Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Wydział Chemii ROZPRAWA DOKTORSKA mgr Karolina Babijczuk Koniugaty indolowe – synteza, analiza strukturalna i ocena aktywności biologicznej Indole conjugates – synthesis, structural analysis and evaluation of biological activity W formie spójnego tematycznie cyklu artykułów opublikowanych w czasopismach naukowych Promotor: prof. UAM dr hab. Beata Jasiewicz Poznań 2025 Pragnę wyrazić serdeczne podziękowania Prof. UAM dr hab. Beacie Jasiewicz za poświęcony czas i nieocenioną pomoc udzieloną w trakcie przygotowywania rozprawy doktorskiej Chciałabym podziękować także Prof. UAM dr hab. Lucynie Mrówczyńskiej za pomoc w realizacji badań biologicznych Serdecznie dziękuję również Prof. UAM dr hab. Annie Komasie za owocną współpracę oraz przyjazną atmosferę Dziękuję także mojej rodzinie i przyjaciołom za wsparcie, motywację i wiarę we mnie Spis treści Życiorys naukowy ...................................................................................................................... 1 Lista publikacji ........................................................................................................................... 2 Wstęp i cel pracy ........................................................................................................................ 5 Część literaturowa .................................................................................................................... 7 1. Koniugaty ....................................................................................................................... 7 1.1. Biokoniugaty .......................................................................................................... 8 1.2. Związki hybrydowe ................................................................................................ 8 2. Indol ............................................................................................................................... 8 2.1. Właściwości przeciwutleniające indolu ............................................................... 11 2.2. Właściwości przeciwnowotworowe indolu .......................................................... 12 2.3. Właściwości przeciwbakteryjne indolu ................................................................ 13 2.4. Właściwości przeciwgrzybiczne indolu ............................................................... 14 3. Gramina ........................................................................................................................ 16 4. Azole ............................................................................................................................ 18 4.1. Imidazol i pirazol ................................................................................................. 19 4.1.1. Właściwości biologiczne imidazoli .............................................................. 21 4.1.2. Właściwości biologiczne pirazoli ................................................................. 23 4.2. Związki kompleksowe imidazolu ......................................................................... 24 Wyniki badań .......................................................................................................................... 26 5. Synteza ......................................................................................................................... 27 5.1. Synteza koniugatów indolowych ......................................................................... 27 5.2. Synteza kompleksów koniugatów indolowo-imidazolowych z chlorkiem cynku ... 29 5. Analiza spektroskopowa otrzymanych związków ....................................................... 30 6. Struktura w krysztale .................................................................................................... 33 7. Badania biologiczne ..................................................................................................... 36 7.1. Aktywność hemolityczna ..................................................................................... 36 7.2. Aktywność przeciwutleniająca ............................................................................. 39 7.3. Aktywność przeciwbakteryjna ............................................................................. 42 7.4. Aktywność przeciwgrzybiczna ............................................................................ 43 8. Badania in silico ........................................................................................................... 45 8.1. Właściwości fizykochemiczne związków ............................................................ 45 8.2. Dokowanie molekularne ...................................................................................... 47 Podsumowanie ......................................................................................................................... 49 Porównanie numeracji związków w rozprawie doktorskiej i publikacjach ............................. 50 Schematy przeprowadzanych syntez ........................................................................................ 51 Bibliografia ............................................................................................................................... 53 Streszczenie rozprawy doktorskiej ........................................................................................... 69 Summary of doctoral dissertation ............................................................................................ 70 Publikacje wchodzące w skład rozprawy doktorskiej i materiały uzupełniające ..................... 71 1 Życiorys naukowy W 2015 roku ukończyłam I Liceum Ogólnokształcące im. Księcia Bolka I w Jaworze. W tym samym roku rozpoczęłam studia licencjackie na Wydziale Chemii Uniwersytetu Adama Mickiewicza na kierunku chemia, specjalność chemia sądowa. Pracę licencjacką pod tytułem: “Kości jako materiał biologiczny w badaniach toksykologiczno-sądowych” przygotowałam pod opieką Pani Prof. UAM dr hab. Beaty Jasiewicz. W 2018 roku rozpoczęłam badania nad solami pirydoksyny (witaminy B6) w Zakładzie Produktów Bioaktywnych w ramach pracowni magisterskiej. Pod kierunkiem Pani Prof. UAM dr hab. Anny Komasy napisałam pracę “Badania spektroskopowe, strukturalne i teoretyczne kompleksów pirydoksyny z kwasami” i w 2020 roku uzyskałam tytuł magistra chemii. Studia w Szkole Doktorskiej Nauk Ścisłych rozpoczęłam w październiku 2021 roku, gdzie zajęłam się tematyką nowych pochodnych alkaloidów indolowych i ich aktywnością bio- logiczną. Badania wykonywałam w Zakładzie Produktów Bioaktywnych, pod opieką Pani Prof. UAM dr hab. Beaty Jasiewicz. Odbyłam również staż w Zakładzie Biologii Komórki na Wydziale Biologii UAM, gdzie przy wsparciu Pani Prof. UAM dr hab. Lucyny Mrówczyńskiej wykonywałam badania właściwości hemolitycznych i antyoksydacyjnych otrzymanych związ- ków. Wyniki swoich badań w formie wystąpienia ustnego lub posteru przedstawiłam na pię- ciu konferencjach naukowych. Jestem współautorką kilku artykułów naukowych, opublikowa- nych w czasopismach z listy filadelfijskiej. 2 Lista publikacji Publikacje wchodzące w skład rozprawy doktorskiej P1. Jasiewicz, B.; Babijczuk, K.; Warżajtis, B.; Rychlewska, U.; Starzyk, J.; Cofta, G.; Mrówczyńska, L. Indole Derivatives Bearing Imidazole, Benzothiazole-2-Thione or Benzoxa- zole-2-Thione Moieties—Synthesis, Structure and Evaluation of Their Cytoprotective, Antiox- idant, Antibacterial and Fungicidal Activities. Molecules 2023, 28, 708, doi:10.3390/mole- cules28020708. P2. Babijczuk, K.; Warżajtis, B.; Starzyk, J.; Mrówczyńska, L.; Jasiewicz, B.; Rychlewska, U. Synthesis, Structure and Biological Activity of Indole–Imidazole Complexes with ZnCl2: Can Coordination Enhance the Functionality of Bioactive Ligands? Molecules 2023, 28, 4132, doi:10.3390/molecules28104132. P3. Babijczuk, K.; Berdzik, N.; Nowak, D.; Warżajtis, B.; Rychlewska, U.; Starzyk, J.; Mrówczyńska, L.; Jasiewicz, B. Novel C3-Methylene-Bridged Indole Derivatives with and without Substituents at N1: The Influence of Substituents on Their Hemolytic, Cytoprotective, and Antimicrobial Activity. International Journal of Molecular Sciences 2024, 25, 5364, doi:10.3390/ijms25105364. P4. Babijczuk, K.; Wawrzyniak, K.; Rutkowska, K.; Budnik, L.; Warżajtis, B; Rychlewska, U.; Nowak, D.; Starzyk, J.; Banda, Y.; Mrówczyńska L.; Jasiewicz, B. Indole-pyrazole hybrids: synthesis, structure, and assessment of their hemolytic, cytoprotective, and antimicrobial prop- erties. (Wysłane do czasopisma) Pozostałe publikacje P5. Komasa, A.; Babijczuk, K.; Dega-Szafran, Z.; Gołdyn, M.; Bartoszak-Adamska, E.; Szaf- ran, M.; Cofta, G. Interactions of Pyridoxine (Vitamin B6) with Squaric Acid and Water. Ex- perimental and Theoretical Studies. Journal of Molecular Structure 2022, 1251, 131773, doi:10.1016/j.molstruc.2021.131773. P6. Nowak, D.; Babijczuk, K.; Jaya, L.O.I.; Bachorz, R.A.; Mrówczyńska, L.; Jasiewicz, B.; Hoffmann, M. Artificial Intelligence in Decrypting Cytoprotective Activity under Oxidative Stress from Molecular Structure. International Journal of Molecular Sciences 2023, 24, 11349, doi:10.3390/ijms241411349. P7. Koenig, H.; Babijczuk, K.; Ostrowski, K.; Nowak, D.; Pospieszny, T.; Jasiewicz, B. New Steroid–Alkaloid Bioconjugates as Potential Bioactive Compounds: Synthesis, Spectroscopic and In Silico Study. Applied Sciences 2025, 15, 591, doi:10.3390/app15020591. 3 P8. Babijczuk, K.; Komasa, A.; Gołdyn, M.; Bartoszak-Adamska, E.; Larowska-Zarych, D.; Lipińska, P.; Sell-Kubiak, E.; Warzych E.; Structural diversity of salts of pyridoxine with gen- tisic acid and the impact of a dihydrate form on antioxidant activity and boar sperm viability. (Wysłane do czasopisma) Rozdziały w monografiach 1. Babijczuk, K.; Jasiewicz, B.; Mrówczyńska, L.; Starzyk, J.; Cofta, G. Hybrydy indolowo- imidazolowe o właściwościach biologicznych. BioOrg 2022 - IV Ogólnopolskie Sympozjum Chemii Bioorganicznej, Organicznej i Biomateriałów, Materiały konferencyjne 2022, 45-47, ISBN: 978-83-955437-2-2 2. Babijczuk, K.; Komasa, A. Spektroskopowe i teoretyczne badania soli pirydoskyny (wita- miny b6) z kwasem 2,4-dihydroksybeznoesowym. Nauka i przemysł - metody spektroskopowe w praktyce, nowe wyzwania i możliwości 2022, 240-243, ISBN: 978-83-227-9602-3 3. Babjiczuk, K.; Warżajtis, B.; Starzyk, J.; Mrówczyńska, L.; Jasiewicz, B.; Rychlewska, U. Structure and biological activity of indole-imidazole hybrids complexes with ZnCl2. ChemBiotIC Chemistry & Biotechnology International Conference Programme and book of abstracts 2023, 85, ISBN: 978-83-7493-244-8 Udział w konferencjach 1. Babijczuk, K.; Jasiewicz, B.; Mrówczyńska, L.; Starzyk, J.; Cofta, G. Hybrydy indolowo- imidazolowe o właściwościach biologicznych. BioOrg 2022 - IV Ogólnopolskie Sympozjum Chemii Bioorganicznej, Organicznej i Biomateriałów, Poznań, 3.12.2022 2. Babijczuk, K.; Komasa, A. Spektroskopowe i teoretyczne badania soli pirydoskyny (wita- miny b6) z kwasem 2,4-dihydroksybeznoesowym. Nauka i przemysł - metody spektroskopowe w praktyce, nowe wyzwania i możliwości, Lublin, 28-29.06.2022 (online) 3. Nowak, D.; Babijczuk, K.; Jaya, L.O.I.; Bachorz, R.A.; Mrówczyńska, L.; Jasiewicz, B.; Hoffmann, M. Uczenie maszynowe w odszyfrowywaniu aktywności cytoprotekcyjnej podczas stresu oksydacyjnego ze struktury cząsteczki, XX Ogólnopolskie Seminarium Studentów i Doktorantów „Na pograniczu Chemii, Biologii i Farmacji”, Jarnołtówek, 26-29.05.2023 4. Babjiczuk, K.; Warżajtis, B.; Starzyk, J.; Mrówczyńska, L.; Jasiewicz, B.; Rychlewska, U. Structure and biological activity of indole-imidazole hybrids complexes with ZnCl2. ChemBiotIC Chemistry & Biotechnology International Conference, Wrocław, 22-23.06.2023 (online) 5. Babjiczuk, K.; Jasiewicz, B.; Warżajtis, B.; Mrówczyńska, L.; Starzyk, J.; Nowak, D. Hy- brydy indolowe zawierające grupę tiolową lub tionową – synteza, struktura i aktywność 4 biologiczna. Ogólnopolska Konferencja Doktorantów Nauk Ścisłych i Przyrodniczych „Bio Idea 4.0”, Lublin, 3.02.2024 (online) 6. Babjiczuk, K.; Komasa, A.; Gołdyn, M.; Bartoszak-Adamska, E.; Larowska-Zarych, D. Li- pińska, P.; Sell-Kubiak, E.; Warzych, E. Zróżnicowanie strukturalne soli pirydoksyny z kwasem gentyzynowym i wpływ dihydratu na żywotność plemników knura. 