozostało aktywnych w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00%. Po przeniesieniu ich do medium hodowlanego kolejno 83,3%; 86,7% oraz 10,0% osobników w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00% powróciło do stanu aktywnego. W następnej pracy zbadano zmiany w ultrastrukturze komórek spichrzowych zarówno u aktywnych osobników, jak i u osobników w anhydrobiozie. Zbadano też poziom syntezy białek szoku cieplnego (Hsp27, Hsp60 oraz Hsp70) u aktywnych osobników Pam. experimentalis wystawionych na podwyższoną temperaturę (35 °C, 37 °C, 40 °C i 42 °C) przez pięć godzin, w porównaniu do optymalnej temperatury hodowlanej (20 °C). Pojedyncze komórki spichrzowe z grupy kontrolnej, znajdowały się w jamie ciała, pośród narządów wewnętrznych, przyjmując kuliste i ameboidalne kształty. Niewielkie, choć zauważalne zmiany w mitochondriach zostały zaobserwowane u osobników aktywnych wystawionych na temperaturę 35 °C. Znaczące zmiany w ultrastrukturze komórek spichrzowych zaobserwowane zostały u osobników poddanych temperaturze 37 °C. Zaobserwowano u nich liczne, uszkodzone mitochondria z zauważalnym zanikiem grzebieni oraz pojawieniem się struktur autofagicznych. Jeszcze więcej zmian zaobserwowano w temperaturze 40 °C, objawiających się nieregularnym kształtem komórek spichrzowych, uszkodzeniami organelli komórkowych oraz zwiększoną obecnością ciał autofagicznych i autolizosomów w mitochondriach. Jednakże najbardziej drastyczne zmiany zaobserwowano w 42 °C, gdzie nastąpiła pełna degradacja komórek i organelli, wskazująca na wystąpienie martwicy, do poziomu utrudniającego rozpoznanie komórek. Jednocześnie, osobniki w anhydrobiozie, poddane działaniu podwyższonej temperatury, nie wykazywały jakichkolwiek negatywnych zmian w komórkach spichrzowych na poziomie ultrastrukturalnym. Spośród pięciu zastosowanych w badaniu temperatur, trzy uznane za najważniejsze zostały wybrane (20 °C – optymalna temperatura do hodowli, 35 °C – najwyższa temperatura, po której nastąpił powrót osobników do aktywności oraz 42 °C – gdzie zaobserwowana została pełna martwica) i wykorzystane do określenia poziomów białek szoku cieplnego (Hsp27, Hsp60 oraz Hsp70) w aktywnych osobnikach. Wszystkie próbki wskazywały na wyraźny wzrost poziomu ekspresji białek wraz ze wzrostem temperatury. W ostatniej pracy składającej się na rozprawę doktorską zebrano całkowitą dostępną wiedzę na temat rodzaju Paramacrobiotus. Podsumowując więc, do rodzaju Paramacrobiotus należy obecnie 45 gatunków (wliczając w to Pam. gadabouti dodany w ramach niniejszej pracy), które można znaleźć na całym świecie, popierając tezę, że rodzaj ten jest kosmopolityczny. W rodzaju występują zarówno partenogenetyczne, jak i obupłciowe gatunki, wykazujące zarówno krótką jak i długą długość życia. Gatunki w tym rodzaju mogą być wszystkożerne (jednak z przewagą drapieżników), a odżywiają się między innymi, cyjanobakteriami, algami, grzybami, wrotkami, nicieniami oraz niesporczakami. Gatunki z tego rodzaju charakteryzują się dość dobrą zdolnością do kryptobiozy, dzięki czemu często stanowią obiekt badań w pracach nad anhydrobiozą. Paramacrobiotus is one of the genera of the phylum Tardigrada (commonly referred as water bears). This genus was erected more than a decade ago. Previously all representatives of this genus were included in the richtersi-areolatus complex within the genus Macrobiotus, but with the help of molecular and phylogenetic analysis, this new genus was identified and established. As the title of thesis suggests, the goal of this dissertation was the overall study of the genus Paramacrobiotus, including: incorporating integrative taxonomy in new species descriptions, working out the distribution patterns of parthenogenetic Pramacrobiotus species, testing if the ‘everything is everywhere’ hypothesis is true for them, testing the influence of different types of stressors on the species Pam. experimentalis, assessing biogeography, distribution, microbiome, reproduction, feeding behaviour, life history, Wolbachia endosymbiont identification and cryptobiotic abilities of the species from the genus Pramacrobiotus and providing a new diagnostic key for the genus using morphological and morphometric characters of adults and eggs. Using an integrative taxonomy approach (classical morphology and morphometry, as well as, genotypic using DNA barcodes and phylogenetic tree), a new species: Pam. gadabouti was described from a moss sample collected in Ribeiro Frio, Madeira. Furthermore, the mode of reproduction of this species was studied experimentally, which corroborates the interrelatedness between wide distribution and parthenogenesis. In the subsequent paper constituting the doctoral dissertation, two parthenogenetic species of the Paramacrobiotus, i.e., Pam. gadabouti and Pam. fairbanksi were analysed to study the distribution, as well as genetic variability which showed that the ‘everything is everywhere’ hypothesis is true for, at least, some tardigrade species. Environmental niche modelling performed using MaxEnt supports the wide distribution of these two parthenogenetic species. In the next publication, survivability of the Pam. experimentalis was tested at various concentrations (0.25%, 0.50% and 1.00%) of magnesium perchlorates (in range with the concentration present in Martian regolith) for two different time points (24h and 72h). In experiments where specimens were exposed to 24h time period, 33.3%, 16.7% and 0% were active in 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively. However, more than 75% returned to activity after transferring them to the culture medium (93.3%, 76.7% and 86.7% of specimens exposed to 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively). In experiments where specimens were exposed to 72h time period, 30.0%, 26.7% and 0% were active in 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively and after transferring them to the culture medium, 83.3%, 86.7% and 10.0% of specimens exposed to 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively, returned to activity. In the following paper constituting the doctoral dissertation, changes in ultrastructure for both active animals and desiccated tuns, as well as levels of heat shock proteins (Hsp27, Hsp60 and Hsp70) in active animals of Pam. experimentalis were studied when exposed at higher temperatures (35 °C, 37 °C, 40 °C, and 42 °C) for 5 hours, compared to optimal temperature (20 °C). Isolated storage cells from the control group persisted in the body cavity among internal organs in an amoeboid or spherical shape. Small, but visible changes were observed in specimens exposed to 35°C in the form of alterations in the mitochondria. Significant ultrastructural changes were observed in storage cells of specimens exposed to 37 °C. There were multiple deteriorating mitochondria with the loss of its cristae and there was a presence of autophagic structures. The level of changes increased at 40°C, with the irregular and shrunken shape of storage cells, deteriorated cell organelles and mitochondria with a higher number of autophagosomes and autolysosomes. Most drastic changes were observed at 42 °C, with full degeneration of cells and organelles showing signs of necrosis, making even cell identification difficult. However, when exposed to higher temperatures, tuns exhibited absolutely no differences from the control group. Out of five temperatures tested, the three deemed most important were selected (20 °C – optimum temperature, 35 °C – the highest temperature from which the return to activity was observed and 42 °C – where full necrosis was observed) and used for quantification of heat shock proteins (Hsp27, Hsp60 and Hsp70) in active specimens. All of them showed significant upregulation with the increase of the temperature. In the last paper, all available information on the genus Paramacrobiotus were summarized. Thus, in summary, the genus Paramacrobiotus currently includes 45 species (including Pam. gadabouti added as a part of the present thesis). The species of this genus can be found everywhere throughout the globe, supporting the statement that the genus is cosmopolitan. Both dioecious and unisexual species are present in the genus, with both long and short lifespan. The species in this genus are generally carnivorous with their food preference, including certain rotifers, nematodes and juvenile tardigrades. However, it was reported that they could also feed on cyanobacteria, algae, and fungi. The species generally have a good affinity for cryptobiosis, which is why multiple studies involving anhydrobiosis have been performed to date using specimens of various species of the Paramacrobiotus.
  • Item
    Alokacja zasobów rośliny wieloletniej Ophioglossum vulgatum L. (Psilotopsida) w zróżnicowanych warunkach środowiska
    (2023) Jędrzejczak, Natalia; Celka, Zbigniew. Promotor
    Teoria alokacji zasobów ukazuje jak osobniki pod wpływem ograniczeń i kompromisów dysponują ograniczoną ilością energii i czasu na procesy życiowe. Praca doktorska jest eksperymentalną próbą sprawdzenia, jak kształtuje się alokacja zasobów u paproci (Ophioglossum vulgatum) pod wpływem czynników abiotycznych (warunki glebowe i świetlne) oraz biotycznych (wpływ konkurentów i roślinożerców) i jak czynniki te wpływają na rozkład zasobów na dwa istotne procesy, tj. wzrost części asymilacyjnej i rozmnażanie za pomocą zarodników. W ramach eksperymentu założono powierzchnię badawczą w kompleksie łąk i torfowisk w okolicach Gniezna, na której wykonywano zabiegi z udziałem ramet nasięźrzała (ucinane ramet bez koszenia roślin towarzyszących, koszenie roślin towarzyszących bez ucinania ramet, brak koszenia i ucinania, koszenie i ucinanie wszystkich). Wykonano także badania glebowe, warunków świetlnych oraz 7 parametrów biometrycznych nasięźrzała. Stwierdzono liczne zależności, m.in. pomiędzy wilgotnością, światłem i presją roślinożerców (imitowaną zabiegami ucinania ramet), a wielkością blaszki liściowej i liczbą zarodni; występowaniem dominujących bylin (m.in. Carex acutiformis, Cirsium arvense i Phalaris arundinacea), a parametrami części trofofilowej lub sporofilowej nasięźrzała. Wykonane badania dostarczyły ważnych wyników do poznania ekologii ginącego gatunku ukazując kondycję jego populacji w zmieniających się warunkach środowiska. The resource allocation theory indicates how individuals allocate the limited energy and time resources into life processes under the influence of limitations and compromises. The PhD thesis is an experimental attempt to determine how the available resources are allocated in a fern (Ophioglossum vulgatum) under the influence of abiotic factors (soil and light conditions) as well as biotic ones (impact of plant competitors and herbivores) and how these factors affect resource allocation between 2 key processes, i.e. growth of the photosynthetic part and reproduction by means of spores. The experiment was conducted in 10 transects located in a complex of meadows and peatlands near Gniezno (NW Poland). Effects of 4 treatments were compared: (1) cutting the fern ramets without cutting the accompanying plants; (2) cutting the accompanying plants without cutting the ramets; (3) no cutting; and (4) cutting of all plants. The study included also measurements of soil parameters, light conditions, and 7 biometric parameters of the fern. Many correlations were detected, e.g. between soil moisture content, light intensity, or grazing by herbivores (simulated by cutting the ramets) and leaf blade size or number of sporangia; and between the presence of dominant perennials (e.g. Carex acutiformis, Cirsium arvense or Phalaris arundinacea) and parameters of the trophophore or sporophore. The research has provided important results, enriching our knowledge of ecology of a threatened species, showing its condition in varied environmental conditions.