66. Zjazd Polskiego Towa- rzystwa Chemicznego, PTChem 2024, Poznań, 15-20.09.2024 7. Nowak, D.; Bachorz, R.A.; Babijczuk, K.; Jaya L.O.I.; Jasiewicz, B.; Mrówczyńska, L.; Hoffmann, M.; Przewidywanie aktywności cytoprotekcyjnej związków indolowych za pomocą algorytmów uczenia maszynowego, 66. Zjazd Polskiego Towarzystwa Chemicznego, PTChem 2024, Poznań, 15-20.09.2024 5 Wstęp i cel pracy Badania zależności aktywności związków od struktury (SAR, ang. Structure-Activity Relationships) są istotnym elementem projektowania nowych leków. Wiedząc, które elementy budowy cząsteczki mają wpływ na jej konkretne właściwości, można tak modyfikować nowe pochodne, by uzyskać jak najlepszą aktywność biologiczną. Powszechną praktyką są zmiany podstawników w znanych już aktywnych cząstecz- kach. Zastąpienie atomu wodoru grupą funkcyjną lub podstawnikiem, takim jak alkil lub halo- gen, może znacząco zmodyfikować działanie biologiczne związków. Inną metodą jest łączenie ze sobą dwóch lub więcej aktywnych cząsteczek i otrzymywanie koniugatów. W ciągu ostatnich lat zauważyć można wzrost zainteresowania antyoksydantami. Zwią- zane jest to z udziałem utleniaczy w wielu chorobach przewlekłych, między innymi chorobach Alzheimera i Parkinsona, cukrzycy, chorobach serca i płuc, schorzeniach psychicznych, takich jak depresja czy schizofrenia, a także w nowotworach oraz procesie starzenia. Z tego powodu poszukiwanie nowych związków o właściwościach przeciwutleniających jest tak istotnym za- gadnieniem. Ugrupowaniem chętnie wykorzystywanym w takich syntezach jest pierścień indolu, obecny w wielu związkach pochodzenia naturalnego, między innymi w graminie. Mo- dyfikacje tego alkaloidu mogą prowadzić do otrzymania pochodnych wykazujących szereg właściwości biologicznych. Celem mojej pracy doktorskiej była synteza koniugatów indolowych o potencjal- nych właściwościach antyoksydacyjnych oraz analiza zależności aktywności biologicznej otrzymanych związków od ich struktury. Wychodząc z graminy otrzymałam trzy grupy koniugatów indolowych: 1) indolowo-imidazolowe, 2) indolowo-tioketonowe i 3) indolowo-pirazolowe. Ponadto, aby sprawdzić w jakim stopniu reakcje kompleksowania mogą zmienić wła- ściwości biologiczne ligandów, otrzymałam związki kompleksowe koniugatów indolowo-imidazolowych z chlorkiem cynku. Strukturę wszystkich nowych związków potwierdziłam za pomocą spektrometrii mas oraz spektroskopii FT-IR i NMR (1H i 13C). Dla większość koniugatów i kompleksów wyko- nana została analiza krystalograficzna. Badania biologiczne skupiły się głównie na określeniu aktywności hemolitycznej i antyoksydacyjnej związków. Zbadałam ich zdolność do ochrony erytrocytów przed hemolizą indukowaną oksydacyjnie oraz do chelatowania jonów żelaza (II). Analiza otrzymanych wyni- ków pozwoliła na określenie zależności aktywności hemolitycznej i przeciwutleniającej związ- ków od ich struktury. Badania dokowania molekularnego posłużyły do przeanalizowania powinowactwa wy- branych koniugatów do enzymów biorących udział w stresie oksydacyjnym. Ponadto 6 za pomocą metod in silico sprawdziłam parametry fizykochemiczne otrzymanych pochodnych, określające podobieństwo związków do leków. Dodatkowo badania biologiczne zostały poszerzone o sprawdzenie aktywności przeciw- bakteryjnej i przeciwgrzybicznej koniugatów i kompleksów. Wybrane w tym celu szczepy mi- kroorganizmów są szeroko rozpowszechnione w środowisku i mogą przyczyniać się do chorób zarówno wśród ludzi jak i roślin. Wszystkie opisane w tej pracy wyniki są zawarte w trzech opublikowanych artykułach o międzynarodowym zasięgu oraz jednym wysłanym do redakcji. 7 Część literaturowa 1. Koniugaty Koniugaty to związki powstałe z połączenia ze sobą kowalencyjnym łącznikiem dwóch (lub więcej) aktywnych biologicznie indywiduów chemicznych [1]. Mogą one nie tylko łączyć właściwości związków, z których pochodzą, ale także wykazywać mniejszą toksyczność i poprawić ich biodostępność. Dodatkowo umożliwiają ukierunkowane działanie farmaceuty- ków, tak ważne w przypadku walki z nowotworami [2–4]. Strategia łączenia ze sobą różnych leków znana jest od dziesięcioleci i nosi nazwę poli- terapii lub leczenia skojarzonego. Od lat stosowana jest w terapiach przeciwnowotworowych oraz w leczeniu AIDS i malarii [5]. Przyjmowanie dwóch lub więcej farmaceutyków jednocze- śnie ma na celu między innymi poprawę ich działania, zmniejszenie efektów ubocznych a także walkę z antybiotykoodpornością [5,6]. Takie podejście jednak niesie ze sobą większe ryzyko toksyczności. Trudniej jest ustalić bezpieczną dawkę dwóch leków niż jednego, a dodatkowo mogą one wchodzić ze sobą w trudne do przewidzenia interakcje oraz znacznie różnić się swoją farmakokinetyką [7]. Koniugaty stanowią alternatywę dla politerapii. Kowalencyjny łącznik, stanowiący połączenie między bioaktywnymi składnikami ko- niugatów, może być zaprojektowany zarówno tak, by zostać zerwanym po przedostaniu się związku do organizmu, jak i pozostać nierozerwanym (Rys. 1) [8,9]. W pierwszym przy- padku mowa o prolekach (związkach nie będących lekami, ale stającymi się nimi po przemia- nach metabolicznych in vivo [10]), w drugim natomiast całe koniugaty wykazują działanie far- makologiczne. Rysunek 1. Schemat budowy koniugatu, będącego lekiem. 8 1.1. Biokoniugaty Gdy przynajmniej jednym z elementów tworzących koniugat jest biocząsteczką (np. aminokwas, peptyd, cukier, tłuszcz [11]) całość nosi nazwę biokoniugatu [12]. Często to pojęcie ma jeszcze węższe znaczenie i odnosi się do połączenia środka o działaniu farmako- logicznym i makrocząsteczki, takiej jak białko czy polimer [13,14]. Głównym celem takiego podejścia jest synteza leków o ukierunkowanym i lepszym działaniu oraz mniejszej toksyczno- ści [15,16]. Biokoniugaty znalazły zastosowanie jako leki przeciwnowotworowe [17], przeciwbak- teryjne [18], a także jako szczepionki [19]. Przykładem są koniugaty przeciwciało-lek, będące połączeniem przeciwciała monoklonalnego, związku cytotoksycznego i łącznika [9,20,21]. Są one klasą leków przeciwnowotworowych, które w precyzyjny sposób dostarczają silnie cytotoksyczną molekułę bezpośrednio do komórek rakowych [20]. W tym wypadku bioczą- steczką jest przeciwciało, które łączy się specyficznie z konkretnym antygenem, zapewniając tym samym ukierunkowane działanie biokoniugatu [21]. 1.2. Związki hybrydowe Hybrydami określa się związki składające się z przynajmniej dwóch aktywnych cząste- czek, połączonych kowalencyjnym łącznikiem [22]. Uzyskane w taki sposób pochodne mogą wykazywać lepszą aktywność niż związki wyjściowe i mieć lepszą biodostępność [23,24]. Dzięki działaniu w więcej niż jednym miejscu jednocześnie i dzięki różnym mechanizmom działania komponentów hybrydy, mogą być one odpowiedzią w walce z chorobą Alzheimera [25], antybiotykoodpornością bakterii [26] czy lekoodpornością nowotworów [27]. Ich ogromny potencjał sprawia, że od wielu lat cieszą się rosnącym zainteresowaniem [28]. 2. Indol Wśród związków organicznych wykorzystywanych do syntez w chemii medycznej na szczególną uwagę zasługują związki heterocykliczne. Posiadają one przynajmniej jeden he- teroatom, tj. inny niż atom węgla, najczęściej jest to atom azotu, tlenu lub siarki, wbudowany w strukturę pierścienia. Układy heterocykliczne można znaleźć w związkach pochodzenia na- turalnego, zarówno roślinnego jak i zwierzęcego oraz w wielu lekach. Według danych z lat 2013-2023, związki heterocykliczne zawierające atom azotu stanowią 82% wszystkich nowych małocząsteczkowych leków zatwierdzonych przez FDA (Agencja Żywności i Leków, ang. Food and Drug Administration), podczas gdy w latach 1938–2012 było to 59% [29]. Po- równanie to pokazuje jak dużym zainteresowaniem w syntezie farmaceutyków cieszą się związki heterocykliczne. Przedstawicielem związków heterocyklicznych jest indol (2,3-benzopirol, 1H-benzo[b]pirol), zawierający dwa skondensowane pierścienie: benzen i pirol. Płaska budowa i obecność dziesięciu zdelokalizowanych elektronów π sprawiają, że zaliczany jest on do związ- ków aromatycznych. Jego słabo zasadowy charakter związany jest z udziałem w rezonansie 9 elektronowym wolnej pary elektronowej atomu azotu, co uniemożliwia wykorzystanie jej w reakcji protonowania [30]. Podobnie jak benzen, indol ulega reakcji substytucji elektrofilowej. Preferowaną pozycją ataku jest pozycja C3 z uwagi na zwiększoną gęstość elektronową i naj- większą stabilność powstałego produktu przejściowego (Rys. 2) [31]. Rysunek 2. Struktura indolu wraz z numeracją atomów węgla oraz schemat substytucji elektrofilowej w pierścieniu indolu. Układ indolowy obecny jest w strukturze egzogennego aminokwasu tryptofanu (Rys. 3A), będącego prekursorem między innymi serotoniny i melatoniny oraz auksyn, roślin- nych hormonów wzrostu [32,33] (Rys. 3B-D). Indol występuje w ludzkich odchodach i razem z para-krezolem (4-metylofenolem) stanowi prekursor wielu toksyn mocznicowych, czyli tok- sycznych metabolitów wydalanych wraz z moczem [34]. Jest odpowiedzialny za nieprzyjemny, charakterystyczny zapach kału [35], ale w małych stężeniach pachnie jaśminem i jest chętnie wykorzystywany jako środek zapachowy w perfumach czy herbatach [36]. Rysunek 3. Wzory tryptofanu (A), serotoniny (B), melatoniny (C) i kwasu indolilo-3-octowego, przy- kłady auksyny (D) . Pochodne indolu powszechnie występują w świecie przyrody w postaci alkaloidów indolowych [37]. Alkaloidy są ogromną grupą związków organicznych (kilkanaście tysięcy), a brak dokładnej definicji sprawia, że w niektórych przypadkach trudno je odróżnić od innych 10 naturalnych produktów [38]. Mianem alkaloidów określa się związki pochodzenia naturalnego (z roślin, grzybów lub bakterii, a także niektórych zwierząt, głównie owadów [39]), zawierające w swojej strukturze atom azotu i zazwyczaj mające charakter zasadowy [40]. Klasyfikuje się je głównie ze względu na budowę chemiczną [41]. Jedną z największych grup alkaloidów są alkaloidy indolowe. Zidentyfikowano je między innymi w roślinach z rodzin toinowatych (Apocynaceae), marzanowatych (Rubiaceae), loganiowatych (Loganiaceae), błotniowatych (Nyssaceae) [37,42] i wiechlinowatych (Gramineae; Poaceae) [43], a także w mikroorganizmach morskich [44], psychoaktywnych grzybach [45] i jadzie ropuch z rodzaju Bufo [46] (Rys. 4). Rysunek 4. Przykłady alkaloidów indolowych i źródła ich pochodzenia. Alkaloidy indolowe oraz ich pochodne wykazują szereg właściwości biologicznych. Wśród nich wymienić można aktywność przeciwutleniającą, przeciwnowotworową, przeciw- bakteryjną i przeciwgrzybiczną [37,47,48]. Związki indolowe wykorzystywane są w poszuki- waniu nowych leków przeciwzapalnych [49], przeciw chorobom Alzheimera [50] i Parkinsona [51], przeciwko cukrzycy [52], HIV [53] oraz SARS-CoV-2 [54]. 