  • Item
    Przystosowania metaboliczne Phytophthora infestans (Mont.) de Bary do stresu nitro-oksydacyjnego
    (2023) Gajewska, Joanna; Arasimowicz-Jelon, Magdalena. Promotor
    Celem badań była charakterystyka zmian metabolicznych u patogenicznego lęgniowca Phytophthora infestans w odpowiedzi na stres nitro-oksydacyjny indukowany podczas interakcji z mikrośrodowiskiem rośliny-gospodarza i niezależnie środowiskiem wzbogaconym w metal ciężki. Badania prowadzono na dwóch izolatach tj., awirulentnym i wirulentnym względem odmiany ziemniaka Sarpo Mira. W celu indukcji stresu nitro-oksydacyjnego patogen rósł w obecności jonów kadmu (Cd) a aby zaindukować stres nitrozacyjny patogen rósł w obecności donorów reaktywnych form azotu (RFA). Analizy w pierwszym etapie wykazały, że Cd hamował wzrost vr P. infestans, co było skorelowane ze wzmożonym generowaniem reaktywnych form tlenu (RFT) i RFA w strukturach patogena oraz zmianami w puli nitro-oksydacyjnych modyfikacji kwasów nukleinowych i białek. Ponadto dysmutaza ponadtlenkowa i katalaza były zaangażowane w unieczynnianie RFT, a indukowane Cd zmiany nitro-oksydacyjne skutkowały wzrostem patogeniczności vr P. infestans. W kolejnym etapie wykazano, że P. infestans ma wysoki próg tolerancji względem RFA oraz po raz pierwszy u lęgniowców wykazano, że RFA podlegają detoksykacji z udziałem systemu antynitrozacyjnego, obejmującego dioksygenazę tlenku azotu, peroksyredoksynę 2 i reduktazę S-nitrozoglutationu. Wyniki wskazują na wysoką plastyczność P. infestans i przystosowanie metaboliczne do bytowania w niesprzyjających warunkach nitro-oksydacyjnych. Indukcja systemów antyoksydacyjnych i antynitrozacyjnych, umożliwia patogenowi przetrwanie w otoczeniu wzbogaconym w Cd oraz w mikrośrodowisku rośliny-gospodarza. The aim of the study was to characterize metabolic changes in the pathogenic oomycete Phytophthora infestans in response to the nitro-oxidative stress induced during the interaction with the host plant microenvironment and independently with the heavy metal enriched environment. Experiments were conducted on two isolates i.e. avirulent and virulent in relation to the potato cv Sarpo Mira. To induce the nitro-oxidative stress the pathogen grew in the presence of cadmium (Cd), while to induce nitrosative stress the pathogen grew in the presence of reactive nitrogen species (RNS) donors. The first stage of the study showed that Cd inhibited P. infestans growth what was correlated with enhanced generation of RNS and reactive oxygen species (ROS) in the pathogen structures, as well as changes in the pool of nitro-oxidative modification of nucleic acids and proteins. Moreover, sodium dismutase and catalase were involved in ROS detoxification and Cd-dependent nitro-oxidative changes resulted in increased vr P. infestans pathogenicity. The next part of the study showed that P. infestans has high tolerance threshold to RNS and for the first time in oomycetes it was documented that RNS are deactivated by an anti-nitrosative system including nitric oxide dioxygenase, peroxiredoxin 2 and S-nitrosoglutathione reductase. The obtained results show high plasticity of P. infestans and metabolic adjustment to survive under adverse nitro-oxidative conditions. The induction of anti-oxidative and anti-nitrosative systems allows the pathogen to survive in an environment enriched with Cd and in the host plant microenvironment.
  • Item
    Filogenetyczne i funkcjonalne analizy genów kodujących czynniki transkrypcyjne SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE u wątrobowca Marchantia polymorpha
    (2023) Alisha, Alisha; Szweykowska-Kulińska, Zofia. Promotor
    Czynniki transkrypcyjne z rodziny SPL, SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE, stanowią zróżnicowaną funkcjonalnie grupę białek, które kontrolują szereg podstawowych aspektów wzrostu i rozwoju roślin. Ponieważ geny SPL są specyficzne dla roślin, stąd konieczne jest zrozumienie ich funkcji wśród przedstawicieli żyjących linii roślin lądowych, aby zrozumieć ich ewolucję. W pierwszej części mojej pracy doktorskiej zajęłam się analizą filogenetyczną w celu zbadania relacji między członkami rodziny SPL przedstawicieli wszystkich linii mszaków: dwóch gatunków glewików, Anthoceros agrestis i A. punctatus, wątrobowca Marchantia polymorpha i mchu Physcomitrium patens, oraz rośliny okrytozałążkowej Arabidopsis thaliana. Na podstawie analizy filogenetycznej, białka SPL sklasyfikowano w czterech grupach filogenetycznych. Zaobserwowałam ponadto, że członkowie rodziny SPL w tej samej grupie posiadają podobne struktury genów i podobny zestaw domen białkowych, co może potencjalnie wskazywać na pełnienie podobnych funkcji. Przeprowadzone badania wykazały, że podobnie jak M. polymorpha, przedstawiciele glewików również posiadają \ tylko czterech członków w rodzinie SPL, co stanowi najprostszy zestaw genów SPL wśród roślin lądowych. W drugiej części mojej pracy doktorskiej wykorzystałam szereg narzędzi molekularnych w celu określenia funkcji genów MpSPL3 i MpSPL4 z modelowego gatunku wątrobowca, M. polymorpha. Analiza aktywności transkrypcyjnej promotorów in planta badanych genów przy użyciu genu reporterowego β-glukuronidazy w połączeniu z analizą RT-qPCR wykazała, że oba geny ulegają ekspresji zarówno podczas wegetatywnej jak i reprodukcyjnej fazy cyklu życiowego M. polymorpha. Następnie, w celu uzyskania roślin z wyłączoną funkcją genu MpSPL3 lub MpSPL4 zastosowano podejście CRISPR/Cas9. Otrzymane mutanty ∆Mpspl3ge charakteryzowały się zredukowaną wielkością i kształtem plech oraz opóźnionym wzrostem w porównaniu do roślin typu dzikiego. Co ciekawe, mutanty ∆Mpspl4ge wykazały jeszcze silniejszy fenotyp niż rośliny ∆Mpspl3ge, gdyż rośliny te rosły jako masy komórkowe bez charakterystycznej dla Marchantia budowy plechy. Ponieważ w przypadku obu genów MpSPL utrata ich funkcji spowodowało bardzo silne zaburzenie rozwoju wątrobowca, w kolejnym podejściu zastosowałam sztuczne mikroRNA w celu otrzymania roślin z obniżoną ekspresją badanych genów. W przypadku obu genów, mutanty otrzymane za pomocą sztucznego mikroRNA wykazały opóźnienie wzrostu podczas wegetatywnej fazy cyklu. Co więcej, wytwarzanie gametangioforów zostało całkowicie zablokowane w przypadku silnie obniżonej ekspresji genu MpSPL3, podczas gdy obniżenie ekspresji MpSPL4 spowodował opóźnioną produkcję archegonioforów o zmienionej morfologii w porównaniu do roślin typu dzikiego. Dlatego właściwy poziom ekspresji genów MpSPL3 i MpSPL4 jest niezbędny dla rozwoju organów rozmnażania płciowego. W celu sprawdzenie efektu nadprodukcji białek MpSPL3 i MpSPL4 na rozwój M. polymorpha, przygotowałam rośliny transgeniczne z nadekspresją obu genów. Wstępna analiza roślin z nadekspresją genu MpSPL3 nie wykazała zmian w ich fenotypie podczas wegetatywnej fazy wzrostu w porównaniu do roślin typu dzikiego. Z kolei nadekspresja genu MpSPL4 spowodowała zmiany w morfologii plech, które były mniejsze i węższe w porównaniu do roślin typu dzikiego oraz wytwarzały powiększone miseczkowate zbiorniki produkujące wegetatywne rozmnóżki. Podsumowując, przedstawione wyniki dają znaczący wgląd w podstawowe funkcje genów MpSPL3 i MpSPL4 z rodziny czynników transkrypcyjnych SPL u wątrobowca M. polymorpha, które są kluczowymi faktorami kontrolującymi prawidłowy wzrost i rozwój wegetatywnych plech, jak i struktur rozmnażania płciowego u tego wątrobowca. The SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) family of transcription factors is functionally diverse in controlling a number of fundamental aspects of plant growth and development. Since the SPL genes exist amongst plants only, hence, it is imperative to understand their functions amongst basal lineages of land plants, to gain understanding of their evolution. The first part of my thesis presents the phylogenetic relationships between SPL family members from representatives of all lineages of bryophytes: two hornworts, Anthoceros agrestis and A. punctatus, liverwort Marchantia polymorpha, and moss Physcomitrium patens, and angiosperms representatives, Arabidopsis thaliana. The phylogenetic analysis classified SPL proteins in four phylogenetic groups. We found that the SPL family members within the same group share similar gene structures and protein domains which might hint towards the possible overlap in their putative functions. Moreover, there were no SPL genes identified in the hornwort lineage when we started our analysis and our results established that a minimal set of SPL genes is present in hornworts of Anthoceros lineage, which is similar to liverwort, M. polymorpha. In the second part of presented thesis several molecular genetic tools were applied to characterize the function of MpSPL3 and MpSPL4 genes from model liverwort species, M polymorpha. First, combining in planta promoter activity using GUS reporter gene together with RT-qPCR analysis we have shown that both MpSPL3 and MpSPL4 genes are ubiquitously expressed during the vegetative as well as reproductive phases of Marchantia’s life cycle. Next, to obtain knockout plants for each gene, CRISPR/Cas9 approach was used. The obtained two loss-of-function MpSPL3 plants displayed reduced thalli with delayed growth in comparison to wild-type plants. On the other hand, MpSPL4 loss-of-function plants displayed more severe phenotype resembling a prothallus-like stage with no production of gemma cups. As in the case of both genes’ loss-of-function mutations caused very strong effect on Marchantia development, we applied artificial miRNA approach to knockdown the expression of MpSPL3 and MpSPL4 genes. The obtained knockdown plants for both genes displayed growth retardation during their vegetative growth. Moreover, gametangiophores production was completely abolished in Mpspl3-kd lines, while Mpspl4-kd plants exhibited delayed archegoniophores production which additionally showed morphological distortions. Therefore, proper level of MpSPL3 and MpSPL4 genes expression is also indispensable for Marchantia sexual organs development. In third approach, we have prepared overexpression lines of both genes to study how the MpSPL3 and MpSPL4 protein excess will influence Marchantia development. The preliminary phenotypic analysis for gain-of-function MpSPL3 transgenic plants displayed no significant changes in phenotype during vegetative stage of growth as compared to wild-type plants. On the other hand, the plants overexpressing MpSPL4 protein displayed smaller and narrower thalli with bigger gemma cups in comparison to wild-type plants. Taken together, the presented results provide significant insights into the basic functions of MpSPL3 and MpSPL4 genes from the SPL TF family from liverwort M. polymorpha, which are crucial players in controlling proper growth and development of both vegetative thallus and reproductive organs.
  • Item
    Zależna od FUS obróbka snoRNA do sdRNA i regulacja modyfikacji potranskrypcyjnych rybosomowego RNA - powiązania ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS)
    (2023) Gawade, Kishor; Raczyńska, Katarzyna Dorota. Promotor
    FUS jest białkiem wiążącym DNA/RNA, zaangażowanym w wiele etapów metabolizmu RNA. Mutacje w obrębie sygnału lokalizacji jądrowej (NLS, ang. nuclear localization signal) białka powodują błędną lokalizację FUS w cytoplazmie i w konsekwencji tworzenie agregatów cytoplazmatycznych, co jest powiązane z chorobą neurodegeneracyjną stwardnienie zanikowe boczne, ALS (ang. amyotrophic lateral sclerosis). Małe jąderkowe RNA (snoRNA) to rodzina małych niekodujących RNA, które są zaangażowane w 2'-O-metylację (2'-O-Me) i pseudourydylację rybosomowego RNA (rRNA) i małych jądrowych RNA (snRNA). Te modyfikacje epitranskryptomiczne zapewniają stabilność i zachowanie wiernej struktury rybosomów. Co ciekawe, wbrew wcześniejszemu przekonaniu, około dwie trzecie miejsc w rRNA jest zmodyfikowanych częściowo; zapewnia to dodatkowy poziom generowania heterogeniczności rybosomów.Oprócz funkcji w nadawaniu modyfikacji rRNA i U snRNA, snoRNA klasy C/D i H/ACA mogą być procesowane do mniejszych, stabilnych fragmentów, zwanych sdRNA (ang. snoRNA-derived RNAs, RNA pochodzące ze snoRNA). Cząsteczki sdRNA mogą działać jako mikroRNA i regulować ekspresję genów na poziomie transkrypcji i translacji. Co istotne, rola FUS w biogenezie mikroRNA jest znana i dobrze udokumentowana, nie ma natomiast danych na temat udziału białka FUS w regulacji ekspresji snoRNA i ich dalszej obróbce do sdRNA. W niniejszej pracy, z zastosowaniem technik wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, wykazano, że FUS reguluje poziom snoRNA w komórkach linii ludzkiej neuroblastomy SH-SY5Y. Następnie, ponieważ snoRNA biorą udział w potranskrypcyjnych modyfikacjach rRNA i snRNA, wykorzystano ilościowe techniki oparte na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS, ang. next generation sequencing) typu RiboMeth-seq i HydraPsiSeq, do mapowania zmian w poziomach 2'-O-Me i pseudourydyny, w komórkach typu dzikiego i komórkach pozbawionych białka FUS. W wielu miejscach 2’-O-Me w rybosomowych RNA, które były zmodyfikowane częściowo, obserwowano wzrost poziomu modyfikacji w komórkach pozbawionych FUS. Równocześnie podwyższonej ekspresji ulegała też grupa snoRNA klasy C/D, biorąca udział we wprowadzaniu tych modyfikacji. Ponadto, zaobserwowano drobne zmiany w poziomie pseudourydylacji w komórkach pozbawionych FUS, które również wykazywały tendencję wzrostową, podobnie jak zmiany w ekspresji odpowiedzialnych za te modyfikacje snoRNA klasy H/ACA. W kolejnych analizach, w których wykorzystano komórki SH-SY5Y niosące mutację FUS R495X związaną z ALS, prowadzącą do syntezy białka pozbawionego sygnału NLS, również obserwowano znaczące zmiany w poziomach snoRNA oraz 2’-O-Me i pseudourydyny, w porównaniu z kontrolą typu dzikiego. W badaniach wykorzystano również fibroblasty pochodzące od pacjentów z ALS z mutacjami FUS oraz, jako kontrole, fibroblasty pochodzące od dopasowanych wiekiem i płcią osób zdrowych. Zgodnie z oczekiwaniami, w fibroblastach pochodzących od osób z „silną” mutacją FUS P525L, zaobserwowano największą liczbę znacząco zmienionych miejsc 2’-O-Me, podczas gdy w fibroblastach pochodzących od osób z „łagodnymi” mutacjami FUS R521C i R521L, zmienionych miejsc było mniej. Wyniki te uzupełniono danymi dotyczącymi 2’-O-Me z izogenicznej pary indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z mutacją FUS P525L, różnicowanych następnie do neuronalnych komórek progenitorowych i neuronów ruchowych. Co ciekawe, większość miejsc ze zmienionym profilem 2’-O-Me i pseudourydylacji położona jest w zewnętrznych partiach rybosomu 80S, sugerując, że te częściowo zmodyfikowane miejsca, w zależności od poziomu ich modyfikacji, mogą wpływać na oddziaływania z białkami rybosomalnymi i z innymi czynnikami. Jak wspomniano wyżej, analiza danych pochodzących z sekwencjonowania małych cząsteczek RNA wykazała, że wiele cząsteczek snoRNA ulega zróżnicowanej ekspresji w komórkach SH-SY5Y z wyciszeniem białka FUS. Ponadto, zidentyfikowano liczną grupę sdRNA powstających ze snoRNA klasy C/D i H/ACA. Wiele sdRNA pochodzących ze snoRNA klasy C/D zawierało zakonserwowane motywy „C” lub „D”. Co więcej, z jednego snoRNA mogły powstawać różne sdRNA, wykazujące różne poziomy ekspresji. Profil sdRNA był inny w przypadku proliferujących i zróżnicowanych komórek SH-SY5Y, co sugeruje, że zewnętrzne sygnały, takie jak traktowanie kwasem retinowym, mogą również wpływać na produkcję sdRNA ze snoRNA. Wyniki te wskazują, że białko FUS wpływa na ekspresję snoRNA i modyfikację rybosomalnego RNA. Co więcej, snoRNA są procesowane do sdRNA w sposób zależny od FUS. Jednakże, funkcja tych sdRNA pozostaje wciąż niezbadana. Konieczne są dalsze badania funkcjonalne, aby określić wpływ poszczególnych miejsc modyfikacji rRNA na translację i wpływ mutacji FUS związanej z ALS na ten proces. FUS is a DNA/RNA binding protein involved in many aspects of RNA metabolism. Moreover, mutations within the nuclear localization signal (NLS) of FUS result in the mislocalization of this protein into the cytoplasm, resulting in the formation of cytoplasmic aggregates, and it is associated with amyotrophic lateral sclerosis, a neurodegenerative disease. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) are a family of small non-coding RNAs that guide site-specific 2’-O-methylation (2'-O-Me) and pseudouridylation of ribosomal RNAs (rRNAs) and small nuclear RNAs (snRNAs). These epitranscriptomic modifications provide stability and maintain the structural fidelity of the ribosomes. Additionally, contrary to the previous belief, about two-thirds of these sites on the rRNA are fractionally modified; this provides another layer of generating ribosomal heterogeneity. Not limited to only guiding rRNA and snRNA modifications, both C/D and H/ACA box types of snoRNAs can be processed into smaller, stable fragments called sdRNAs (snoRNA-derived RNAs). These sdRNAs may function as microRNAs and regulate gene expression at transcriptional and translational levels. Moreover, the role of FUS in the biogenesis of microRNAs is known and well documented, but its role in regulating snoRNA expression and processing into sdRNAs is not explored. In this work, using high-throughput sequencing, it was identified that FUS regulates snoRNAs in SH-SY5Y (neuroblastoma) cells. Since snoRNAs are involved in guiding rRNA and snRNA modifications, quantitative, next-generation sequencing (NGS)-based techniques, RiboMeth-seq and HydraPsiSeq were used to map changes in 2’-O-Me and pseudouridine levels in wild-type and FUS-depleted cells (FUS KO). Many fractionally modified 2’-O-Me sites on ribosomal RNAs showed a higher proportion of modification in FUS-depleted cells, and a subset of guide C/D box snoRNAs were also upregulated. Furthermore, pseudouridine changes in the FUS-depleted cells were subtle, but an overall increase in the modification of rRNAs was noticeable, along with changes in guide H/ACA box snoRNAs. Next, SH-SY5Y cells carrying ALS-associated FUS R495X mutation that lack an NLS also displayed significant changes in snoRNAs and 2’-O-Me and pseudouridine levels compared to wild-type control. In addition, ALS-patient-derived fibroblasts with FUS mutations and age-sex-matched controls were used to explore if 2’-O-Me changes are also observed in ALS patients with FUS mutations. As expected, fibroblasts carrying ‘strong’ FUS P525L mutation displayed the highest number of significantly changed 2’-O-Me sites, whereas ‘mild’ FUS mutations R521C and R521L displayed fewer sites. These results were complemented by 2’-O-Me data from an isogenic pair of induced pluripotent stem cells, neural progenitor cells and motor neurons carrying FUS P525L mutation. Interestingly, most of the 2’-O-Me and pseudouridine sites mapped to the outer periphery of the 80S ribosome, suggesting that depending on their modification levels, these fractionally modified sites may regulate the binding of ribosomal proteins or other factors. As mentioned above, small RNA sequencing data showed that some snoRNAs were differentially expressed in SH-SY5Y FUS KO cells and, that many sdRNAs are generated from C/D and H/ACA box snoRNAs. In the case of the C/D box snoRNAs, these sdRNAs showed conserved box C or box D motifs. Moreover, a single snoRNA produced multiple sdRNAs with varying levels of expression. The sdRNA profile was different for proliferating and differentiated SH-SY5Y cells, suggesting that external cues such as retinoic acid treatment can also influence the processing of snoRNAs into sdRNAs. These results indicate that FUS influences snoRNA expression and ribosomal RNA modification. Secondly, some snoRNAs are processed into sdRNAs in a FUS-dependent manner. However, the function of these sdRNAs remains to be explored. Functional studies are necessary to explore the effects of individual rRNA modification sites on translation and how ALS-associated FUS mutation influences this process.