11 2.1. Właściwości przeciwutleniające indolu Wolne rodniki są indywiduami chemicznymi posiadającymi w swojej strukturze niespa- rowany elektron. Taka budowa sprawia, że są niestabilne i wysoko reaktywne [55]. Ich źródła są zarówno egzo- jak i endogenne, a ich nadmiar prowadzi do stresu oksydacyjnego [56]. Ten z kolei ma swój udział w wielu chorobach, między innymi cukrzycy, otyłości czy chorobach neurodegeneracyjnych [57]. Stąd istotne jest poszukiwanie nowych związków przeciwutlenia- jących. Właściwości antyoksydacyjne indolu powiązane są głównie z obecnością niepodstawio- nego atomu azotu w pierścieniu pirolu, będącego aktywnym centrum redoks cząsteczki [58]. Dodatkowo, bogaty w elektrony układ aromatyczny indolu, będący donorem elektronów, może stabilizować powstałe wolne rodniki, a w pozycji C3 możliwa jest elektrofilowa addycja rod- nikowa [59]. Istotny jest także nie tylko rodzaj, ale i położenie podstawnika, jako że zawada przestrzenna może mieć istotny wpływ na oddziaływanie z dużymi objętościowo utleniaczami [58]. Przykładem pochodnej indolu cechującej się aktywnością antyoksydacyjną jest melato- nina (Rys. 5). Jest to hormon odpowiadający za regulację cyklu dobowego, a także procesu dorastania czy formowania pamięci [60]. Melatonina wychwytuje wolne rodniki zarówno tlenowe (rodnik hydroksylowy, nadtlenek wodoru, tlen singletowy) jak i azotowe (tlenek azotu, anion nadtlenoazotynowy). Swoją aktywność zawdzięcza obecności pierścienia indolowego oraz podstawnikom: grupie amidowej w pozycji C3 i grupie metoksylowej w pozycji C5 [59]. Fragment karbonylowy w grupie amidowej wychwytuje wolne rodniki, podczas gdy atom azotu bierze udział w tworzeniu nowego pięcioczłonowego pierścienia po interakcji z reaktywną czą- steczką [61]. Grupa metoksylowa natomiast zapobiega prooksydacyjnym reakcjom oraz dostar- cza elektrony do pierścienia indolu [59]. Rysunek 5. Schemat neutralizacji rodnika hydroksylowego przez melatoninę. 12 Oprócz melatoniny, do związków indolowych naturalnego pochodzenia wykazujących właściwości antyoksydacyjne należą między innymi indolo-3-karbinol [62], kwas indolilo-3-propionowy [63], windolina [64] i gramina [65]. Z uwagi na swoją aktywność biologiczną indole są chętnie wykorzystywane w syntezie nowych koniugatów o właściwościach przeciwutleniających. Przykładem mogą być hybrydy indolu z kwasem kawowym [66], chalkonami [67,68], izoniazydem [69], hydrazonami [70] czy 1,3,4-oksadiazolami [71] oraz koniugaty indolu z izatyną, tryptofanem i benzolidenoinda- nonem (Rys. 6A) zsyntezowane przez Arumugam i in. Te ostatnie neutralizują cząsteczki H2O2 w takim samym stopniu co związek referencyjny, jakim była witamina C, w każdym badanym stężeniu [72]. Wśród grupy hybryd indolu z pochodnymi 3-(4-chlorobutylo)−1H-indolo-5-karboni- trilu, otrzymanymi przez Jagadeesan i in., najlepsze właściwości antyoksydacyjne w testach z udziałem DPPH i ABTS wykazał związek z pierścieniami tiazolowym i pirydynowym (Rys. 6B) [73]. Wysoką aktywnością odznaczyły się także pochodne z 4-metylo-1,2,4-triazo- lem, benzimidazolem i 5-metoksybenzimidazolem. Kolejna grupa pochodnych to hybrydy indolowo-benzimidazowe (Rys. 6C) zsyntezo- wane przez Kathrotiya i Patela charakteryzujące się dobrymi właściwościami redukującymi jony żelaza w osoczu (FRAP, ang. Ferric reducing ability of plasma) [74]. Badania prowadzone przez Ashok i in., na pochodnych indolowo-benzimidazolowych dodatkowo podstawionych w pozycji N1 indolu wykazały, że związki te mają zdolności do wychwytywania rodników DPPH i H2O2 [75]. Najlepszą aktywnością charakteryzowały się związki mające grupę metok- sylową w pierścieniu fenylowym (Rys. 6D). Rysunek 6. Koniugaty indolowe o właściwościach przeciwutleniających. 2.2. Właściwości przeciwnowotworowe indolu Nowotwory są drugą najczęstszą przyczyną zgonów, zaraz po chorobach serca [76], nic więc dziwnego, że poszukiwania nowych leków przeciwnowotworowych są jednym z priory- tetów chemii medycznej. Układem często pojawiającym się w takich syntezach jest pierścień indolowy. Motywowane jest to zdolnością związków heterocyklicznych do tworzenia między- cząsteczkowych wiązań wodorowych z celem farmakologicznym oraz obecnością indolu 13 w dwóch lekach przeciwnowotworowych pochodzenia naturalnego: winkrystynie (Rys. 7A) i winblastynie [77]. Wśród innych, zatwierdzonych do użytku, terapeutyków zawierających w swojej strukturze indol są osimertinib (Rys. 7B), wykorzystywany w leczeniu niedrobnoko- mórkowego raka płuca [78], panobinostat (Rys. 7C), używany przy szpiczaku mnogim [79] oraz midostaurin (Rys. 7D), pomocny w terapii ostrej białaczki szpikowej [80]. Rysunek 7. Struktury leków przeciwnowotworowych zawierających indol: winkrystyna (A), osimertinib (B), panobinostat (C), midostaurin (D). Mechanizmy działania związków indolu o właściwościach przeciwnowotworowych obejmują między innymi indukowanie apoptozy [81], inhibitowanie polimeryzacji tubuliny lub topoimerazy [77], a także powstrzymywanie proliferazy i syntezy DNA [78]. Co więcej, pochodne indolu wykazują aktywność przeciwko lekoodpornym nowotworom, dzięki zakłóce- niu wielu szlaków sygnałowych w komórkach [82,83]. Nowe hybrydy indolowo-pirazolowe i indolowo-tiazolidynowe są skuteczne przeciwko nowotworowi wątroby [84,85], a związki z tiadiazolami oraz oksindolem powstrzymują wzrost komórek raka piersi [86,87]. 2.3. Właściwości przeciwbakteryjne indolu Bakterie występują wszędzie dookoła nas. Większość z nich jest nieszkodliwa, a nie- które szczepy występują w ludzkim organizmie, żyjąc z nami w symbiozie i tworząc naturalną florę bakteryjną [88]. Gdy jednak przedostaną się one ze swoich typowych siedlisk (np. usta, jelita) na obszary, gdzie nie powinny występować (np. krew, płuca) dochodzi do infekcji bak- teryjnej [89]. Jest ona jedną z najczęstszych chorób, co sprawia, że synteza związków o działa- niu przeciwbakteryjnym nieustannie znajduje się w centrum zainteresowań naukowców. Dodatkowym wyzwaniem jest rosnąca antybiotykoodporność, zmuszająca do poszukiwania nowych leków i nowych mechanizmów ich działania [90]. Alkaloidy indolowe stanowią ważną grupę związków o właściwościach przeciwbakte- ryjnych. Wykazują działanie przeciwko pałeczce okrężnicy (Escherichia coli) [91], laseczce siennej (Bacillus subtilis) [92], różnym szczepom gronkowca złocistego (Staphylococcus 14 aureus, MSSA, MRSA) [93,94], a także wielu innym, zarówno Gram-dodatnim jak i Gram- ujemnym bakteriom [95,96]. Wyizolowany z mikroskopijnych grzybów Penicillium polonicum alkaloid indolowy, polonidyna A, wykazał umiarkowane działanie przeciwko laseczce siennej (Rys. 8A) [97]. Wzrost tej bakterii inhibitują także związki pochodzące z Voacanga africana (Rys. 8B) [98] oraz Rauvolfia yunnanensis (Rys. 8C) [99]. Pájaro-González i in. wykazali, że spośród alkaloidów indolowych wyizolowanych z Tabernaemontana cymosa woakangina (Rys. 8D) wykazuje aktywność przeciwko gronkow- cowi złocistemu [100]. Rysunek 8. Alkaloidy indolowe o działaniu przeciwbakteryjnym. Zarówno dimery indolu jak i jego koniugaty są skuteczne przeciwko lekoodpornym bakteriom z grupy ESCAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneu- moniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter) [101,102]. Hybrydy benzotiofenowo-indolowe wykazują działanie przeciw odpornemu na metycylinę gronkowcowi złocistemu (MRSA). Podobnie związki zawierające zarówno indol jak i nitroi- midazol, które dodatkowo są aktywne przeciw wankomycyno-odpornej Enterococcus faecium [103]. 2.4. Właściwości przeciwgrzybiczne indolu Choroby wywoływane przez grzyby stanowią poważne zagrożenie nie tylko dla ludzi, ale także dla upraw. Mogą prowadzić do utraty nawet 1/5 z nich, a te liczby prawdopodobnie wzrosną przez trwające ocieplenie klimatu [104]. Alkaloidy indolowe wykazujące właściwości antygrzybiczne wyizolowano między in- nymi z roślin Winchia calophylla [105], Alstonia scholaris [106], Alstonia venenata [107], Kop- sia genus [108] i z organizmów morskich [109]. Tryptantryna jest naturalnym alkaloidem, zaliczanym do grupy alkaloidów indolochi- nazolinowych. Wykazuje wiele właściwości biologicznych, między innymi aktywność 15 przeciwgrzybiczną [110]. Inhibituje wzrost Cryptococcus [111], drożdżaków odpowiedzial- nych za kryptokokozę, infekcję grzybiczną charakteryzującą się znaczną zachorowalnością i wysoką śmiertelnością [112]. Co więcej, tryptantryna wykazuje także działanie przeciwko in- nemu chorobotwórczemu grzybowi - Trichophyton benhamiae [113]. Rysunek 9. Wzór tryptantryny. Zsyntezowana przez Pagniez i in. hybryda indolowo-triazolowa (Rys. 10A) była sku- teczna przeciwko drożdżakowi Candida, wywołującemu kandydozę [114]. Grupa związków zawierających te same dwa układy (Rys. 10B) została otrzymana przez Al-Wabli i in. i wyka- zała działanie przeciwko trzem szczepom Candida [115]. Wśród serii 24 koniugatów indolowo-tiadiazolowych przebadanych przez He i in. na 14 grzybach będących patogenami roślin, pochodna z podstawnikiem w pozycji N1 indolu i z grupą metylową w pierścieniu benzenu przyłączonym wiązaniem amidowym do tiadiazolu (Rys.10C) była bardziej aktywna przeciwko gronowcowi szaremu (Botrytis cinerea) niż zwią- zek referencyjny [116]. Innym przykładem hybryd indolowych o właściwościach przeciwgrzybicznych są związki otrzymane przez Chauhan i in. (Rys. 10D) [117]. Trzy z nich wykazały aktywność przeciwko Candida albicans, porównywalną do aktywności standardowego leku flukonazolu. Rysunek 10. Koniugaty indolowe o właściwościach przeciwgrzybicznych. 16 3. Gramina Jednym z przedstawicieli grupy alkaloidów indolowych jest gramina (donaxin, 3-(di- metyloaminometylo)indol) (Rys. 11). Po raz pierwszy została wyizolowana w 1935 roku z lasecznicy trzcinowatej (Arundo donax L.) [118]. Roślina ta wzbudziła zainteresowanie bada- czy, gdy zauważono, że jest pomijana przez pasące się wielbłądy, które wybierały gatunek po- krewny – trzcinę pospolitą (Phragmites australis). Skłoniło to naukowców do zbadania zawar- tości alkaloidów w tej roślinie. Udało się im otrzymać kryształy związku o wzorze sumarycz- nym C11H14N2, zawierającym nienasycone wiązania i wykazującym charakter zasadowy, któ- remu nadano nazwę „donaxin” [118]. W tym samym roku inna grupa badawcza wyizolowała ten sam związek z jęczmienia, nazywając go „gramina” [119]. Później graminę znaleziono rów- nież w innych roślinach z rodziny wiechlinowatych np. w owsie (Avena sativa L.) [120] i mo- zdze trzcinowatej (Phalaris arundinacea L.) [121], a oprócz tego także w łubinie (Lupinus lu- teus L.) [122] czy Gymnacranthera paniculata, drzewie z lasów deszczowych Nowej Gwinei [123]. Rysunek 11. Wzór graminy. Gramina jest chętnie wykorzystywana jako związek wyjściowy w syntezie pochodnych indolowych z podstawnikiem w pozycji C3 [124–126]. Grupa dimetyloaminowa w łańcuchu bocznym indolu może łatwo odejść pod wpływem wysokiej temperatury (Rys. 12A) lub będąc najpierw przekształconą w trzeciorzędową sól amonową (będącą dobrą grupą odchodzącą) (Rys. 12B), tworząc produkt przejściowy, który następnie może reagować z nukleofilem [124,127,128]. Gramina należy do metabolitów wtórnych i pełni w roślinach rolę ochronną przed owa- dami, a także przeżuwaczami [129]. Ponadto wykazuje aktywność przeciwutleniającą [65] i przeciwnowotworową [130]. Może być także wykorzystywana do hamowania wzrostu alg [131] oraz wykazuje potencjał w walce z pałeczką zapalenia płuc (Klebsiella pneumoniae) [132]. 