  • Item
    Elementy sekwencji i struktury RNA rozpoznawane przez białka z domeną FinO
    (2023) Basczok, Maciej; Olejniczak, Mikołaj. Promotor
    O bakteryjnych białkach opiekuńczych z domeną FinO wiadomo, że często wiążą RNA za pośrednictwem Rho-niezależnego terminatora transkrypcji. Co ciekawe, ten strukturalny motyw jest również wiązany przez inne białko opiekuńcze, Hfq, jednak z danych profilowania transkryptomu wiadomo, że pule wiązanych cząsteczek RNA przez oba białka pozostają zasadniczo odrębne. W pierwszej części pracy przeanalizowano dostępne dane ligandów RNA białek ProQ i Hfq z E. coli, S. enterica i N. meningitidis. Wykazano, iż region po stronie 5' terminatora w przypadku ligandów RNA białek ProQ z enterobakterii jest wzbogacony w adenozynę, a Hfq w urydynę. Kompozycja tego regionu stanowi element mechanizmu konkurencji o ligandy RNA między białkami ProQ i Hfq u enterobakterii. Natomiast u N. meningitidis zaobserwowano, że ligandy RNA obu białek są wzbogacone w adenozynę oraz że wzbogacenie to jest cechą całego tranksryptomu. Sugeruje to, iż białka ProQ i Hfq z N. meningitidis mogą wykorzystywać inne motywy podczas konkurencji o ligandy RNA. W drugiej części pracy wykazano, że w wiązaniu do białka ProQ z N. meningitidis bierze udział dolna część spinki terminatorowej wraz sekwencjami przylegającymi do niej zarówno po stronie 5' jak i 3', których minimalna długość może się różnić w zależności od cząsteczki RNA, jednak dla silnego wiązania zawsze musi mieć co najmniej kilka nukleotydów. Bacterial RNA chaperones with a FinO domain are known to bind RNA via a Rho-independent transcription terminator. Interestingly, this structural motif is also bound by another chaperone, Hfq, but from transcriptome profiling data it is known that the pools of RNA molecules bound by the two proteins remain essentially distinct. In the first part of the work, available data on RNA ligands of ProQ and Hfq proteins from E. coli, S. enterica and N. meningitidis were analysed. It was shown that the region on the 5' side of the terminator in the case of RNA ligands of ProQ proteins from enterobacteria is enriched in adenosine, while Hfq in uridine. The composition of this region is part of the mechanism of competition for RNA ligands between ProQ and Hfq proteins in enterobacteria. However, in N. meningitidis it was observed that the RNA ligands of both proteins are enriched in adenosine in this region and that this enrichment is a feature of the entire transcriptome. This suggests that the ProQ and Hfq proteins from N. meningitidis may use different motifs when competing for RNA ligands. In the second part of the work, it was shown that the lower part of the terminator hairpin and the sequences adjacent to it both on the 5' and 3' side are involved in binding to the ProQ protein from N. meningitidis, and that the minimum length of which may vary depending on the RNA molecule.
  • Item
    Analiza dynamiki oddziaływań pomiędzy drzewami i konsumentami ich nasion: od globalnych wzorców do zmienności w obrębie gatunku
    (2023) Celebias, Paulina; Zwolak, Rafał. Promotor; Bogdziewicz, Michał. Promotor
    Interakcje między roślinami a zwierzętami zjadającymi nasiona różnią się w swoim natężeniu, od słabych do silnych, oraz we wpływie jaki mają oddziałujące na siebie organizmy, od negatywnego do pozytywnego. Aby w pełni zrozumieć te zależności, potrzebujemy zarówno globalnej syntezy licznych istniejących już wyników badań, jak i nowych eksperymentów, które pozwolą na opisanie pomijanych dotąd aspektów oddziaływań między roślinami a konsumentami nasion. Moja rozprawa doktorska ma na celu sprostanie obu tym wyzwaniom. Składa się ona z trzech części: (i) meta- analizy hipotezy wysycenia konsumentów nasion, (ii) eksperymentu badającego wpływ wielkości nasion na sposób żerowania gryzoni, (iii) eksperymentu badającego wpływ zmienności wewnątrzgatunkowej gryzoni na roznoszenie nasion. W pierwszej części mojej rozprawy przeprowadziłam meta-analizę 48 opublikowanych badań, które spełniały kryterium zawierania co najmniej 4 lat danych dotyczących produkcji nasion oraz wielkości ich konsumpcji przez zwierzęta. Hipoteza wysycenia konsumentów nasion jest jednym z powszechnie przyjętych wyjaśnień ewolucyjnych korzyści lat nasiennych. Według niej, okresowe występowanie masowego opadu nasion powstało, aby zmniejszyć proporcję nasion niszczonych przez konsumentów. W latach niskiego opadu nasion, populacja konsumentów nasion zmniejsza się w związku z niewystarczającą ilością pożywienia, natomiast w latach nasiennych konsumenci nasion zasypywani są większą ilością nasion, niż są w stanie zjeść, co sprawia, że więcej nasion przeżywa. W swoich badaniach potwierdziłam zarówno efekt zagłodzenia, jak i wysycenia drapieżników, jednak efekt wysycenia był widoczny tylko dla zwierząt bezkręgowych. Co więcej, efekt wysycenia drapieżników w ostatnich latach staje się coraz słabszy, co może mieć związek z globalnymi zmianami antropogenicznymi. W drugiej części mojej rozprawy zbadałam wpływ wielkości nasion dębu szypułkowego (Quercus robur) na ich roznoszenie przez gryzonie. Znaczna zmienność wielkości nasion w obrębie jednego osobnika związana jest z modułową budową drzew. Każdy osobnik posiada wiele kopii tego samego organu, np. nasion, które mogą wykazywać znaczącą zmienność. Wielu konsumentów nasion przejawia preferencje względem nasion o konkretnym rozmiarze, dlatego przewidywałam, że między dużymi i małymi nasionami powstają interakcje pośrednie, które mogą wpływać na przeżywalność nasion. Odkryłam, że interakcje między żołędziami o różnych rozmiarach zmieniały się z roku na rok: w pierwszym, ale nie w drugim roku badania, obecność małych żołędzi chroniła duże przed usunięciem. W trzeciej części mojej rozprawy doktorskiej zbadałam wpływ zmienności wewnątrzgatunkowej myszarki leśnej (Apodemus flavicollis) na roznoszenie nasion dębu szypułkowego (Quercus robur). Wykazałam, że zwierzęta o większej skłonności do eksplorowania nowego środowiska mają tendencję do wynoszenia nasion dalej od drzew. Jednak inne efekty indywidualnych cech myszarki leśnej znacznie różniły się między latami, co wskazuje, że ich wpływ na interakcje z roślinami zmienia się, gdy warunki ekologiczne ulegają wahaniom. Podsumowując, wyniki moich badań podkreślają znaczenie prowadzenia wieloletnich badań w celu wykrycia zależnych od kontekstu interakcji między gatunkami i długoterminowych trendów w zjawiskach ekologicznych. The relationship between plants and granivores varies in magnitude - from weak to strong – and in sign – from negative to positive. To make sense of this variation, we need global syntheses of numerous existing studies, and field studies that focus on overlooked sources of complexity in plant-granivore interactions. My thesis aimed to address both of these goals. The thesis consists of three parts: (i) a meta-analysis of the predator-satiation hypothesis, (ii) a study on the impact of variation in seed size on foraging decisions of rodents, (iii) a study on the effects of intraspecific variation in granivore traits on the patterns of seed dispersal. In the first part of my thesis, I revisited predator-satiation hypothesis in a meta-analysis based on 48 studies that gathered at least 4 years of data on seed production and seed predation. The predator-satiation hypothesis is one of the most widely known hypothesis explaining evolutionary advantages of mast seeding. It states that intermittent, abundant crops evolved to reduce seed losses by starving granivores between mast events and overwhelming them with seeds during mast years. I found evidence of both starvation between mast years and satiation during mast years. However, the effectiveness of predator satiation varied between predator types; there was evidence for satiation of invertebrates, but not vertebrates. Moreover, satiation became less effective over recent decades, probably due to global anthropogenic changes. In the second part of my thesis, I investigated the impact of acorn size on their removal and dispersal by granivores. Because trees have modular construction, copies of the same organ, such as seeds, may exhibit considerable variation. Since most granivores display preferences towards seeds of particular size, indirect interactions can arise between larger and smaller seed, which further impacts seed survival and seedling establishment. I found that interactions among different sized acorns varied from year to year: in the first, but not the second year of the study, the presence of small acorns protected large ones from removal. In the third part of my thesis, I investigated the impact of individual traits of yellow-necked mice on the dispersal of common oak acorns. I found that more explorative individuals tend to disperse seeds further from other trees. However, other effects of individual traits varied substantially among years, indicating that their impact on interactions with plants changes when ecological conditions fluctuate. Overall, my results underscore the importance of conducting multi-year studies to detect context-dependent interactions between species and long-term trends in ecological phenomena.