17 Rysunek 12. Metody otrzymywania pochodnych graminy poprzez A) ogrzewanie graminy i B) prze- kształcenie graminy w sól amonową. Pochodne graminy wykazują między innymi właściwości antyoksydacyjne. Chronią krwinki czerwone (RBC) przed szkodliwym działaniem wolnych rodników generowanych przez dihydrochlorek 2,2’-azobis(2-amidynopropanu) (AAPH), co wykazały badania prowa- dzone przez Kozanecką-Okupnik i in., Jasiewicz i in. oraz Berdzik i in. [124–126,133]. Wśród otrzymanych związków największą aktywnością, porównywalną do aktywności Troloxu (roz- puszczalnej w wodzie formy witamy E) charakteryzowały się związki zawierające w swojej strukturze w pozycji C3 indolu połączone łącznikiem metylenowym pierścienie uracylu i tiou- racylu [125] (Rys. 13A, B), a także ftalimidu (Rys. 13C) [124,]. Aktywne były także inne po- chodne zawierające ugrupowanie ftalimidowe (Rys. 13D) [133] oraz takie będące dimerami indolowo-triazolowymi połączonymi różnej długości łańcuchami alkilowymi [126] (Rys. 13E). Rysunek 13. Pochodne graminy o właściwościach antyoksydacyjnych. Zhang i in. wychodząc z graminy zsyntezowali serię hybryd indolowo-azolowych i zba- dali ich działanie przeciwko nowotworowi żołądka [134]. Związek zawierający bromobenzo- tiazol (Rys. 14A) najlepiej inhibitował proliferację tych komórek rakowych. To samo ugrupo- wanie, tj. benzotiazol, było także obecne w dwóch pochodnych otrzymanych przez Ke i in., 18 które wykazywały aktywność przeciwko nowotworom żołądka i wątroby [135] (Rys. 14B, C). Jednakże związkiem o najlepszych właściwościach przeciwnowotworowych, w tym samym badaniu, była hybryda zawierająca pierścień pirazolu, inhibitując proliferację komórek raka wątroby, żołądka, a także płuc (Rys. 14D). Rysunek 14. Pochodne graminy o właściwościach przeciwnowotworowych. Pochodne graminy wykazują również właściwości przeciwmikrobowe. Inhibitują wzrost szczepów bakterii pałeczki okrężnicy i gronkowca złocistego [136] oraz grzybów: gro- nowca szarego, Fusarium culmorum i Zymoseptoria tritici [137]. W 2019 roku przebadano graminę oraz grupę ponad trzydziestu jej pochodnych w kie- runku działania antywirusowego przeciwko wirusowi mozaiki tytoniu, wywołującemu chorobę w roślinach z rodziny psiankowatych (Solanaceae Juss.) [138]. Badania te wskazały kilka związków o wyższej niż ningnanmycyna, związek referencyjny, zdolności do inhibicji tego wi- rusa. Pochodne graminy otrzymane przez Wei i in. wykazały selektywne działanie hamujące przeciwko infekcjom enterowirusem 71, powodującym ciężką chorobę neurologiczną, a także choroby dłoni, stopy i jamy ustnej u dzieci [139]. 4. Azole Azole są heterocyklicznymi, pięcioczłonowymi związkami zawierającymi w swojej strukturze przynajmniej jeden atom azotu [140] (Rys. 15). Mają charakter aromatyczny dzięki udziale wolnej pary atomu azotu, tlenu lub siarki w tworzeniu zdelokalizowanego sekstetu elek- tronowego [141]. Aromatyczność azoli zmniejsza się wraz ze wzrostem różnicy elektroujem- ności heteroatomu i sąsiadującego atomu (tiazol > imidazol > oksazol) [142]. 19 Rysunek 15. Azole i ich podział ze względu na budowę. Układ azolowy często występuje w środkach o działaniu zarówno przeciwgrzybicznym [143,144] jak i przeciwbakteryjnym [145]. Są one tak powszechne, że zanieczyszczenie wody w środowisku związkami zawierającymi azole jest realnym problemem, skutkującym nie tylko możliwym działaniem toksycznym dla ludzi i zwierząt, ale też podnoszeniem odporności pato- genów na środki przeciwdrobnoustrojowe [146]. 4.1. Imidazol i pirazol Rysunek 16. Wzory imidazolu i pirazolu wraz z numeracją atomów węgla i azotu. Jednym z najważniejszych przedstawicieli azoli jest imidazol (Rys. 16), pięcioczłonowy pierścień z dwoma atomami azotu w pozycjach 1 i 3. Jego ugrupowanie znajduje się w histy- dynie, aminokwasie białkowym (Rys. 17A), a także jej pochodnej histaminie, hormonie 20 będącym podstawowym mediatorem stanu zapalnego [147]. Połączony z pirymidyną tworzy purynę [148], podstawowy szkielet adeniny i guaniny (Rys. 17B, C), związków wchodzących w skład nukleotydów kwasów nukleinowych [149]. Rysunek 17. Wzory histydyny (A), adeniny (B) i guaniny (C). Izomerem imidazolu jest pirazol (Rys. 16), którego dwa atomy azotu znajdują się w pozycjach 1 i 2 pierścienia i są ze sobą połączone. Obecność wiązania N-N sprawia, że pira- zol jest mniej stabilny niż imidazol [150] i rzadziej występuje przyrodzie [151]. Ma również wpływ na mniejszą zasadowość pirazolu - bliskość drugiego atomu azotu sprawia, że kation pirazolowy jest destabilizowany przez jego elektronoakceptorowy charakter, podczas gdy ka- tion imidazolowy jest stabilizowany przez efekt indukcyjny. [152] Zarówno pirazol jak i imidazol występują w dwóch nieodróżnialnych formach tautome- rycznych (Rys. 18A, B), w których atom wodoru jest przeniesiony z jednego atomu azotu na drugi [153]. Formy pośrednie, niearomatyczne, są niestabilne [154]. Z kolei przykładem związku, który występuje głównie w jednej formie tautomerycznej jest indazol (benzpirazol). Z uwagi na większą aromatyczność pierścienia benzenowego preferowana jest forma z atomem wodoru przyłączonym do atomu azotu N1 (Rys. 18C) [155]. Rysunek 18. Struktury tautomeryczne imidazolu (A), pirazolu (B) i indazolu (C). 21 W przypadku podstawionych pochodnych pirazolu i imidazolu zazwyczaj dominuje jedna z form tautomerycznych. Przykładowo, w podstawieniu w pozycji C3(5) pirazolu, pod- stawniki wyciągające elektrony preferują pozycję C3, a te dostarczające elektrony – C5 [153]. W 4(5)-nitro- i 4(5)-fenyloimidazolu natomiast dominują formy podstawione w pozycji C4 [153,156]. 4.1.1. Właściwości biologiczne imidazoli Pochodne imidazolu wykazują wiele właściwości biologicznych i od lat cieszą się du- żym zainteresowaniem naukowców [157–160]. Są wykorzystywane między innymi jako leki. Przykładem mogą być metronidazol (Rys. 19A) [161] i pretomanid (Rys. 19B) [162], będące antybiotykami, tipifarnib (Rys. 19C) [163] o działaniu przeciwnowotworowym czy losartan, stosowany w leczeniu nadciśnienia tętniczego (Rys. 19D) [164]. Rysunek 19. Leki zawierające w strukturze imidazol: metronidazol (A), pretomanid (B), tipifarnib (C), losartan (D). Związki zawierające pierścień imidazolu powszechnie występują w naturze w postaci alkaloidów imidazolowych [165]. Wyizolowano je między innymi z pieprzycy peruwiańskiej (Lepidium meyenii) [166], drzew z rodziny rutowatych (Rutaceae) [167] i organizmów mor- skich, takich jak gąbki [168]. Pilokarpina jest naturalnym alkaloidem imidazolowym, który znalazł zastosowanie w medycynie. Ten pochodzący z potoślinu jaborandi (Pilocarpus jaborandi) związek jest ago- nistą receptorów muskarynowych i wywołuje pobudzenie gruczołów ślinowych, potowych i łzowych [169]. Dlatego też wykorzystywany jest w leczeniu jaskry [170] i starczowzroczności [171] oraz suchości jamy ustnej [172]. 22 Rysunek 20. Wzór pilokarpiny. Koniugaty zawierające w swojej strukturze pierścień imidazolowy wykazują właściwo- ści przeciwutleniające [173,174], przeciwbakteryjne [174,175], przeciwgrzybiczne [176,177], przeciwnowotworowe [178,179] oraz przeciwwirusowe [180,181]. Gao i in. zsyntezowali serię hybryd indolowo-imidazolowych i zbadali ich aktywność przeciwko sześciu szczepom grzybów [182]. Jeden z otrzymanych związków (Rys. 21A) inhi- bitował wzrost Gibberella zeae w 88%, lepiej od wszystkich stosowanych leków. Z kolei inna pochodna (Rys. 21B) wykazała najwyższą aktywność (97%) przeciwko Alternaria Leaf Spot. Generalnie związki zawierające w swojej strukturze atom halogenu miały większe właściwości grzybobójcze niż pozostałe hybrydy. W innych badaniach, Li i in. otrzymali koniugat zawierający pierścienie indolu, imida- zolu i piperydyny (Rys. 21C), który w zadowalającym stopniu powstrzymywał wzrost odpor- nego na metycylinę gronkowca złocistego [183]. Rysunek 21. Koniugaty indolowo-imidazolowe o właściwościach przeciwgrzybicznych. 23 4.1.2. Właściwości biologiczne pirazoli Pirazol jest obecny w wielu lekach o różnym działaniu, między innymi przeciwzapal- nym, antybakteryjnym czy przeciwbólowym [184–186]. Wśród zaakceptowanych do użytku farmaceutyków zawierających w swojej strukturze pierścień pirazolu są: aksytynib (Rys. 22A), stosowany w leczeniu raka nerki [187], lenacapavir (Rys. 22B) jako środek przeciwko HIV/AIDS [188], riociguat (Rys. 22C), będący lekiem na nadciśnienie płucne [189] lub silde- nafil (Rys. 22D) (znany pod nazwą handlową “Viagra”), używany w przypadku zaburzeń erek- cji [190]. Rysunek 22. Wzory leków zawierających pirazol: aksytynib (A), lenacapavir (B), riociguat (C), sildenafil (D). Jednym z celów syntezy związków hybrydowych pirazoli jest poszukiwanie nowych leków o właściwościach przeciwnowotworowych [191,192], przeciwmikrobowych [193,194] i przeciwcukrzycowych [195]. Hybrydy pirazolowe wykazują także aktywność antyoksyda- cyjną [196,197] i przeciwzapalną [198]. Jeden z koniugatów indolowo-pirazolowych otrzymanych przez Naglah i in. (Rys. 23A) charakteryzował się dobrym działaniem przeciwcukrzycowym i przeciwzapalnym [199]. Podobny związek (różniący się położeniem grupy fenolowej) oraz jego analog (Rys. 23B, C) inhibitowały wzrost czterech badanych szczepów bakterii (Bacillus subtilis, Escherichia coli, Aspergillus niger, Candida albicans) [200] oraz wykazywały właściwości przeciwnowotwo- rowe przeciwko rakowi wątroby [84]. Powyższe przykłady pokazują jak szerokie zastosowanie mogą mieć hybrydy indolowo-pirazolowe. 24 Rysunek 23. Koniugaty indolowo-pirazolowe o działaniu biologicznym. 4.2. Związki kompleksowe imidazolu Jednym z często występujących oddziaływań w metaloproteinach jest oddziaływanie między jonem metalu a fragmentem histydyny – imidazolem [201]. Atom azotu, którego wolna para elektronowa nie bierze udziału w tworzeniu układu aromatycznego, może tworzyć związki kompleksowe z metalami [202]. Przykładem są anhydrazy węglanowe, enzymy katalizujące odwracalną reakcję powstawania jonu wodorowęglanowego z wody i dwutlenku węgla. W ich centrum aktywnym znajduje się atom cynku, skoordynowany z trzema atomami azotu z imida- zolowego fragmentu histydyny oraz z jedną cząsteczką wody [203]. Jedną ze strategii otrzymywania związków biologicznie aktywnych jest synteza związ- ków kompleksowych – układów o lepszych właściwościach biologicznych i fizyko-chemicz- nych niż związki wyjściowe. Znanych jest wiele kompleksów pochodnych imidazolu z meta- lami wykazujących aktywność przeciwnowotworową [204,205], przeciwzapalną [206] i prze- ciwbakteryjną [207]. Rysunek. 24. Kompleks nafazoliny z Pd (II). 25 Nafazolina jest lekiem stosowanym w leczeniu kataru, zapalenia zatok i spojówek, zawierającym w swojej strukturze pierścień imidazoliny, będący częściowo uwodornioną pochodną imidazolu [208]. Ramezanpour i in. otrzymali kompleks nafazoliny z palladem (II) (Rys. 24) i wykazali jego działanie przeciwnowotworowe przeciwko nowotworom szyjki ma- cicy i piersi [204]. Skuteczność przeciwko nowotworowi piersi wykazywały także kompleksy pochodnych imidazolu z cynkiem (II) i miedzią (II), otrzymane przez Mahdy i in. [205]. Te zawierające atom miedzi charakteryzowały się nie tylko silną inhibicją komórek nowotworowych, ale też wysoką selektywnością. Dodatkowo, wszystkie otrzymane kompleksy były bardziej stabilne termicznie niż wyjściowe ligandy. 26 Wyniki badań Stres oksydacyjny powstaje w momencie, gdy w organizmie zaburzona jest równowaga między utleniaczami a przeciwutleniaczami, na korzyść tych pierwszych. Do oksydantów zali- cza się reaktywne formy tlenu (ROS, ang. Reactive Oxygen Species), zarówno rodnikowe (anio- norodnik ponadtlenkowy O2 •-, hydroksylowy OH•, nadtlenkowy RO2 •, wodoronadtlenkowy HO2 •), jak i nierodnikowe (nadtlenek wodoru H2O2, tlen singletowy 1O2, kwas podchlorawy HOCl i ozon O3). Powstają one w organizmie w procesach enzymatycznych i nieenzymatycz- nych, ale mogą także pochodzić ze źródeł zewnętrznych, takich jak żywność, promieniowanie UV lub zanieczyszczenie środowiska [209]. W organizmie żywym komórki za pomocą szeregu mechanizmów antyoksydacyjnych są w stanie neutralizować wolne rodniki lub minimalizować ich powstawanie. Za usuwanie ROS z systemów biologicznych są odpowiedzialne między innymi enzymatyczne przeciwutle- niacze. Dysmutaza ponadtlenkowa katalizuje konwersję O2 •- do H2O2, podczas gdy H2O2 może zostać zredukowany do wody przez katalazę lub peroksydazę glutationową. Z kolei rodniki hydroksylowe, które są generowane w reakcji Fentona z H2O2 w obecności Fe (II) lub Cu (I), są neutralizowane przez peroksydazę glutationową [210]. Oprócz wspomnianych wyżej mechanizmów endogennych, antyoksydanty mogą być także dostarczane do organizmu z zewnątrz, w pożywieniu czy kosmetykach. Najpopularniej- szymi przeciwutleniaczami obecnymi w diecie są witaminy A, C i E, a także flawonoidy i alkaloidy [211,212]. Jedną z grup alkaloidów wykazujących właściwości antyoksydacyjne są alkaloidy indolowe [213]. Poszukując nowych związków o aktywności przeciwutleniającej, za cel swojej pracy doktorskiej wybrałam syntezę koniugatów indolowo-azolowych, w których ugrupowanie azolowe połączone jest z pierścieniem indolowym w pozycji C3 łącznikiem metylenowym. Określiłam właściwości hemolityczne związków, ich zdolność do chelatowania jonów żelaza Fe+2 oraz aktywność cytoprotekcyjną w warunkach indukowanego stresu oksydacyj- nego. Dodatkowo przeanalizowałam właściwości przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze związ- ków, a także ich parametry fizykochemiczne, pozwalające określić podobieństwo otrzymanych pochodnych do leków. Wykorzystanie dokowania molekularnego pozwoliło na poznanie powi- nowactwa koniugatów do enzymów uczestniczących w stresie oksydacyjnym. Dzięki przeprowadzonej kompleksowej analizie aktywności biologicznej i właściwości fizykochemicznych otrzymanych pochodnych została określona zależność między strukturą chemiczną związku a jego właściwościami biologicznymi. 27 5. Synteza 5.1. Synteza koniugatów indolowych Związkiem wyjściowym w moich syntezach była gramina (1), alkaloid indolowy sze- rzej omówiony w części literaturowej pracy. Grupa dimetyloaminowa w pozycji C3 pierścienia indolowego w graminie pod wpływem temperatury (>80°C) łatwo odchodzi, a powstały pro- dukt pośredni chętnie reaguje z nukleofilem [128]. Dlatego funkcjonalizacja tej pozycji jest bardzo dobrym sposobem syntezy bardziej złożonych struktur lub związków wyjściowych do dalszej modyfikacji. Mechanizm przeprowadzonych przeze mnie reakcji został przedsta- wiony na Rysunku 12A. Otrzymane koniugaty ze względu na strukturę można podzielić na trzy grupy: 1) indolowo-imidazolowe (2 – 9), 2) indolowo-azolowe z grupą tionową w pozycji C2/C3 azolu (tioketony) (10 – 23), 3) indolowo-pirazolowe (24 – 40). Związki 2, 9, 24 i 29 były już wcześniej opisane w literaturze w publikacjach autorstwa Jasiewicz i in. (2) [124], Pillaiyar i in. (9) [214] oraz Cravotto i in. (24, 29) [215]. Jednak ze względu na przeprowadzenie dodatkowych badań biologicznych (2, 9, 24, 29), określenie struktury krystalograficznej (24, 29) oraz dokładniejszy opis syntezy (24, 29) zostały uwzględ- nione w tym opracowaniu. Schemat 1. Schemat syntezy koniugatów indolowo-imidazolowych 2 – 9. Pierwszą grupę otrzymanych przeze mnie związków stanowią koniugaty indolowo-imi- dazolowe (2 – 9). Otrzymałam je w wyniku reakcji graminy z odpowiednim substratem imida- zolowym. Reakcja prowadzona była w temperaturze wrzenia toluenu przez 2-8 godzin (Sche- mat 1). Większość otrzymanych pochodnych to ciała stałe. Wyjątkiem był koniugat graminy z 4,5-dichloroimidazolem (7), który miał postać ciemnoróżowego oleju. Dla czterech 28 z otrzymanych ośmiu pochodnych, po krystalizacji z toluenu, możliwe było wykonanie badań krystalograficznych. Stosując takie same warunki reakcji otrzymałam związki 19 i 20, należące do drugiej grupy pochodnych. Syntezy pozostałych koniugatów indolowo-tioketonowych prowadzone były w etanolu, przy czym związki 10 – 17 wymagały warunków zasadowych i nadmiaru sub- stratu azolowego (Schemat 2). Co ciekawe, w syntezach z imidazolino-2-tionem, 2-merkapto- beznimidazolem i 3-merkapto-1,2,4-triazolem oprócz przewidywanych produktów (10, 14, 22) otrzymałam także pochodne dimeryczne z dwoma ugrupowaniami indolowymi przyłączonymi do dwóch atomów azotu pierścienia azolowego (11, 15, 23). Związki 22 i 23 rozdzieliłam za pomocą chromatografii kolumnowej. W przypadku koniugatów 10, 11, 14 i 15 najpierw podczas krystalizacji tworzył się dimer (11, 15), a po odsączeniu go, z pozostawionego przesą- czu wypadał monomer (10, 14). Schemat 2. Schemat syntezy koniugatów indolowo-tioketonowych 10 – 23. Warunki reakcji: a) pierw- szy etap: EtOH, NaOH, drugi etap: EtOH, reflux, 3 – 14 h (gramina:azol 1:2); b) PhCH3, reflux, 2 – 8 h; c) EtOH, reflux, 5 – 10 h. Syntezy pochodnych trzeciej grupy (reakcje graminy z pochodnymi pirazolu) prowa- dzone były w takich samych warunkach w jakich prowadziłam syntezę pochodnych pierwszej grupy. Czas reakcji, w porównaniu do syntez z imidazolami, był jednak znacznie dłuższy. Sto- sowałam także dwukrotny nadmiar pochodnej azolowej (Schemat 3). Niektóre z wykorzysta- nych substratów były niesymetryczne, co sugerowało możliwość otrzymania dwóch produktów 29 reakcji. Jednak w reakcjach graminy z 5-izopropylopirazolem i 5-metoksypirazolem powstawał jeden produkt, z podstawnikiem w pozycji C5 (28, 31). Jest to zgodne z tendencją pirazolu do występowania w formie tautomerycznej podstawionej elektronodonorowym podstawnikiem w tej pozycji [153]. W przypadku reakcji graminy z 4-bromo-3-metylopirazolem otrzymałam dwa produkty reakcji, związki 36 i 37, w stosunku 0,36:0,64. Związki te rozdzieliłam chroma- tograficznie. Natomiast reakcja graminy z 4-bromo-5-metylopirazolem zdawała się dawać tylko jeden produkt, z grupą metylową w pozycji C5 pirazolu, co sugerowały widma NMR, na których brak było sygnałów innych niż pochodzących od związku 38. Koniugat 39 został zidentyfikowany dopiero dzięki badaniom krystalograficznym. Okazało się, że kryształy związku 38 są mieszaniną dwóch tautomerów: związków 38 i 39, w stosunku 0,92:0,08. Schemat 3. Schemat syntezy koniugatów indolowo-pirazolowych 24 – 40. 5.2. Synteza kompleksów koniugatów indolowo-imidazolowych z chlorkiem cynku Cynk należy do grupy biometali, a jego jony są obecne w centrach aktywnych wielu enzymów, pełniąc rolę kofaktora i stabilizując ich strukturę [216]. Jest wykorzystywany w pro- cesach komórkowych, występuje w strukturze tkanki kostnej, a także jest niezbędny do prawi- dłowego funkcjonowania układu odpornościowego [217]. Działanie antyoksydacyjne cynku związane jest z jego zdolnością do inhibicji oksydazy NADPH (proutleniającego enzymu), sta- bilizacji struktury molekularnej błony komórkowej oraz indukcji syntezy metalotionein (białek uczestniczących w detoksykacji organizmów) [218]. Kompleksy związków organicznych z cynkiem wykazują właściwości przeciwutlenia- jące, przeciwnowotworowe i przeciwmikrobowe [206,219–222]. Ich aktywność często jest po- równywalna lub wyższa od aktywności ligandów wyjściowych. Bardzo często są też bardziej 30 biodostępne, selektywne i wykazują mniej skutków ubocznych. Tak jest w przypadku kom- pleksu indometacyny (niesteroidowego leku przeciwzapalnego) z cynkiem, który zachowuje jej właściwości, jednocześnie zmniejszając toksyczność względem układu pokarmowego [223]. Koniugaty indolowo-imidazolowe, dzięki obecności wolnej pary elektronowej na ato- mie azotu w pierścieniu imidazolu mogą tworzyć związki kompleksowe z solami metali. Do swoich syntez wybrałam chlorek cynku, ze względu na wspomniane wyżej właściwości cynku, a także obecność przeciwjonu chlorkowego w środowisku zarówno zewnątrz- jak i we- wnątrzkomórkowym. Schemat 4. Schemat syntezy kompleksów koniugatów indolowo-imidazolowych z chlorkiem cynku. Synteza kompleksów K2 – K9 przedstawiona została na Schemacie 4. Wszystkie reak- cje prowadzone były poprzez mieszanie substratów w stosunku 2:1 (koniugat:ZnCl2) w meta- nolu (K2 – K8) lub w mieszaninie CH3CN:MeOH (2:1) (K9). W przypadku syntezy dwóch związków kompleksowych (K2 i K5) konieczne było ogrzewanie mieszaniny. Po kilku dniach krystalizacji otrzymałam kompleksy K2 – K9, przy czym związki K2 i K9 wymagały dodat- kowej krystalizacji z MeOH. 5. Analiza spektroskopowa otrzymanych związków Struktury wszystkich otrzymanych związków potwierdziłam za pomocą analizy spek- troskopowej (spektroskopia FT-IR i 1H NMR, 13C NMR) oraz spektrometrii mas. 31 W widmach 1H NMR wszystkich nowo zsyntetyzowanych związków (2 – 40) obecne są sygnały diagnostyczne dla protonów układu indolowego w zakresie 6.20 – 7.85 ppm. Ponadto, w obszarze aromatycznym obserwuje się sygnały pochodzące od protonów pierścieni: imidazolowego (6,69 – 8,19 ppm; 2 – 8, K2 – K8), benzimidazolowego (7,17 – 8,78 ppm; 9, K9), pirazolowego (5,61 – 8,02 ppm; 24 – 38), indazolowego (8,03 – 8,80 ppm; 40), imidazo- lino-2-tionowego (3,22 – 3,39 ppm; 11, 12), imidazolo-2-tionowego (6,86 – 7,04 ppm 13, 14), benzimidazolo-2-tionowego (7,10 – 7,98 ppm; 14 – 16), tiazolino-2-tionowego (3,20 – 3,93; 17), tiazolo-2-tionowego (6,94 – 7,56, 18), benztiazolo-2-tionowego (7,30 – 7,84; 19), benzok- sazolo-2-tionowego (7,07 – 7,84; 20, 21) oraz 1,2,4-triazolo-3-tionowego (8,36 – 8,37 ppm; 22, 23). Charakterystyczny singlet pochodzący od protonu grupy NH układu indolowego znaj- duje się przy ok. 11 ppm, natomiast w związkach zawierających pierścień imidazolino-2-tio- nowy (11), imidazolo-2-tionowy (13) i 1,2,4-triazolo-3-tionowy (22) sygnał od protonu grupy NH azolu obecny jest w przedziale 12 – 14 ppm. We wszystkich widmach obecny jest także singlet przy ok. 5 ppm, pochodzący od dwóch protonów mostka metylenowego. Przy niższych wartościach przesunięcia chemicznego (1 – 4 ppm) obserwujemy sygnały pochodzące od pro- tonów podstawników alkilowych (3 – 6, 13, 16, 21, 25 – 31, 36 – 38). W widmach 13C NMR wszystkich analizowanych pochodnych sygnały pochodzące od atomów węgla pierścienia indolowego obserwowane są w zakresie 108 – 138 ppm. Sygnały przy około 118 – 152 ppm zostały przypisane do atomów węgla pierścienia imidazolowego (2 – 8, K2 – K8), przy 108-146 ppm do atomów węgla pierścienia benzimidazolowego (9, K9), a przy 101 – 154 i 109 – 142 ppm do atomów węgla odpowiednio pierścienia pirazolowego (24 - 38) i indazolowego (40). W przypadku koniugatów drugiej grupy, sygnały od atomów węgla pierścieni azolo- wych znajdują się w zakresie 110 – 142 ppm (12, 13, 18, 22, 23), a od atomów węgla pierścieni benzazolowych przy 109 – 147 pmm (14 – 16, 19 – 21). Charakterystyczne sygnały dla atomów węgla grup tiokarbonylowych (11 - 23) znajdują się w zakresie 150 – 194 ppm. Związki, które mogłyby występować w dwóch formach tauto- merycznych, tiolowej i tionowej (10, 12, 14, 22, 23), przybierają postać tioketonową, co jest zgodne z danymi literaturowymi (Rys. 25). Forma ta jest bowiem dominująca w rozpuszczal- nikach polarnych i w stanie stałym [224,225]. Rysunek 25. Struktury tautomeryczne 2-merkaptoimidazolu. W rozpuszczalnikach polarnych i ciałach stałych dominuje forma tionowa związku (po lewej). 32 Sygnały od atomu węgla mostka metylenowego obecne są przy ok. 40 ppm. Ponadto w widmach 13C NMR pochodnych 3 – 6, 25 – 29, 36 – 38 widoczne są sygnały pochodzące od atomów węgla podstawników alkilowych odpowiednio przy: 8,69 – 20,92 dla grup -CH3, przy 58,81 ppm dla grupy metoksylowej oraz w zakresie 31,16 – 34,38 ppm dla grup N-mety- lowych. Wartości przesunięć chemicznych atomów węgla grupy –C≡CH (30) wynoszą odpo- wiednio 75,75 i 80,77 ppm. W widmach 13C NMR pochodnych zawierających atom halogenu w pierścieniu pirazo- lowym sygnał pochodzący od atomu węgla związanego z atomem Cl znajduje się przy 107,82 ppm (33), a z atomem Br przy 91,49 – 118,67 ppm (34, 36 – 38). W przypadku pochodnych z atomem fluoru (32) i jodu (35) obserwujemy rozszczepienie sygnałów atomów węgla. Sy- gnały te znajdują się odpowiednio przy 147,71, 150,12 oraz 56,52, 56,46 ppm. Wartości przesunięć chemicznych w widmach NMR (zarówno 1H jak i 13C) otrzyma- nych związków kompleksowych minimalnie różniły się od wartości przesunięć chemicznych odpowiednich ligandów, co jest dowodem na to, że reakcja kompleksowania nie powoduje zmiany konformacji koniugatów indolowo-azolowych. W widmach FT-IR otrzymanych koniugatów obecne jest charakterystyczne pasmo ab- sorpcji przy 3500–3200 cm−1 pochodzące od drgań rozciągających grupy NH niepodstawio- nego pierścienia indolu. W przypadku kompleksów (K2 – K9) pasmo to jest szersze i przesu- nięte w stronę niższych wartości liczby falowej, co ma związek z obecnością wiązań wodoro- wych stabilizujących strukturę cząsteczki. Aromatyczny charakter związków został potwierdzony przez obecność pasm absorpcji przy 2800 – 3050 cm-1, odpowiadającym drganiom rozciągającym grupy C-H oraz przy ok. 1600 cm-1 i 1500 cm-1, pochodzącym od drgań rozciągających wiązania C-C pierścienia aro- matycznego. W widmie FT-IR związku 30 obserwowane jest pasmo absorpcji przy 2117 cm-1, odpo- wiadające drganiom rozciągającym grupy C≡C. Pasma absorpcji pochodzące od drgań rozcią- gających C=C są obserwowane w tym samym regionie co pasma absorpcji grupy C=N (1500 – 1660 cm-1). W widmach koniugatów drugiej grupy, w zakresie 1000 – 1300 cm-1, obecne są także pasma absorpcji przypisywane drganiom rozciągającym wiązania C=S. Ponadto w widmach wszystkich związków obserwujemy dwa pasma absorpcji charakterystyczne dla pierścienia in- dolowego, przy ok. 620 cm-1 i 575 cm-1. W widmach EI-MS wszystkich nowo zsyntetyzowanych koniugatów obecne są sygnały odpowiadające jonom molekularnym oraz sygnał przy m/z = 130 (C9H8N)+ pochodzący od fragmentu indolowego. 