  • Item
    Nowe funkcje białka hnRNP UL1 w komórkach ludzkich
    (2023) Cichocka, Marlena; Raczyńska, Katarzyna Dorota. Promotor
    Białko hnRNP UL1 jest zaangażowane w proces transkrypcji, działając głównie jako negatywny regulator hamujący ekspresję określonych genów. Ponadto, białko hnRNP UL1 uczestniczy w procesie splicingu oraz w odpowiedzi komórki na uszkodzenia DNA. Dodatkowo, wyniki naszej grupy badawczej pokazały po raz pierwszy, że hnRNP UL1 przemieszcza się również do jąderek komórek ludzkich. Poznanie funkcji, jakie białko to pełni w jąderkach komórkowych, stanowiło główny temat niniejszej rozprawy doktorskiej. Ponadto, podjęłam również próbę opisania wzajemnych interakcji pomiędzy hnRNP UL1, FUS i U7 snRNP, oraz określenia roli białka hnRNP UL1 w inhibicji genów histonowych poza fazą S cyklu komórkowego, którą pełni wraz z białkiem FUS i cząstką U7 snRNP. Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów wykazałam, że białko hnRNP UL1 w jąderku komórek ludzkich stymuluje transkrypcję genów rRNA, ale nie jest zaangażowane w kolejne etapy biogenezy rybosomów. Dalsze eksperymenty z wykorzystaniem odczynników genotoksycznych CPT i ETO wskazały, że komórki z wyciszeniem białka hnRNP UL1 są wrażliwsze na uszkodzenia DNA. Ponadto, pokazałam, że hnRNP UL1 oddziałuje z białkami szlaków naprawy uszkodzeń rDNA, takimi jak γH2A.X, RPA32, XRCC1 i Chk1, potwierdzając jego udział w tych procesach. Wyniki kolejnych eksperymentów pokazały, że białko hnRNP UL1 oddziałuje z białkiem FUS najsilniej poza fazą S cyklu komórkowego. Co ciekawe, zarówno FUS jak i hnRNP UL1 silniej wiążą U7 snRNA przy braku drugiego białka, wskazując, że oba białka mogą konkurować o dostępność do U7 snRNA. Zauważyłam również, że poziom fosforylacji białka hnRNP UL1 zmienia się w fazach cyklu komórkowego, co sugeruje, że to właśnie ta modyfikacja może regulować zmiennym oddziaływaniem hnRNP UL1 z białkiem FUS; takiej roli nie ogrywają natomiast metylacje argininy. Wykazałam ponadto, że hnRNP UL1 nie pełni roli inhibitora ekspresji genów histonowych w fazie G1 i G2 cyklu komórkowego, wydaje się jednak być inhibitorem ekspresji tych genów w fazie S. The hnRNP UL1 protein is involved in transcription, acting mainly as a negative regulator that inhibits the expression of specific genes. Furthermore, hnRNP UL1 is involved in splicing and the cell response to DNA damage. In addition, the results of our research group showed for the first time that hnRNP UL1 also moves into the nucleoli of human cells. Learning more about the functions of hnRNPUL1 in cell nucleoli was the main topic of this dissertation. In addition, I also attempted to describe the interactions between hnRNP UL1, FUS, and U7 snRNP, and to determine the role of the hnRNP UL1 protein in the inhibition of histone genes outside the S phase of the cell cycle, which it performs together with the FUS protein and U7 snRNP. Based on my experiments, I showed that the hnRNP UL1 protein stimulates the transcription of rRNA genes in the nucleolus of human cells, however, it is not involved in the subsequent steps of ribosome biogenesis. Further experiments using genotoxic reagents CPT and ETO indicated that cells with silencing of the hnRNP UL1 protein are more sensitive to DNA damage. In addition, I showed that hnRNP UL1 interacts with proteins of the rDNA damage repair pathways such as γH2A.X, RPA32, XRCC1, and Chk1, confirming its involvement in these processes. The results of subsequent experiments showed that the hnRNP UL1 protein interacts with the FUS protein the highest outside the S phase of the cell cycle. Interestingly, both FUS and hnRNP UL1 bind U7 snRNA more strongly in the absence of the other protein, indicating that the two proteins can compete for accessibility to U7 snRNA. I also observed that the phosphorylation level of the hnRNP UL1 protein changes during phases of the cell cycle, suggesting that this modification may regulate the variable interaction of hnRNP UL1 with the FUS protein; such a role is not played by arginine methylations. I further demonstrated that hnRNP UL1 does not play a role as an inhibitor of histone gene expression in the G1 and G2 phases of the cell cycle but appears to be an inhibitor of the expression of these genes in the S phase.
  • Item
    Określenie wpływu nieprawidłowości splicingu mRNA czynnika transkrypcyjnego NFIX na patomechanizm dystrofii miotonicznej oraz opracowanie narzędzia terapii genowej dla tej choroby
    (2023) Rogalska, Zuzanna; Sobczak, Krzysztof. Promotor
    Dystrofia miotoniczna typu 1 (DM1) jest dziedziczną, dominującą chorobą genetyczną, spowodowaną ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń CTG w genie DMPK. Nadmiernie wydłużone powtórzenia CUG (CUGexp) w zmutowanym mRNA są toksycznym produktem zmutowanego genu. Zmutowany mRNA sekwestruje czynniki splicingowe takie jak MBNL, a następnie w wyniku funkcjonalnego niedoboru tych białek wywołuje globalne zmiany w alternatywnym splicingu w mięśniach szkieletowych, sercu i mózgu, czego efektem są objawy charakterystyczne dla DM1. Nieprawidłowości w alternatywnym splicingu są kluczową molekularną przyczyną rozwoju DM1. Profil alternatywny splicingu wielu genów zaangażowanych w homeostazę mięśni i ich prawidłowe funkcjonowanie jest istotnie zaburzony. Niemniej jednak, molekularne konsekwencje zaburzeń alternatywnego splicingu większości genów są nadal nieznane. Jednym z eksonów zależnych od MBNL, którego efektywność włączenia do mRNA w procesie splicingu jest istotnie podwyższona w mięśniach szkieletowych DM, jest ekson 7 NFIX, genu kodującego czynnik transkrypcyjny niezbędny do prawidłowego rozwoju mięśni. Pierwszym celem niniejszej pracy było lepsze zrozumienie patomechanizmu DM w kontekście zaburzeń splicingowych NFIX poprzez zrozumienie wpływu włączenia eksonu 7 na aktywność transkrypcyjną NFIX. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zastosowano dwa alternatywne podejścia. Pierwszym z nich było stworzenie dwóch stabilnych linii komórkowych z indukowalną nadekspresją izoform NFIX z eksonem 7 i bez eksonu 7 (NFIX+7 lub NFIX-7) w oparciu o komórki HEK z funkcjonalnym nokautem endogennego NFIX (NFIX-KO). Nieoczekiwanie wyniki RNA-seq nie wykazały znaczących różnic w aktywności transkrypcyjnej tych dwóch izoform w stworzonych modelach komórkowych, być może z powodu niewłaściwego dopasowania poziomu ekspresji egzogenów (zbyt wysoki). Drugie podejście opierało się na manipulacji włączania egsonu 7 do endogennie eksprymowanego mRNA NFIX przy użyciu antysensownego oligonukleotydu (AON) nakierowanego na połączenie eksonu 7 z intronem 7. W ludzkich komórkach mięśni szkieletowych, w których dominuje izoforma NFIX+7, zastosowany AON indukował efektywne pomijanie eksonu 7 i produkcję głównie izoformy NFIX-7. Takie podejście umożliwiło wygenerowanie modelu komórkowego w kontekście środowiska, w którym NFIX jest naturalnie zaangażowany w proces prawidłowego rozwoju mięśni, ale także w patogenezę DM1. W tych komórkach ekspresja NFIX jest stosunkowo wysoka i jest regulowana przez natywny promotor. Wyniki eksperymentów RNA-seq ujawniły setki genów, których ekspresja uległa istotnym zmianom po traktowaniu AON, co sugeruje, że obie izoformy splicingowe - NFIX+7 i NFIX-7 - różnią się znacząco aktywnością transkrypcyjną. Analiza ontologii genów (GO) wykazała znaczne wzbogacenie klas genów, które są wrażliwe na te dwie izoformy NFIX, ale także zaobserwowano istotną zmianę ich ekspresji w mięśniach pacjentów z DM1. Wśród 5641 genów, których ekspresja jest znacząco zmieniona w tkankach DM1 (P<0,05) zidentyfikowano 2070 genów, których ekspresja była znacząco zmieniona w komórkach mięśniowych poddanych działaniu AON zmieniającemu splicing NFIX. Głównymi terminami GO wzbogaconymi w obu porównaniach (w pierwszym – geny wrażliwe na poziom NFIX oraz na obecność jego izoform splicingowych, w drugim – geny wrażliwe na izoformy splicingowe NFIX oraz zmienione w tkankach pacjentów DM1) były geny składników strukturalnych macierzy zewnątrzkomórkowej i geny białek wiążących się z kolagenami. Są to geny niezmiernie istotne dla prawidłowej budowy i aktywności mięśni szkieletowych, a zatem zaburzenie splicingu NFIX może stanowić istotny element patogenezy DM1. Podsumowując tę część pracy można stwierdzić, że nieprawidłowa dystrybucja eksonu 7 NFIX spowodowana sekwestracją białek MBNL na RNA ze zmutowanym CUGexp wywołuje liczne zmiany ekspresji genów zachodzących w mięśniach szkieletowych, które to mogą być odpowiedzialne za kształtowanie fenotypu chorobowego obserwowanego u pacjentów z DM1. DM jest chorobą nieuleczalną. Kiedy liczba powtórzeń osiąga wysoki poziom (od setek do tysięcy), występujące objawy kliniczne są cięższe oraz wzrasta wydajność sekwestracji zależnej od długości powtórzeń. Proponowane wcześniej strategie terapeutyczne prowadzące do podwyższenia poziomu MBNL1 za pomocą narzędzi terapii genowej wiążą się z występowaniem wielu niepożądanych konsekwencji. Długotrwała, niekontrolowana nadekspresja MBNL1 u myszy prowadzi bowiem do zmniejszenia masy ciała, zwiększonej śmiertelności i uszkodzenia mięśni, w tym mięśnia sercowego. Terapia genowa prowadząca do podwyższenia poziomu MBNL1 u pacjentów z DM1 wiąże się również z wieloma innymi ograniczeniami. Jednym z nich jest niejednorodność sekwestracji MBNL spowodowana mozaicyzmem somatycznym długości powtórzeń CTG w komórkach tego samego pacjenta oraz pomiędzy różnymi osobami ze zdiagnozowanym DM1. Aby sprostać tym ograniczeniom, zaprojektowałam i wygenerowałam autoregulowany konstrukt do nadekspresji MBNL1, który umożliwia produkcję białka MBNL1 dostosowaną do poziomu aktywnej puli endogennych białek MBNL w komórce. Ta strategia terapeutyczna daje więc możliwość przezwyciężenia ograniczeń wynikających z niejednorodności ekspansji powtórzeń CTG i w konsekwencji różnego stopnia niedoboru MBNL w różnych komórkach czy włóknach mięśniowych. Konstrukt ten zawiera sekwencję kodującą MBNL1 przedzieloną fragmentem pre-mRNA ATP2A1 z alternatywnym eksonem wrażliwym na poziom MBNL, który zawiera kodon stop w ramce odczytu dla MBNL1. Włączenie tego eksonu prowadzi więc do tworzenia nieaktywnej, skróconej formy białka, natomiast jego wyłączenie, następujące przy niedoborze MBNL, powoduje wzrost produkcji w pełni aktywnej formy MBNL1. Takie podejście umożliwia ograniczoną i ściśle kontrolowaną nadekspresję MBNL1, w zależności od stopnia niedoboru białka, a zarazem może odpowiadać na niejednorodność długości powtórzeń CUG. Podsumowując tę część pracy można powiedzieć, że przeprowadzone badania wykazały, że nadekspresja MBNL1 ze stworzonego konstruktu genetycznego podlega autoregulacji i ma potencjał terapeutyczny prowadzący do korygowania nieprawidłowości alternatywnego splicingu, co wykazano dla komórek pochodzących od pacjentów z DM1. Myotonic dystrophy type 1 is a hereditary, autosomal disease caused by expansion of trinucleotide CTG repeats in DMPK gene. Expanded CUG repeats in mutant mRNA is a major toxic product of mutant gene. It sequester MBNL splicing factors and due to functional insufficiency of these proteins trigger global changes in alternative splicing in skeletal muscles, heart and brain, which result in symptoms characteristic