33 6. Struktura w krysztale Dla większości otrzymanych przeze mnie koniugatów indolowych (4, 5, 8, 10, 12, 13, 15 – 20, 24 – 29, 32 – 35 i 38, 39) oraz dla pięciu kompleksów (K2, K3, K5, K6, K8) możliwe było wykonanie analizy krystalograficznej. Analiza RTG otrzymanych pochodnych wykazała, że główny szkielet wszystkich ana- lizowanych koniugatów składa się z dwóch podjednostek połączonych mostkiem metyleno- wym, z których każda zawiera pierścienie aromatyczne. Związki 4, 24, 26 i 32 krystalizują jako dwie niezależne cząsteczki, natomiast 38 i 39 krystalizują razem w stosunku 0,92 : 0,08. W związkach pierwszej grupy (4, 5 i 8) pierścień imidazolowy leży prawie w płaszczyź- nie łącznika metylenowego, a fragment indolowy jest znacznie poza tą płaszczyzną. Związki te są zaangażowane głównie w wiązania wodorowe N-H···N, łączące cząsteczki w długie łańcu- chy. Wszystkie pochodne drugiej grupy występują w ciele stałym, podobnie jak w roztworze, w formie tionowej. Średnia wartość długości wiązania C=S w koniugatach 10, 12, 13, 15 i 16 wynosi 1,685(7) A (wartość leżąca pomiędzy wartościami typowymi dla wiązań pojedynczych i podwójnych). Jest to prawdopodobnie efekt obecności struktur zwitterjonowych w cząsteczce (Rys. 26). Rysunek 26. Struktury rezonansowe w imidazolino-2-tionie. Na szczególną uwagę zasługuje konformacja związku 18, zawierającego pierścień imi- dazolo-2-tionowy, Jak pokazano na Rys. 27A, grupa tiokarbonylowa tej pochodnej może pełnić rolę akceptora pięciu wiązań wodorowych. W przeciwieństwie do związku 18, w pochodnej 19 z ugrupowaniem benzimidazolo-2-tionowym grupa C=S nie bierze udziału w oddziaływaniach międzycząsteczkowych. W związku tym pierścień indolowy leży blisko płaszczyzny metyle- nowej a grupa benzotiazolo-2-tionowa jest poza tą płaszczyzną. Taka konformacja sprzyja two- rzeniu wewnątrzcząsteczkowego wiązania wodorowego między grupą metylenową C-H będącą donorem a grupą S=C pełniącą rolę akceptora (Rys. 27B). W przypadku koniugatu 20 oba pier- ścienie, indolowy i benzoksazolo-2-tionowy, są prawie prostopadłe do płaszczyzny metyleno- wej, co jest mniej korzystne dla tworzenia wewnątrzcząsteczkowego wiązania wodorowego C-H···S. Grupa S=C w związku 20 tworzy wiązania wodorowe z ugrupowaniem N-H kolej- nych cząsteczek (Rys. 27C), podczas gdy donorowa grupa N-H w kryształach 19 zaangażowana jest 34 w międzycząsteczkowe oddziaływania N-H···π z częścią benzenową pierścienia indolowego innej cząsteczki. Rysunek 27. Struktura koniugatów 18, 19 i 20. Grupa tionowa w związku 18 jest akceptorem pięciu wiązań wodorowych (A). Grupa N-H pochodnej 19 bierze udział w międzycząsteczkowych oddziały- wania N-H···π z pierścieniem indolowym kolejnej cząsteczki (B). W związku 20 powstają wiązania N-H···S=C oraz oddziaływania stackingowe między ugrupowaniami benzoksazolo-2-tionowymi (C). Interesujące są także supramolekularne struktury pochodnych trzeciej grupy. Związki te łączą się głównie w łańcuchy utworzone przez cząsteczki powiązane płaszczyzną ślizgową (25, 27, 28, 33 – 35) lub, w przypadku związku 32, zbudowane z dwóch niezależnych cząste- czek o przeciwnej helikalności. Pozostałe koniugaty albo tworzą helisy (24, 28), albo łączą się w dimery (29) lub tetramery (26) (Rys. 28.). Warto również zwrócić uwagę na izostrukturalność związków 25 i 33, które zawierają odpowiednio podstawniki metylowe i chlorowe w pozycji C4 pirazolu. Izomorfizm wynikający 35 z podstawienia Me/Cl nie jest rzadkością i jest skutkiem podobnej wielkości tych podstawni- ków [226]. Rysunek 28. Supramolekularne struktury koniugatów indolowo-pirazolowych. Dimery w kryształach 29 (A), tetramery w kryształach of 26 (B), łańcuchy w kryształach 25 (C), dwie przeciwległe helisy w kryształach 24 (D). W kryształach kompleksów jon Zn2+ jest otoczony przez dwa atomy azotu pochodzące od pierścienia imidazolowego oraz dwa jony chlorkowe. Porównując ze sobą struktury ligan- dów (4, 8) i kompleksów (K4, K8) widać dużą zmianę w kątach torsyjnych w przypadku ko- niugatu z podstawnikiem izopropylowym (4, K4), podczas gdy struktura pochodnej z grupą fenylową (8) pozostaje niemal niezmieniona. 36 7. Badania biologiczne 7.1. Aktywność hemolityczna Czerwone krwinki (RBC – ang. red blood cells) stanowią modele komórkowe wyko- rzystywane między innymi do badań właściwości cytotoksycznych związków. Są łatwo do- stępne i nie posiadają jądra oraz organelli komórkowych. W zetknięciu z czynnikami zewnętrznymi, takimi jak wolne rodniki czy toksyny, może dojść do przerwania błony komórkowej erytrocytów i hemolizy – uwolnienia hemoglobiny do osocza krwi (Rysunek 29). Rysunek 29. Schemat procesu hemolizy. Związki, które powodują hemolizę w stopniu mniejszym niż 10% są uznawane za he- mokompatybilne i mogą mieć zastosowanie w medycynie i produktach biomedycznych [227]. W publikacjach [P1 - P3] zostało przyjęte bardziej rygorystyczne kryterium (< 5%), ale dla ujednolicenia wyników, w tej pracy przyjęłam granicę hemokompatybilności równą 10%. Wszystkie otrzymane przeze mnie koniugaty oraz kompleksy zostały zbadane we współpracy z Zakładem Biologii Komórki Wydziału Biologii UAM pod kątem aktywności hemolitycznej. Jedynie dziesięć z nich (9, K9, 16, 26, 27, 33, 34, 35, 38, 40) nie jest hemokom- patybilnych. Wśród koniugatów indolowo-imidazolowych widać zależność między rodzajem pod- stawnika obecnego w pierścieniu imidazolowym a aktywnością hemolityczną związku (Rys. 30A). Aktywność hemolityczna pochodnych indolu z podstawnikami elektronodonorowymi przy pierścieniu imidazolowym wynosiła poniżej 5%. Związki z grupami elektronoakceptoro- wymi wykazywały wyższą aktywność hemolityczną, przy czym najbardziej hemolityczna była pochodna z benzimidazolem, dla której wartość aktywności hemolitycznej wynosiła 23,38 ± 2,60%. Kompleksowanie z chlorkiem cynku obniżyło tę wartość do 12,96 ± 0,89%. Spadek wartości aktywności hemolitycznej powstałych kompleksów w stosunku do wartości aktywno- ści hemolitycznej ligandów był obserwowany także w przypadku kompleksów K2 i K3, odpowiednio z 3,27 ± 0,30% na 1,28 ± 0,30% i z 3,609 ± 1,19% na 1,20 ± 0,01%. 37 Rysunek 30. Wykresy aktywności hemolitycznej związków 2 – 9 i K2 – K9 (A), 10 – 23 (B) oraz 24 – 40 (C), badania wykonywano w stężeniu 0,1 mg/ml. Przerywana linia na poziomie 10% to granica, poni- żej której związki są uznawane za hemokompatybilne. 0 5 10 15 20 25 30 2 K2 3 K3 4 5 K5 6 K6 7 8 K8 9 K9 A k ty w n o ść h em o li ty cz n a [ % ] A) Koniugaty indolowo-imidazolowe i kompleksy 0 5 10 15 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 A k ty w n o ść h em o li ty cz n a [ % ] B) Koniugaty indolowo-tioketonowe 0 10 20 30 40 50 60 70 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 40 A k ty w n o ść h em o li ty cz n a [ % ] C) Koniugaty indolowo-pirazolowe 38 Większość pochodnych drugiej grupy to związki hemokompatybilne (Rys. 30B). Wyż- sze wartości aktywności hemolitycznej zaobserwowano dla koniugatów zawierających w swo- jej strukturze dwie grupy indolowe. Wpływ względów sterycznych na wzrost aktywności he- molitycznej jest oczywisty, gdy porównamy wartości aktywności hemolitycznej par monomer- dimer: 10 (2,5% ± 0,1) i 11 (7,0% ± 0,9); 14 (4,6% ± 0,4) i 15 (8,0% ± 1,3) oraz 22 (2,8% ± 0,1) i 23 (21,8% ± 1,0). Najwyższą aktywność hemolityczną (11,08 ± 2,04%) wykazywał koniugat graminy z 1-metylobenzimidazolo-2-tionem (16), będący jedynym niehemokompatybilnym związkiem z drugiej grupy. Pochodna 14, bez grupy metylowej przy atomie azotu w pierścieniu benzimi- dazolowym, wykazała aktywność hemolityczną na poziomie 4,55 ± 0,41%. Ten ponad dwu- krotny spadek wartości aktywności hemolitycznej może być skutkiem różnicy w interakcji tych dwóch związków z dwuwarstwą lipidową RBC. Powodem jest zmiana w konformacji cząstecz- kowej, związana z obecnością grupy metylowej. Podobnego efektu nie zaobserwowano porów- nując wartości aktywności hemolitycznej pochodnej 21 z aktywnością cząsteczki bez grupy metylowej przy atomie węgla C5 (20), jak również niemetylowanego związku 12 z N-metylo- wanym związkiem 13. W obu przypadkach wartości aktywności hemolitycznej były podobne i znajdowały się poniżej granicy hemokompatybilności. Większość hybryd indolowo-pirazolowych była hemokompatybilna (Rys. 30C) i wyka- zywała niskie wartości aktywności hemolitycznej. Otrzymane wyniki wskazały na korelację pomiędzy położeniem podstawników w pierścieniu pirazolowym analizowanych pochodnych a ich aktywnością hemolityczną. Przykładem tego jest porównanie wartości aktywności hemo- litycznej związków 27 i 28, zawierających podstawnik izopropylowy odpowiednio w pozycji C4 lub C5. Pochodna 27 wykazała ponad pięciokrotnie wyższą wartość aktywności hemoli- tycznej (27,90 ± 13,33%) niż wartość zaobserwowana dla związku 28 (4,54 ± 2,72%). Innym przykładem są pochodne 36 – 38, które mają pierścień pirazolowy podstawiony grupą metylową i atomem bromu. Wśród nich najwyższą aktywność hemolityczną (21,57 ± 17,74%) wykazał związek 38, w którym grupa metylowa znajdowała się w pozycji C3, a atom bromu w pozycji C5. Natomiast koniugaty 36 i 37, zawierające atom bromu w pozycji C4, a grupę metylową w C3 (37) lub C5 (36) były hemokompatybilne, a wartości aktywność hemolitycznej tych związków były zbliżone i wynosiły ok. 5%. Najwyższe wartości aktywności hemolitycznej w całej serii wykazały hybrydy z pod- stawnikami elektronoakceptorowymi w pozycji C4: Cl (33; 48,46 ± 8,49%), Br (34; 43,64 ± 7,74%) oraz I (35; 43,85 ± 21,08%). Wpływ podstawników na aktywność hemolityczną koniugatów indolowo-pirazolowych różnił się od tego obserwowanego dla pochodnych indolowo-imidazolowych. Związki pierw- szej grupy z podstawnikami alkilowymi w pierścieniu imidazolowym (3 – 6) wykazywały ak- tywność hemolityczną poniżej 5%. Natomiast wśród pochodnych indolowo-pirazolowych z podstawnikami alkilowymi jedynie związek 25 z grupą metylową w pozycji C4 pierścienia pirazolowego wykazał tak niską aktywność hemolityczną, wynoszącą 3,67 ± 0,87%. Wartości aktywności hemolitycznej koniugatów z podstawnikiem etylowym lub izopropylowym w po- zycji C4 (związki 26 i 27) były znacząco wyższe: 14,82 ± 12,43% i 27,90 ± 13,33%. 39 7.2. Aktywność przeciwutleniająca Badania właściwości antyoksydacyjnych zostały przeprowadzone we współpracy z Za- kładem Biologii Komórki Wydziału Biologii UAM. Zbadano aktywność cytoprotekcyjną (zdolność związków do ochrony RBC przed wolnymi rodnikami) wszystkich koniugatów pierwszej i drugiej grupy, wszystkich kompleksów i hemokompatybilnych związków indo- lowo-pirazolowych. Ponadto sprawdzono także właściwości chelatujące jony żelaza pochod- nych indolowo-imidazolowych i indolowo-tioketonowych. Krwinki czerwone są szczególnie narażone na utlenienie ze względu na ich rolę w trans- porcie tlenu i skład ich błony komórkowej, zawierającej wysoką zawartość wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w dwuwarstwie lipidowej [228]. Prowadzące do hemolizy zmiany w błonie RBC mogą być spowodowane zarówno przez reaktywne formy tlenu, jak i przez włą- czenie się biologicznie aktywnych cząsteczek do dwuwarstwy lipidowej. W badaniach aktywności antyoksydacyjnej wykorzystuje się związki mogące tworzyć wolne rodniki. Przykładem takiej cząsteczki jest 2,2′-chlorowodorek-azobis(2-amidynopro- panu (AAPH), który pod wpływem temperatury rozkłada się, wytwarzając przy tym rodniki nadtlenkowy i alkoksylowy (Rys. 31). Rysunek 31. Termiczny rozpad AAPH z wytworzeniem rodników nadtlenkowego i alkoksylowego. Na rysunku 32 przedstawiono wykresy zdolności otrzymanych związków komplekso- wych oraz analizowanych koniugatów indolowo-azolowych do inhibitowania hemolizy indu- kowanej przez wolne rodniki powstałe z rozkładu AAPH. Wyniki porównano z Troloxem, stan- dardowym antyoksydantem, będącym rozpuszczalną w wodzie formą witaminy E. Jak widać na rysunku 32A, aktywność cytoprotekcyjna koniugatów indolowo-imidazo- lowych zależy od rodzaju podstawnika obecnego w pierścieniu imidazolowym. W przypadku pochodnych z podstawnikami elektronodonorowymi wartości aktywności cytoprotekcyjnej wynoszą powyżej 60% i maleją w kolejności podstawników: metyl i etyl (6) > izopropyl (5) > etyl (4) > metyl (3). Dla pochodnej bez podstawnika w pierścieniu imidazolowym (2) oraz związków z podstawnikami elektronoakceptorowymi (7, 8, 9) aktywność cytoprotekcyjna przyjmuje wartości poniżej 50%. Reakcja kompleksowania pochodnych indolowo-imidazolowych z chlorkiem cynku znacząco poprawiła aktywność cytoprotekcyjną pochodnych 2 i 9, zwiększając jej wartość od- powiednio z 28,50 ± 5,00% na 81,15 ± 3,57% i z 23,98 ± 6,83% na 55,29 ± 13,27%. 40 Dla większości pochodnych drugiej grupy (10, 11, 13, 15, 16, 18, 20, 21, 23) aktywność cytoprotekcyjna przeciwko stresowi oksydacyjnemu przyjmowała wartości powyżej 50% (Rys. 32B). Najskuteczniejszymi pochodnymi były związki 10 i 13 z wartościami aktywności cytoprotekcyjnej powyżej 90%. Koniugaty 12, 14, 17, 19 i 22 wykazały zaskakująco niskie wartości aktywności przeci- wutleniającej (poniżej 20%). Wynika to prawdopodobnie z faktu, że związki 12, 14 i 22, po- dobnie jak 4-merkaptoimidazol [229], w fizjologicznym pH występują w formie jonu obojna- czego. Jon tiolanowy, w obecności rodników generowanych przez AAPH, zmienia się w wy- wołujący hemolizę RBC rodnik tiylowy. Natomiast niska aktywność cytoprotekcyjna koniu- gatu 17 może być spowodowana brakiem struktur rezonansowych, które mogłyby stabilizować powstałe wolne rodniki. Porównując ze sobą aktywność koniugatów 18, 19 i 20, zaskakuje brak właściwości antyoksydacyjnych pochodnej 19. Pomocna w wytłumaczeniu tego zjawiska może być analiza struktury krystalograficznej związku opisana w rozdziale 7. Struktura w krysztale. W przeci- wieństwie do koniugatów 18 i 20, w przypadku pochodnej 19 grupa C=S nie uczestniczy w oddziaływaniach międzycząsteczkowych. Fakt ten może wpływać na mniejszą zdolność związku do tworzenia układów supramolekularnych (np. oddziaływań ligand/receptor) w roz- tworze. W przypadku pochodnych trzeciej grupy, do badań właściwości cytoprotekcyjnych zo- stały wybrane tylko te koniugaty indolowo-pirazolowe, które były hemokompatybilne (związki 24, 25, 28 – 32, 36, 37). Wszystkie analizowane pochodne wykazały znaczącą aktywność cy- toprotekcyjną (>50%), chroniąc erytrocyty przed hemolizą wywołaną stresem oksydacyjnym (Rys. 32C). Wartości aktywności cytoprotekcyjnej związków z niepodstawionym pierścieniem pirazolu (85,99 ± 2,00%; 24) i pochodnej z grupą metylową w pozycji C4 pirazolu (84,94 ± 7,73%; 25) były porównywalne z wartością aktywności cytoprotekcyjnej standardo- wego przeciwutleniacza Troloxu (86,67 ± 1,28%). Ponadto znaczną aktywność cytoprotekcyjną (wartości aktywności około 80%) wykazały związki 29, 31 i 32. Wzrost aktywności cytopro- tekcyjnej wśród pozostałych koniugatów był zgodny z kolejnością podstawników: etynyl (30) < 5-izopropyl (28) < 4-bromo-3-metylo (37) < 3-bromo-4-metylo (36). 41 Rysunek 32. Wykresy aktywności cytoprotekcyjnej związków 2 – 9 i K2 – K9 (A), 10 – 23 (B), 24, 25, 28 – 32, 36, 37 (C), badania wykonywano w stężeniu 0,1 mg/ml. Wyniki są porównane z Troloxem (Tx; ns - różnica nieistotna statystycznie, p > 0,05, * p < 0,05, ** p < 0,01, and *** p < 0,001). Brak ak- tywności oznaczono jako „n.a.”. *** ns *** ns ns ns ** ns * *** * * * * 0 20 40 60 80 100 2 K2 3 K3 4 5 K5 6 K6 7 8 K8 9 K9 Tx In h ib ic ja h em o li zy i n d u k o w a n ej o k sy d a y jn ie [ % ] A) Koniugaty indolowo-imidazolowe i kompleksy ** *** n.a. ** *** *** *** *** *** n.a. *** *** *** *** 0 20 40 60 80 100 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 TX In h ib ic ja h em o li zy i n d u k o w a n ej o k sy d a y jn ie [ % ] B) Koniugaty indolowo-tioketonowe ns ns * * *** ns ns * ** 0 20 40 60 80 100 24 25 28 29 30 31 32 36 37 Tx In h ib ic ja h em o li zy i n d u k o w a n ej o k sy d a y jn ie [ % ] C) Koniugaty indolowo-pirazolowe 42 Oprócz zdolności związków do ochrony RBC przed hemolizą indukowaną oksydacyj- nie, miarą ich właściwości przeciwutleniających jest także zdolność do chelatowania jonów żelaza Fe+2. Kationy te są utleniane w reakcjach Haber–Weissa i Fentona do jonów Fe3+ z wy- tworzeniem rodnika hydroksylowego. Rysunek 33 przedstawia wykres aktywności chelatującej związków 2 – 23 oraz kwasu wersenowego (EDTA), standardowego chelatora. Koniugaty indolowo-imidazolowe z niepod- stawionym pierścieniem imidazolu (2) oraz z podstawnikami alkilowymi (3 – 6) wykazują wła- ściwości kompleksujące jony żelaza porównywalne do EDTA. Wśród pochodnych drugiej grupy jedynym związkiem o wartości aktywności chelatującej >90% jest pochodna 17. Wyróż- nia się ona na tle innych podobnych koniugatów faktem, że wolna para elektronowa na atomie siarki w pierścieniu tiolowym nie uczestniczy w rezonansie elektronowym i może brać udział w reakcji chelatowania. Rysunek 33. Wykres aktywności chelatującej jony Fe2+ związków 2 – 23. Wyniki są porównane z EDTA (ns - różnica nieistotna statystycznie, p > 0,05, * p < 0,05, ** p < 0,01, and *** p < 0,001). Brak ak- tywności oznaczono jako „n.a.”. 7.3. Aktywność przeciwbakteryjna Koniugaty indolowo-azolowe oraz kompleksy zostały zbadane pod kątem właściwości przeciwbakteryjnych przeciwko dwóm szczepom bakterii Gram-dodatnich (Micrococcus lu- teus, Bacillus subtilis) i dwóch Gram-ujemnych (Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens) (Tabela 1). Wybrane do badań szczepy są szeroko rozpowszechnione w środowisku naturalnym. Micrococcus luteus jest oportunistyczną bakterią występującą w glebie, pyle, wodzie i powie- trzu [230]. Laseczka sienna (Bacillus subtilis) to modelowy mikroorganizm wykorzystywany między innymi w badaniach podziału komórek, wydzielania białka czy ruchliwości powierzch- niowej [231]. Jest także odpowiedzialna za psucie się pieczywa – jego śluzowacenie [232]. Organizmem modelowym jest również pałeczka okrężnicy (Escherichia coli). Mimo że jest ns ns ns ns ** n.a. * * *** *** *** *** *** *** *** ns *** * * *** *** *** 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 ED TA A kt yw no ść c he la tu ją ca [% ] Koniugaty indolowo-imidazolowe i indolowo-tioketonowe 43 elementem naturalnej mikroflory ssaków, może wywoływać choroby układu pokarmowego i moczowego [233]. Pseudomonas fluorescens powszechnie występuje w glebie, wodzie, rośli- nach oraz mikrobiocie jelitowym. Powoduje choroby roślin i prawdopodobnie przyczynia się do chorób u ludzi [234]. Gramina (1) nie hamowała wzrostu żadnego z badanych szczepów bakterii, a większość koniugatów wykazała niską aktywność przeciwbakteryjną. Najlepsze okazały się związki za- wierające pierścień pirazolu. Koniugaty 33 i 34 wykazały umiarkowaną, a koniugat 24 wysoką aktywność przeciwko Micrococcus luteus. Związki 26, 27, 36 i 37 natomiast inhibitowały wzrost Pseudomonas fluorescens. Wśród koniugatów indolowo-imidazolowych najwyższą wartość wykazał związek z niepodstawionym imidazolem. Hamował on wzrost Micrococcus luteus oraz Pseudomonas fluorescens. Kompleksowanie z ZnCl2 w większości przyczyniło się do wzrostu aktywności przeciwbakteryjnej, ale nie była to znacząca zmiana. Tabela 1. Strefy zahamowania wzrostu szczepów bakterii. 10-15 mm – umiarkowana aktywność (kolor żółty), >15 mm – wysoka aktywność (kolor zielony). Bakteria Strefy zahamowania wzrostu [mm] Gramina, koniugaty indolowo-imidazolowe i kompleksy 1 2 K2 3 K3 4 5 K5 6 K6 7 8 K8 9 K9 M. luteus 0 21 10,6 3 6 8,8 3 3,7 6 2,4 5 8,6 8 4,3 7,6 B. subtilis 0 3,3 4 1 4 4,3 1,8 3 2,4 2,3 8,7 3,7 4 2,7 4,8 E.coli 0 4 5 1 4,3 3,8 3 3,5 3,5 3,7 4,3 5 5 3 4 P. fluorescens 0 14,7 3 16 3,4 3 0 0 2,3 3,3 0 0 4 0 4 Koniugaty indolowo-tioketonowe 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M. luteus 3,3 1 1 3,8 3,5 4 1,8 1,3 3 0 2,6 4 1 2 B. subtilis 4,5 1 2 5 3,3 2,3 1 2 4,2 0 0 0 0 3 E.coli 2 1 0 2 1 1 1 1 0 0 1 2,7 0 0 P. fluorescens 4 1 1,5 4 2 2 1 3 4 0 0 0 1 5,5 Koniugaty indolowo-pirazolowe 24 25 26 27 28 29 32 33 34 35 36 37 38 M. luteus 16 3,5 6,5 7 4,5 4.5 5.5 12,5 11 8 5,5 5 5,5 B. subtilis 0 4 8 7 0 6,5 4 7 7,5 6 8,5 7 4 E.coli 6 6 21 16,8 6 5 6 5,5 5,5 5,5 16 16 6 P. fluorescens 0 3,5 0 0 2 6,5 3 7,5 6 6 0 0 3 7.4. Aktywność przeciwgrzybiczna Aktywność przeciwgrzybiczna koniugatów indolowo-imidazlowych oraz dwóch koniu- gatów drugiej grupy (19, 20) została zbadana przeciwko szczepom grzybów odpowiedzialnym za choroby drewna: Coriolus versicolor, Poria placenta, Coniophora puteana i Gloeophyllum trabeum. Badania wykonano we współpracy z Katedrą Chemicznej Technologii Drewna, Wy- działu Leśnego i Technologii Drewna Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu. 44 Tabela 2 przedstawia zdolność związków 1 – 9, 19 i 20 do hamowania wzrostu grzy- bów. Wszystkie koniugaty w najwyższym badanym stężeniu (0,1%) w 100% inhibitowały wzrost grzybów. W niższych stężeniach najlepsza okazała się pochodna z 4,5-dichloroimidazo- lem (7). Warto też zaznaczyć aktywność związków 19 i 20, należących do drugiej grupy po- chodnych, które inhibitowały wzrost Poria placenta i Coniophora puteana, grzybów wykazu- jących dużą odporność na fungicydy. Tabela 2. Aktywność przeciwgrzybiczna związków 2 – 9 , 19, 20. Wartości powyżej 50% zahamowania wzrostu grzyba zaznaczono na zielono. Grzyb Stężenie Związek [%] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 19 20 Conipora puteana 0,1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0,01 51 41 48 37 26 49 74 48 40 57 44 0,001 40 0 0 15 14 37 46 0 0 40 43 0,0001 41 0 0 13 13 40 0 0 0 0 0 Gleophyllum trabeum 0,1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0,01 17 40 44 30 17 27 91 53 48 59 47 0,001 12 20 19 11 16 9 51 18 28 38 39 0,0001 12 20 15 8 12 13 28 13 17 0 17 Poria placenta 0,1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0,01 40 47 48 32 21 41 78 45 37 71 64 0,001 25 20 0 18 6 0 35 17 23 54 56 0,0001 14 0 0 16 1 4 0 0 0 34 0 Coriolus versicolor 0,1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 0,01 35 33 35 43 43 44 96 41 44 49 26 0,001 22 19 1 13 12 19 23 13 6 20 2 0,0001 18 0 0 6 13 19 0 7 0 0 0 Kompleksy oraz wybrane koniugaty graminy z tioketonami i pochodnymi pirazolu zo- stały zbadane pod kątem aktywności grzybobójczej względem szczepów grzybów Alternaria alternata, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum i Botrysis cinera, będących patoge- nami roślin oraz Trichoderma harzianum i Trichoderma atroviride, naturalnych fungicydów (Tabela 3). Podobnie jak w przypadku badań przeciwbakteryjnych, najaktywniejsze okazały się ko- niugaty zawierające pierścień pirazolu. Wszystkie wykazały aktywność przeciwko przynajm- niej jednemu szczepowi grzybów, przy czym związki z 2-fluoropirazolem (32), 2-chloropira- zolem (33) i 2-bromopirazolem (34) inhibitowały wzrost wszystkich sześciu szczepów w stop- niu przynajmniej umiarkowanym. Druga grupa pochodnych okazała się szczególnie aktywna przeciwko Botrysis cinera. Pięć związków (11, 18, 21 – 23) wykazało wysoką wartość strefy zahamowania wzrostu tego 45 szczepu grzyba. Dla kontrastu, żaden z kompleksów nie inhibitował wzrostu Botrysis cinera, za to wszystkie stymulowały jego wzrost. Tabela 3. Strefy zahamowania wzrostu szczepów grzybów. 10-15 mm – umiarkowana aktywność (kolor żółty), >15 mm – wysoka aktywność (kolor zielony). *Kompleksy jako jedyne nie inhibitowały a stymu- lowały wzrost B. cinera. Grzyb Strefy zahamowania/stymulacji* wzrostu [mm] Gramina i kompleksy 1 K2 K3 K5 K6 K8 K9 A. alternata 10 4,5 7,5 4,5 2,5 10 7,5 F. culmorum 3,5 0 2 6 0 6,4 9,2 T. harzianum 0 10 3 10 11,5 9,8 11,5 T. atroviride 13 0 4 2 2 2 10 B. cinera 11,2 13,3* 16,8* 17* 21,2* 15,3* 11,7* Koniugaty indolowo-tioketonowe 10 11 12 13 14 15 16 17 18 21 22 23 A. alternata 2,3 9 2 13 2,3 4,8 2,3 2 9 9 10 18 F. culmorum 3,8 1 3,5 4,5 7,8 5,5 4 2,5 2,1 1 1 13,2 T. harzianum 8 4 7,5 7 13 2,8 9 3,7 8 3,5 8,4 4,5 T. atroviride 2,5 11 1,5 4 22 13,5 12 3 5 0 6,6 7 B. cinera 3,5 16 4,3 4,5 3,3 2,3 5 4 23 17 19 16,5 Koniugaty indolowo-pirazolowe 24 25 26 27 28 29 32 33 34 35 36 37 38 A. alternata 6 13.5 13 11.5 0 9 12 10 11 0 15.5 12 13 F. culmorum 10 17,5 12.5 13.5 14 21 11 19 21 15 10 16 12.5 F. graminearum 12.5 9.5 16 18 0 25 10 16 18 13.5 21 20 16 T. harzianum 9 15.5 14.5 9.5 5.5 23 12 16 13 13.5 15.5 7.5 14.5 T. atroviride 15 16.5 0 0 8 10 15.5 21 19 16.5 0 11 0 B. cinera 7 10 19 19 9 5 11.5 11 13 7.5 7 14 19 8. Badania in silico 8.1. Właściwości fizykochemiczne związków Podobieństwo do leków (ang. druglikeness) jest pojęciem używanym w projektowaniu nowych związków o znaczeniu farmakologicznym. Odnosi się ono do poszukiwania cząsteczek o parametrach fizykochemicznych jak najbardziej zbliżonych do istniejących już farmaceuty- ków [235]. Polarność jest jednym z najważniejszych kryteriów branych pod uwagę w ocenie podo- bieństwa związków do leków. Ma ona wpływ na biodostępność, biodegradację i toksyczność substancji czynnych [236]. Ważna jest także rozpuszczalność w wodzie, jako że związek lepiej 46 rozpuszczalny jest bardziej biodostępny i wymaga mniejszej dawki, aby osiągnąć terapeutyczne stężenie w osoczu po podaniu doustnym [237]. Reguły Lipińskiego i Vebera opisują własności fizykochemiczne pozwalające określić czy dany związek spełnia wymagania stawiane lekom. Według Lipińskiego [238] lek powinien mieć masę cząsteczkową mniejszą niż 500 g/mol, współczynnik podziału oktanol/woda (logP) mniejszy niż 5 i nie posiadać więcej niż 5 donorów wiązań wodorowych (HBD) i 10 akcepto- rów wiązań wodorowych (HBA). Veber natomiast uwzględnił liczbę wiązań rotacyjnych (< 10) oraz pole powierzchni polarnej (<140Å2) [239]. Parametry fizykochemiczne związków 2 - 40 i kompleksów K2 – K9 zbadałam wyko- rzystując oprogramowanie SwissADME (http://www.swissadme.ch/). Wszystkie koniugaty spełniają reguły Lipińskiego i Vebera, co sprawia, że są dobrymi kandydatami do dalszych ba- dań biologicznych. Dodatkowo dla wszystkich pochodnych określiłam rozpuszczalność w wo- dzie, wchłanialność przez układ pokarmowy i zdolność do przekraczania bariery krew-mózg. Im większa dawka leku po podaniu doustnym dociera do krwiobiegu (głównie z przewodu po- karmowego), tym większa jest jej możliwość przekroczenia bariery krew-mózg poprzez bierną dyfuzję. Związki, które są w stanie pokonać tę barierę mogą działać w ośrodkowym układzie nerwowym. Tabela 4. Parametry fizykochemiczne wybranych związków. GI – wchłanialność przez układ pokar- mowy, BBB – przepuszczalność przez barierę krew-mózg. LogS jest średnią wartością logS obliczo- nego trzema różnymi metodami. *Klasa rozpuszczalności — skala logS: nierozpuszczalny < −10, słabo rozpuszczalny < −6, średnio rozpuszczalny < −4, rozpuszczalny < −2, dobrze rozpuszczalny < 0. Związek GI BBB LogS Klasa rozpuszczalności* 2 wysoka tak -3,60 rozpuszczalny K2 wysoka tak -7,16 słabo rozpuszczalny 3 wysoka tak -3,74 rozpuszczalny K3 wysoka tak -7,89 słabo rozpuszczalny 4 wysoka tak -3,95 rozpuszczalny 5 wysoka tak -4,10 średnio rozpuszczalny K5 niska nie -9,03 słabo rozpuszczalny 6 wysoka tak -4,59 średnio rozpuszczalny K6 wysoka nie -9,38 słabo rozpuszczalny 7 wysoka tak -4,26 średnio rozpuszczalny 8 wysoka tak -4,46 średnio rozpuszczalny K8 niska nie -10,90 nierozpuszczalny 9 wysoka tak -5,44 średnio rozpuszczalny K9 niska nie -10,03 nierozpuszczalny 12 wysoka tak -3,63 rozpuszczalny 24 wysoka tak -3,06 rozpuszczalny Tabela 4 przedstawia porównanie parametrów fizykochemicznych ligandów indolowo- imidazolowych, ich kompleksów i wybranych związków drugiej i trzeciej grupy. Komplekso- wanie z chlorkiem cynku wpłynęło negatywnie na rozpuszczalność koniugatów z imidazolami, obniżając ją o jedną klasę. W przypadku ligandów 5, 8 i 9 zmieniła się także ich wchłanialność http://www.swissadme.ch/ 47 z układu pokarmowego (z wysokiej na niską), a kompleksy K5, K6, K8 i K9 nie są w stanie przekroczyć bariery krew-mózg. Zamiana niepodstawionego pierścienia imidazolowego (2) na imidazolo-2-tion (12) lub pirazol (12) nie miała większego wpływu na własności fizykochemiczne koniugatów indo- lowych. 8.2. Dokowanie molekularne W związku z wysoką aktywnością cytoprotekcyjną koniugatów 10, 13, 24, 25 i 32 zo- stały one wybrane do badań dokowania molekularnego. Sprawdzono ich powinowactwo do trzech domen białkowych: mieloperoksydazy (MPO; 1DNU), dehydrogenazy ksantynowej (1N5X) i cyklooksygenazy-2 (COX-2; 4COX). Enzymy te mogą generować reaktywne formy tlenu podczas reakcji lub jako część mechanizmu obronnego przed patogenami, a inhibicja ich aktywności może przyczynić się do zmniejszenia stresu oksydacyjnego [240–242]. Wszystkie badane pochodne wykazywały podobne lub wyższe powinowactwo do 1DNU i 1N5X, w porównaniu do związków referencyjnych – melatoniny (1DNU) i febuk- sostatu (1N5X). W przypadku 4COX, koniugaty indolowe wykazały mniejsze powinowactwo do białka niż referencyjna indometacyna. Rysunek 34 przedstawia interakcje 25 z 1N5X. Związek ten wykazał najniższą energię wiązania ze wszystkich badanych koniugatów. Niepodstawiony atom azotu w pierścieniu pira- zolu może tworzyć wiązanie wodorowe z grupą hydroksylową serotoniny Ser876A, a grupa NH indolu może łączyć się z grupą OH tyrozyny Thr1010A. Rysunek 34. Przedstawienie możliwego tworzenia oddziaływań między domeną białka 1N5X a koniu- gatem 25. Niebieskie linie przerywane — wiązania wodorowe, linie cyjanowe przerywane — oddziały- wania π- π, zielone linie ciągłe — kontakty hydrofobowe. 48 49 Podsumowanie Celem mojej pracy doktorskiej było otrzymanie nowych koniugatów indolowych i ich kompleksów o potencjalnym zastosowaniu farmakologicznym. Zsyntezowałam łącznie 39 ko- niugatów indolowo-azolowych, z czego 35 nowych, oraz 6 kompleksów z ligandami indolowo-imidazolowymi. Nowo otrzymane związki scharakteryzowałam metodami spektroskopowymi (1H NMR, 13C NMR, FT-IR, MS). Dla większości z nich została określona struktura w krysztale. Analiza krystalograficzna wykonana została w Zakładzie Krystalografii Wydziału Che- mii UAM (prof. dr hab. Urszula Rychlewska, dr Beata Warżajtis). Dzięki niej możliwe było zidentyfikowanie drugiej formy tautomerycznej koniugatu z 3-bromo-5-metylopirazolem, a także wyjaśnienie aktywności biologicznej pochodnej z benztiazolo-2-tionem. Badania właściwości hemolitycznych, cytoprotekcyjnych i chelatujących przeprowa- dzono we współpracy z Zakładem Biologii Komórki Wydziału Biologii UAM (prof. UAM dr hab. Lucyna Mrówczyńska), przy czym część badań wykonałam samodzielnie, podczas odby- wanego tam stażu. Większość otrzymanych przeze mnie związków jest hemokompatybilna, a duża ich część wykazuje dobre właściwości antyoksydacyjne. Analiza zależności między budową pochodnych a ich aktywnością pozwoliła na zidentyfikowanie elementów struktury koniugatów odpowiedzialnych za ich właściwości hemolityczne, cytoprotekcyjne i chelatujące. Badania aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybicznej zrealizowano we współ- pracy z Katedrą Gleboznawstwa i Mikrobiologii, Wydziału Rolnictwa, Ogrodnictwa i Bioinży- nierii (prof. UPP dr hab. Justyna Starzyk) oraz z Katedrą Chemicznej Technologii Drewna, Wydziału Leśnego i Technologii Drewna (prof. UPP dr hab. Grzegorz Cofta) Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu. W większości koniugaty i kompleksy nie wykazały znaczącej ak- tywności przeciwbakteryjnej. Za to wszystkie związki pierwszej grupy w najwyższym stężeniu całkowicie inhibitowały wzrost grzybów odpowiedzialnych za choroby drewna. Dodatkowo koniugaty trzeciej grupy wykazały aktywność przeciwgrzybiczną przeciwko szczepom będą- cymi patogenami roślin. Wszystkie otrzymane koniugaty spełniają reguły Lipińskiego i Vebera i są związkami lekopodobnymi. Dodatkowo, w większości charakteryzują się dobrą rozpuszczalnością w wo- dzie, dobrą wchłanialnością z układu pokarmowego oraz są w stanie przekroczyć barierę krew- mózg. Badania dokowania molekularnego przeprowadzono w Zakładzie Chemii Kwantowej Wydziału Chemii UAM (mgr Damian Nowak). Wybrane koniugaty z drugiej i trzeciej grupy, wykazujące najwyższą aktywność cytoprotekcyjną, mogą łączyć się z enzymami odpowiedzial- nymi za generowanie wolnych rodników. Dokładniejsze opisy syntez, analizę strukturalną i krystalograficzną oraz dodatkowe wyniki badań opisano w publikacjach [P1 – P4]. 50 Porównanie numeracji związków w rozprawie dok- torskiej i publikacjach Tabela 5. Porównanie numeracji związków w rozprawie doktorskiej i publikacjach [P1 – P4]. Rozprawa doktor- ska Publikacja Rozprawa doktor- ska Publikacja P1 P3 2 2 10 2 3 3 11 3 4 4 12 4 5 5 13 5 5 5 14 6 6 6 15 7 7 7 16 8 8 8 17 9 9 9 18 10 19 10 21 11 20 11 22 12 23 13 P2 P4 K2 1 24 2 K3 2 25 3 K5 3 26 4 K6 4 27 5 K8 5 28 6 K9 6 29 7 30 8 31 9 32 10 33 11 34 12 35 13 36 14 37 15 38 16 39 17 40 18 51 Schematy przeprowadzanych syntez Schemat 1. Schemat syntezy koniugatów indolowo-imidazolowych 2 – 9. Schemat 2. Schemat syntezy koniugatów indolowo-tioketonowych 10 – 23. a) (gramina:azol 1:2) pierwszy etap: EtOH, NaOH, drugi etap: EtOH, reflux, 3 – 14 h; b) PhCH3, reflux, 2 – 8 h; c) EtOH, reflux, 5 – 10 h. 52 Schemat 3. Schemat syntezy koniugatów indolowo-pirazolowych 24 – 40. Schemat 4. Schemat syntezy kompleksów koniugatów indolowo-imidazolowych z chlorkiem cynku. 53 Bibliografia 1. Schreiber, C.L.; Smith, B.D. Molecular Conjugation Using Non-Covalent Click Chemistry. Nat. Rev. Chem. 2019, 3, 393–400, doi:10.1038/s41570-019-0095-1. 2. Yang, X.; Pan, Z.; Choudhury, M.R.; Yuan, Z.; Anifowose, A.; Yu, B.; Wang, W.; Wang, B. Making Smart Drugs Smarter: The Importance of Linker Chemistry in Targeted Drug De- livery. Med. Res. Rev. 2020, 40, 2682–2713, doi:10.1002/med.21720. 3. Yang, Y.; Wang, S.; Ma, P.; Jiang, Y.; Cheng, K.; Yu, Y.; Jiang, N.; Miao, H.; Tang, Q.; Liu, F.; et al. Drug Conjugate-Based Anticancer Therapy - Current Status and Perspectives. Can- cer Lett. 2023, 552, 215969, doi:10.1016/j.canlet.2022.215969. 4. Negash, K.H.; Norris, J.K.S.; Hodgkinson, J.T. Siderophore-Antibiotic Conjugate Design: New Drugs for Bad Bugs? Molecules 2019, 24, 3314, doi:10.3390/molecules24183314. 5. Greco, F.; Vicent, M.J. Combination Therapy: Opportunities and Challenges for Polymer– Drug Conjugates as Anticancer Nanomedicines. Adv. Drug Delivery Rev. 2009, 61, 1203– 1213, doi:10.1016/j.addr.2009.05.006. 6. Wang, N.