for DM1. The abnormalities in alternative splicing are crucial molecular feature of DM1. The alternative splicing of many genes engaged in muscle homeostasis and proper functioning is impaired. Although, the molecular consequence of majority of genes with altered splicing pattern is still unknown. One of the MBNL-dependent exons, which inclusion is significantly higher in skeletal muscles of DM, is exon 7 of NFIX, a gene encoding for transcription factor essential for muscle development. First aim of this study was to better understand the pathomechanism of DM in case of abnormalities in the splicing of NFIX. The examination of whether the contribution of exon 7 has an impact on NFIX transcriptional activity gave a deeper understanding of DM1 pathomechanism which is studied for a long time. To answer this question two alternative approaches were used. First of them was generation of two stable cell lines with inducible overexpression of NFIX isoforms with and without exon 7 (NFIX+7 or NFIX-7) based on a HEK cell with functional knockout of endogenous NFIX (NFIX-KO). Unexpectedly, RNA- seq results did not show significant differences in transcriptional activity of these two isoforms in developed cellular models, perhaps due to not well adjusted level of overexpression of exogenes (too high). The second approach based on manipulation of exon 7 inclusion of endogenous NFIX mRNA using the antisense oligonucleotide (AON) targeting (AON) targeting exon 7/intron 7 boundary. In human skeletal muscle cells, in which NFIX+7 isoform predominates, this AON induces efficient exon 7 skipping and production of NFIX-7 isoform. This approach gave the possibility to generate a model with an cellular environment where NFIX is engaged in the developmental process, but also in DM1 pathogenesis. The expression level of NFIX is relatively high in these cells and is driven by the native promoter. The results of RNA-seq revealed hundreds of genes which expression was significantly changed after AON treatment, suggesting that both splicing isoforms, NFIX+7 and NFIX-7, differ significantly in transcriptional activity. Gene ontology (GO) analysis showed significant enrichment of groups of genes that are sensitive to NFIX isoforms and abnormally expressed in DM1 patients. Among 5641 genes which expression is affected in DM1 (P<0.05), 2070 genes were identified which are also sensitive to treatment with AON modulating splicing pattern of NFIX. The major GO molecular function terms enriched in both comparisons (first: genes sensitive to the level of NFIX and its splicing isoforms; second: genes sensitive to the NFIX splicing isoforms and changed in DM1 tissues) were extracellular matrix structural constituent, and collagen binding. These functions are incredibly important for the proper structure and activity of skeletal muscle, therefore NFIX splicing abnormality may be essential trigger of DM1 pathogenesis. Taken together, these results showed that abnormal distribution of NFIX exon 7 caused by sequestration of MBNL proteins on CUGexp affects a subset of gene expression changes occurring in DM1 skeletal muscles, which may be responsible for the development of disease phenotype observed in DM1 patients. DM is an incurable disease. When the number of repeats reach a higher level clinical symptoms are more severe and the sequestration efficiency, which depends on the size expansion, increase. Previously proposed therapeutic strategies leading to increase of the MBNL1 level via gene therapy tools are associated with many undesirable consequences. Uncontrolled MBNL1 overexpression in mice leads to reduced body weight, increased mortality, or muscle damage, including heart muscle. The gene therapy leading to the increase of MBNL1 level is also associated with many limitations. One of them is heterogeneity in sequestration of MBNLs caused by somatic mosaicism of CTG repeat length in cells of the same patient and between individuals with DM1. To deal with these limitations I designed and generated the autoregulated MBNL1 overexpression construct which enables the production of MBNL1 adjusted to the level of active pool of endogenous MBNLs. It was assumed that this therapeutic strategy gave the possibility to overcome the limitations caused by heterogeneity of CTG repeat expansions and as a consequence different levels of MBNL insufficiency in different cells/myofibers. This construct contains MBNL1-coding sequence separated by the fragment of ATP2A1 pre-mRNA with MBNL-sensitive alternative exon containing in frame stop codon. The inclusion of this exon leads to the arrangement of the inactive form of the protein but its exclusion, occurring during MBNL insufficiency, gives rise in production of fully active MBNL1. This approach enables the restricted expression of MBNL1 protein only if its level in cell is too low and potentially can be controlled by heterogeneity of CUGexp load. It was shown that expression of MBNL1 assembled from this construct is tunable and has therapeutic potential to correct the alternative splicing abnormalities in DM1 patients-derived cells.
  • Item
    Rola elementów regulatorowych cis w zmutowanym mRNA FMR1 zawierającym ekspansję powtórzeń CGG w tworzeniu struktur typu R-loop i regulacji niekanonicznej translacji patogennego białka
    (2023) Niewiadomska, Daria; Sobczak, Krzysztof. Promotor
    Ekspansja niestabilnych powtórzeń CGG w regionie 5’ niepodlegającym translacji (5’UTR) genu FMR1 w zależności od wielkości ekspansji została powiązana z patogenezą wielu chorób związanych z łamliwym chromosomem X. Celem pierwszej części projektu było ustalenie roli struktur typu R-loop w procesie patogenezy chorób – FXTAS i FXS. Wyniki uzyskane w tej części pracy potwierdziły, że struktury R-loop tworzone w obrębie regionu 5’UTR genu FMR1 w warunkach FXTAS mają negatywny wpływ na transkrypcję FMR1, co może być częściowo osłabione poprzez zastosowanie ASO-CCG. Jednakże w odniesieniu do warunków FXS, zastosowanie ASO-CCG nie prowadziło do reaktywacji transkrypcji FMR1 w komórkach wyprowadzonych od pacjenta FXS, które charakteryzowały się całkowitym wyciszeniem FMR1. Natomiast traktowanie cząsteczkami ASO-CCG komórek pacjenta z FXS, które posiadały częściowo aktywne locus FMR1, prowadziło do wzmożenia transkrypcji FMR1 oraz zwiększenia puli mRNA FMR1 w cytoplazmie, co jednak nie spowodowało zwiększenia poziomu białka FMRP w tych komórkach. Druga część projektu dotyczyła roli elementów regulatorowych cis zlokalizowanych w regionie 5’UTR FMR1 w regulacji translacji toksycznego białka FMRpolyG inicjowanej z kodonów ACG lub GUG. Uzyskane wyniki wykazały, że zarówno kontekst sekwencyjny, jak i stabilna struktura drugorzędowa tworzona w obrębie mRNA FMR1 mają ogromny wpływ na inicjację translacji białka FMRpolyG, co sugeruje, że proces ten może być również regulowany przez wiele czynników trans wiążących się z regionami cis w obrębie sekwencji mRNA FMR1. The expansion of an unstable CGG repeat sequence within the 5’ untranslated region (5’UTR) ofFMR1 has been implicated in the pathogenesis of multiple fragile X-linked syndromes. The first part of the project aimed to establish the role of R-loops in the pathogenesis of FXTAS and FXS disorders. Results obtained in this part confirmed that R-loops forming within FMR1 5’UTR in FXTAS conditions have a negative effect on the FMR1 transcription which can be partially abolished by ASO-CCG. However, according to FXS, ASO-CCG treatment did not reactivate the FMR1 transcription from FXS cells which were characterized by full FMR1 silencing. On the contrary, ASO-CCG treatment of FXS cells which possessed partially active FMR1 locus resulted in the increased transcription rate of FMR1 and its enhanced mRNA pool in the cytoplasm. Nevertheless, elevated FMR1 mRNA level did not translate into increased FMRP level. The second part of the project was concerning the cis-regulatory elements within FMR1 5’UTR and their involvement in the regulation of initiation of toxic FMRpolyG synthesis from near-cognate ACG or GUG start codons. Obtained data showed that both sequence context as well as stable secondary structure within mRNA have enormous effect on the initiation of FMRpolyG translation suggesting that this process is potentially regulated by many cis- and trans-factors targeting various regions/elements within the FMR1 mRNA sequence.
  • Item
    Efektywność transferu wertykalnego grzybów endofitycznych
    (2023) Węgrzyn, Ewa; Lembicz, Marlena. Promotor
    Transfer wertykalny to mechanizm, który zapewnia rozprzestrzenianie się endofitów grzybowych. Przez długi czas w badaniach zakładano, że wszystkie nasiona zarażonych roślin zawierają w swoim wnętrzu strzępki endofitów. Okazało się, że tak nie jest. Dotąd nie wiadomo jednak: czy jest to proces uniwersalny, czy występuje u roślin dziko rosnących oraz jakie czynniki wpływają na efektywność transferu wertykalnego. Testowano trzy hipotezy. Hipoteza pierwsza - efektywność transferu wertykalnego jest istotnie większa w przypadku nasion pochodzących z roślin występujących na siedlisku antropogenicznym. Hipoteza druga - w trakcie przemieszczania się mykobiomu na drodze roślina dojrzała – nasiona – siewki transfer wertykalny jest mniej efektywny. Hipoteza trzecia - gradient wysokości istotnie wpływa na skład grzybów endofitycznych wraz z wysokością. Przeprowadzono detekcję oraz identyfikację molekularną grzybów endofitycznych w nasionach/siewkach/liściach badanych roślin. Do identyfikacji molekularnej użyto starterów ITS1F oraz ITS4. Stwierdzono, że efektywność transferu wertykalnego grzybów endofitycznych jest niedoskonała i istotnie zależna od rodzaju siedliska i stadium życiowego rośliny. Nie stwierdzono natomiast istotnego wpływu gradientu wysokości n.p.m na efektywność transferu wertykalnego. Vertical transfer is a mechanism, which allows for the dispersal of fungal endophytes. For a long time many research studies assumed that all the seeds of the infected plants contain the endophyte hyphae inside. This turned out not to be the case. However, it is not yet known: whether it is a universal process, whether it can be found in the wild plants, and what factors can impact the effectiveness of the vertical transfer. Three hypotheses were tested. The first hypothesis - the effectiveness of the vertical transfer is significantly greater in the case of the seeds from the plants found in the anthropogenic habitat. The second hypothesis - during the travel of the mycobiome along the path: mature plant - seeds - seedlings, the vertical transfer is less effective. The third hypothesis - with altitude, the height gradient substantially affects the composition of the endophytic fungi. A detection and molecular identification of the endophytic fungi within the seeds/seedlings/leaves of the studied plants was carried out. The primers ITS1F and ITS4 were used for the molecular identification. It was found that the efficiency of the vertical transfer of the endophytic fungi is imperfect and depends significantly on the type of the habitat and the life stage of the plant. However, there was no significant effect of the height gradient on the effectiveness of the vertical transfer.
  • Item
    Identyfikacja nowego i regulowanego przez ABA miRNA oraz charakterystyka jego genu docelowego - AtBRO1 w procesach wzrostu i w odpowiedzi na stres abiotyczny u Arabidopsis thaliana
    (2023) Syed, Muhammad Muntazir Mehdi; Ludwików, Agnieszka. Promotor
    Wiele czynników środowiskowych, takich jak podwyższona temperatura, zasolenie i susza, mają wpływ na wzrost i produktywność upraw. Kluczowym szlakiem sygnałowym uczestniczącym w regulacji odpowiedzi roślin na stres jest rdzeniowa sygnalizacja kwasu absysynowego (ABA). ABA kontroluje reakcje roślin poprzez regulację ekspresji genów, także z udziałem ścieżek zależnych od miRNA. miRNA biorą udział w różnych procesach biologicznych, w tym w reakcjach adaptacyjnych na stres abiotyczny. Celem mojej pracy doktorskiej była identyfikacja nowych miRNA zaangażowanych w regulację ekspresji genów w odpowiedzi na ABA. Aby zrealizować postawiony cel badania prowadzono z zastosowaniem rośliny modelowej Arabidopsis thalina formy dzikiej (WT) oraz mutantów szlaku sygnałowego ABA: abi1td, mkkk17 i mkkk18. Analizy z wykorzystaniem RNAseq umożliwiły identyfikację 10 nowych miRNA w odpowiedzi na ABA (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) u formy dzikiej A.thaliana oraz 1 nowy miRNA u mutanta mkkk17. Ponadto, analiza wyników ujawniła, że trzy, siedem i dziewięć znanych miRNA ulegało różnej ekspresji w odpowiedzi na ABA u mutantów abi1td, mkkk17 i mkkk18. Wyniki sekwencjonowania zostały potwierdzone za pomocą ilościowego RT-PCR we wszystkich badanych genotypach. By zidentyfikować geny docelowe i potencjalne miejsca cięcia dla nowozidentyfikowanych miRNA wykorzystano psRNA Target oraz 5′ RLM-RACE. Analiza ontologii wykazała, że potencjalne geny docelowe znanych i nowych miRNA reagujących na ABA są zaangażowane w różne procesy komórkowe w roślinach, w tym rozwój i ruchy aparatów szparkowych. Wyniki te sugerują, że wiele zidentyfikowanych miRNA odgrywa ważną rolę w odpowiedziach roślin na stres środowiskowy i może pełnić wspólne funkcje regulacyjne w szlaku sygnałowym ABA. W kolejnym etapie badania koncentrowały się na charakterystyce nieznanego białka BRO1, zawierającego domenę podobną do BRO (AT1G73390), które jest celem jednego z nowo zidentyfikowanych miRNA, ath-miRn-1. W toku analiz wykazano, że w odpowiedzi na zasolenie, ABA i mannitol transkrypt BRO1 ulegał indukcji. Transgeniczne linie A.thaliana z nadekspresją BRO1 wykazywały silną tolerancję na suszę i stres solny wskazując, że BRO1 reguluje reakcje odpornościowe u roślin. Promotor AtBRO1 w fuzji z GUS wykazywał ekspresję głównie w liściach rozety i kwiatach, zwłaszcza w pylnikach. Analiza lokalizacji subkomórkowej BRO1::GFP wykazała, że białko to lokalizuje się przy błonie cytoplazmatycznej protoplastu. Wyniki analizy transkyptomicznej mutanta typu nokaut w genie BRO1, bro1-1, w odniesieniu do linii dzikiej Arabidopsis, wykazały zmiany w ekspresji wielu genów, o których wiadomo, że są zaangażowane w odpowiedź roślin na stres. Podsumowując, stwierdzono, że BRO1 może odgrywać ważną rolę w regulacji odpowiedzi transkrypcyjnej na ABA i indukcji odpowiedzi roślin na stres abiotyczny. Podsumowując, wyniki badań przedstawione w prezentowanej rozprawie, umożliwiły poznanie nowych mechanizmów regulujących odpowiedź roślin na stres abiotyczny i powiązanych z sygnalizacją ABA. Najważniejszym wynikiem pracy jest identyfikacja aż 11 nieznanych miRNA i głębsza charakterystyka funkcjonowania jednego ze z nich - ath-miRn-1 – w powiązaniu z identyfikacją nowego efektora w reakcji roślin na stres i nieznanego dotąd BRO1. Wyniki uzyskane w ramach pracy rzucają światło na mechanizmy leżące u podstaw tolerancji na stres. Many environmental factors, such as increased temperature, salinity and drought, affect the growth and productivity of crops. A key signaling pathway involved in regulating plant responses to stress is the absisic acid (ABA) signaling pathway. ABA controls plant responses through the regulation of gene expression, also through miRNA dependent pathways. miRNAs are involved in various biological processes, including adaptive responses to abiotic stress. The aim of my PhD thesis was the identification of novel miRNAs which are involved in the regulation of gene expression in response to ABA. In order to achieve this goal, the study was carried out using the model plant Arabidopsis thaliana wild type (WT) and mutants of the ABA signalling pathway: abi1td, mkkk17 and mkkk18. The RNAseq analyses identified 10 new miRNAs in response to ABA in the wild type A. thaliana (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) and 1 new miRNA in the mkkk17 mutant. In addition, analysis of the results showed that three, seven and nine known miRNAs were differentially expressed in response to ABA in the abi1td, mkkk17 and mkkk18 mutants, respectively. In all genotypes tested, the sequencing results were confirmed by quantitative RT-PCR. To identify target genes and potential cleavage sites for newly identified miRNAs, psRNA-Target and 5′ RLM RACE were used. Ontology analysis revealed that the potential target genes of known and novel ABA-responsive miRNAs are involved in various cellular processes in plants, including stomatal development and movement. These results suggest that many of the identified miRNAs play important roles in plant responses to environmental stress. They may have common regulatory functions in the ABA signalling pathway. In the next step, they focused on characterising of the unknown BRO-like domain-containing protein AtBRO1 (AT1G73390) which is targeted by one of the newly identified miRNAs, ath-miRn-1. Analyses showed that BRO1 is induced in response to salinity, ABA and mannitol. Transgenic Arabidopsis lines overexpressing BRO1 showed strong tolerance to drought and salt stress, suggesting that BRO1 regulates stress responses in plants. The BRO1 promoter fused to GUS was expressed mainly in rosette leaves and flowers, especially in anthers. Analysis of the subcellular localisation of BRO1::GFP showed that this protein was localised to the cytoplasmic membrane of the protoplast. The results of the transcriptomic analysis of the knockout mutant in the BRO1 gene, bro1-1, compared to the wild Arabidopsis line showed changes in the expression of many genes known to be involved in plant stress responses. It was concluded that BRO1 may play an important role in regulating the transcriptional response to ABA and in inducing plant responses to abiotic stress. In conclusion, the results presented have allowed the identification of new mechanisms regulating the response of plants to abiotic stress and related to ABA signalling. The most important result is the identification of 11 unknown miRNAs and a deeper characterisation of the function of one of them - ath-miRn-1 - in connection with the identification of a new effector in the plant response to stress - the previously unknown BRO1. The results of this work will shed light on the mechanisms underlying stress tolerance in plants.
  • Item
    Ścieżki transportu ligandów w białkach
    (2023) Borja, Carlos Eduardo Sequeiros; Brezovsky, Jan. Promotor
    Analiza tuneli białkowych ewoluowała od wizualnej identyfikacji w strukturach statycznych do wykorzystania symulacji dynamiki molekularnej, co prowadzi do obfitości danych. Stanowi to jednak wyzwanie ze względu na ograniczenia zasobów i czasu. W ramach moich badań doktoranckich opracowałem narzędzia i metodologie, aby rozwiązać te problemy. Pierwsza publikacja oferuje zintegrowane podejście do analizy geometrii tunelu i transportu ligandów, zapewniając powtarzalność i niesubiektywne wyniki. Druga publikacja umożliwia szybką i opłacalną analizę tuneli w dużych zbiorach danych, eliminując potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu. Ponadto odkrywa wcześniej przeoczone wąskie tunele przy użyciu mniejszej sondy. W sekcji praktycznych zastosowań, trzecia publikacja bada selektywny transport transportera ABCG46, demonstrując, w jaki sposób modyfikacje tuneli wpływają na translokację ligandów. Czwarty artykuł bada transport wody w enzymach hydrolazowych, ujawniając znaczenie wąskich tuneli, które mogą pomieścić cząsteczki wody mniejsze niż ich promień wąskiego gardła. Protein tunnel analysis has evolved from visual identification in static structures to using molecular dynamics simulations, leading to an abundance of data. However, this poses challenges due to resource and time constraints. In my doctoral research, I developed tools and methodologies to address these issues. The first publication offers an integrative approach for tunnel geometry and ligand transport analysis, ensuring reproducibility and non-subjective results. The second publication enables fast and cost-effective analysis of tunnels in large datasets, eliminating the need for specialized hardware. Additionally, it uncovers previously overlooked narrow tunnels using a smaller probe. In the practical applications section, the third publication investigates the selective transport of the ABCG46 transporter, demonstrating how tunnel modifications impact ligand translocation. The fourth paper explores water transport in hydrolase enzymes, revealing the significance of narrow tunnels that can accommodate water molecules smaller than their bottleneck radii.
  • Item
    Modelowanie molekularne zależności struktura-dynamika-funkcja w białkach
    (2023) Surpeta, Bartłomiej; Brezovsky, Jan. Promotor
    Ciągły postęp w nauce, metodach obliczeniowych i technologii umożliwia coraz lepsze badanie białek. Na przestrzeni dziesięcioleci stało się jasne, że białka są dynamicznymi jednostkami i aby dokładnie zbadać ich funkcję, nie wystarczy spojrzeć tylko na strukturę, ale także na nieodłączny składnik dynamiczny. W moich badaniach doktoranckich skupiłem się na wygaszaniu kworum, które pozwala na zakłócenie komunikacji bakteryjnej, zmniejszając w ten sposób czynniki wirulencji. Można to osiągnąć enzymatycznie, a zatem takie enzymy były głównym przedmiotem mojej rozprawy doktorskiej. Praca składa się z czterech artykułów. W pierwszym zbadałem szczegóły dynamicznych składników, które determinują i ograniczają aktywność wygaszania kworum w N-końcowych hydrolazach serynowych. Drugi to przegląd literatury podsumowujący podejścia w inżynierii białek, które uwzględniają dynamikę jako kluczową podczas procesu projektowania. Trzecia część przedstawia bibliotekę TransportTools, oprogramowanie opracowane w naszym laboratorium w celu sprostania wyzwaniu spójnej analizy przestrzeni wewnętrznych w danych zespołu białek pochodzących z masowych symulacji dynamiki molekularnej. Ostatnia część rozprawy obejmuje racjonalne projektowanie wariantów acylazy penicyliny G E. coli o ulepszonej aktywności i modulowanej specyficzności wobec cząsteczek sygnałowych różnych patogennych gatunków bakterii. Ongoing advances in science, computational methods, and technology make it possible to study proteins better and better. Over the decades, it has become clear that proteins are dynamic entities, and to accurately study their function, it is not enough to look only at the structure, but also at the inherent dynamic component. In my Ph.D. research, I focused on quorum quenching, which allows the disruption of bacterial communication, thereby reducing virulence factors. It can be achieved enzymatically, and thus such enzymes were the main interest of my dissertation. The thesis consists of four articles. In the first, I investigated details of the dynamic components that determine and limit the quorum quenching activity in N-terminal serine hydrolases. The second is a literature review summarizing approaches in protein engineering that consider dynamics as crucial during the design process. The third part presents the TransportTools library, software developed in our laboratory to address the challenge of consistent analysis of internal spaces in protein ensemble data resulting from massive molecular dynamics simulations. The last part of the thesis covers the rational design of E. coli penicillin G acylase variants with improved activities and modulated specificities towards signaling molecules of different pathogenic bacterial species.
  • Item
    Kontrola crossing-over poprzez białko MSH2 wykrywające nieprawidłowo dopasowane pary zasad DNA w odpowiedzi na wzór chromosomowej heterozygotyczności u Arabidopsis thaliana
    (2023) Dłużewska, Julia; Ziółkowski, Piotr. Promotor
    Podczas mejozy chromosomy homologiczne łączą się w pary i wzajemnie wymieniają materiałem genetycznym w procesie zwanym crossing-over lub rekombinacją mejotyczną. Crossing-over jest ważne dla generowania nowych kombinacji alleli, a co najmniej jedno crossing-over na biwalent jest niezbędne do zapewnienia właściwej segregacji chromosomów w mejozie. Co więcej, rozmieszczenie zdarzeń crossing-over nie jest przypadkowe, a ich liczba jest limitowana – na jedną parę chromosomów podczas mejozy przypada tylko około 2-3 crossing-over, niezależnie od fizycznej wielkości genomu. Jednym z czynników wpływających na rozmieszczenie rekombinacji jest polimorfizm pomiędzy chromosomami homologicznymi. Obecność regionu heterozygotycznego obok regionu homozygotycznego na tym samym chromosomie powoduje redystrybucję crossing-over do regionu polimorficznego. Pokazałam, że ów efekt zestawienia heterozygotyczności in cis (ang. heterozygosity juxtaposition effect), zależy od aktywności białka MSH2, kluczowego elementu systemu naprawy nieprawidłowo sparowanych zasad DNA. Moje wyniki wykazują stymulującą rolę MSH2 w tworzeniu crossing-over klasy I. Dzięki całogenomowej analizie crossing-over w mieszańcach z mutacją msh2 wykazałam, że rekombinacja jest redystrybuowana z wysoce polimorficznych regionów okołocentromerowych do mniej polimorficznych regionów przytelomerowych. Interferencja genetyczna nie uległa zmianie w mutancie msh2 w liniach wsobnych i mieszańcowych. Korzystając z panelu linii Arabidopsis thaliana znakowanych fluorescencyjnie (ang. fluorescent-tagged line, FTL) wykazałam, że wzór rekombinacji jest w znacznej mierze podobny między liniami wsobnymi i mieszańcami, jednak obecność regionu heterozygotycznego na w innym wypadku homozygotycznym chromosomie przekierowuje zdarzenia crossing-over do regionu heterozygotycznego. Wzrost rekombinacji obserwuje się głównie w pobliżu granicy pomiędzy regionem heterozygotycznym i homozygotycznym, podczas gdy spadek zdarzeń crossing-over w części homozygotycznej obejmuje cały ten region. Protokół opisujący wykorzystanie FTL w pomiarach częstotliwości rekombinacji również stanowi część mojej rozprawy doktorskiej. Zdarzenia crossing-over klasy II są wrażliwe na obecność polimorfizmu i z tego powodu nie są wydajnie formowane w regionach heterozygotycznych. W mieszańcach, w których aktywna jest wyłącznie klasa II (podwójny mutant fancm zip4) przyczyną obniżonej płodności jest niedobór crossing-over. Poprzez dodatkową inaktywację MSH2 zwiększyłam płodność roślin. Co więcej, moje całogenomowe analizy crossing-over w tle różnych mutantów, w tym w msh2 fancm i msh2 recq4, w połączeniu z pomiarami częstości rekombinacji przy użyciu FTL ujawniły, że MSH2 ogranicza zachodzenie crossing-over klasy II. MSH2 wykazuje więc przeciwstawne działanie w dwóch szlakach crossing-over. W regionach około-centromerowych, które są znacznie bardziej polimorficzne niż reszta chromosomu, inaktywacja MSH2 nie spowodowała zwiększenia częstości crossing-over klasy II w regionach heterozygotycznych. To pokazuje, że polimorfizm może mieć również niezależny od MSH2 wpływ na rekombinację. Ponadto, nadekspresja pro-rekombinacyjnego czynnika HEI10 spowodowała znaczny wzrost rekombinacji we wszystkich testowanych wariantach heterozygotyczności, z wciąż obecną tendencją regionów heterozygotycznych do stymulowania zdarzeń crossing-over. Wykazałam, że w msh2 HEI10-OE rekombinacja jest zwiększona globalnie z powodu promowania klasy I przez HEI10, jednak nie obserwuje się efektu zestawienia heterozygotyczności in cis. Co więcej, w wariancie msh2 fancm zip4 HEI10-OE nie wykryto stymulowania crossing-over przez HEI10, co dowodzi, że HEI10 nie odgrywa żadnej roli w klasie II. Podsumowując, wykazałam pro-rekombinacyjną rolę MSH2 dla crossing-over klasy I oraz antagonistyczną, anty-rekombinacyjną rolę dla crossing-over klasy II. Moja praca pokazuje, że MSH2 jest głównym regulatorem dla obu szlaków crossing-over, co pozwala na dynamiczną regulację rekombinacji mejotycznej, w zależności od poziomu i rozkładu heterozygotyczności pomiędzy chromosomami homologicznymi. During meiosis, homologous chromosomes pair and reciprocally exchange genetic material in a process called crossover or meiotic recombination. Crossover is important for generating new allele combinations and at least one crossover per bivalent is necessary to ensure proper chromosome segregation in meiosis. Moreover, crossover placement is not random and its numbers are limited – there are only about 2-3 crossovers per chromosome pair per meiosis, regardless of the physical size of the genome. One of the factors influencing recombination pattern is interhomolog polymorphism. The presence of heterozygous region juxtaposed to homozygous region on the same chromosome, causes a redistribution of crossovers into the polymorphic region. I showed that this heterozygosity juxtaposition effect depends on the activity of MSH2 protein, key element of mismatch repair system. My results demonstrate MSH2 stimulating role in the formation of Class I crossovers. With genome-wide crossover mapping in msh2 hybrids, I was able to show that recombination is redistributed from highly polymorphic pericentromeres into less polymorphic subtelomeric regions. Genetic interference was not changed in msh2 inbred and hybrid lines. By using a panel of Arabidopsis thaliana fluorescence-tagged lines (FTLs), I showed that recombination landscape is mostly similar between inbred and hybrid lines, however the presence of heterozygous region on an otherwise homozygous chromosome, redirects crossover events into the former. The increase in heterozygous region is mostly observed close to the heterozygous-homozygous regions boarder, whilst decrease in homozygous part spans the entire region. The protocol for FTL use in crossover rate measurements is also included in this dissertation. Class II crossovers are polymorphism-sensitive and cannot be efficiently formed in heterozygous regions. In hybrids exhibiting only Class II (fancm zip4 double mutant), crossover scarcity is the reason for reduced fertility. By additionally inactivating MSH2, I was able to increase plant fertility. Moreover, my genome-wide crossover analysis in different mutant contexts, including msh2 fancm and msh2 recq4, combined with FTL crossover frequency measurements, revealed that MSH2 limits Class II crossovers. Hence, MSH2 has opposite roles in two crossover pathways. In pericentromeric regions, which are much more polymorphic than the rest of the chromosome, MSH2 inactivation was not able to increase Class II crossovers frequency in heterozygous regions. This shows MSH2-independent polymorphism impact on recombination. Finally, the overexpression of pro-crossover HEI10 caused significant increase in recombination in all tested heterozygosity variants, with a trend of heterozygous regions attracting crossovers still present. I showed, that in msh2 HEI10-OE total recombination is increased because of HEI10 promoting Class I, however no juxtaposition effect is observed. What is more, no HEI10 stimulation is detected in msh2 fancm zip4 HEI10-OE variant, proving that HEI10 has no role in Class II. To sum up, I showed pro-recombination role of MSH2 for Class I crossovers and an antagonistic, anti-recombination role for Class II crossovers. Therefore, this work demonstrates that MSH2 is a master regulator of both crossover pathways, which allows for dynamic regulation of meiotic recombination outcomes, depending on the level and distribution of sequence divergence between homologs.
Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu
Biblioteka Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu
Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego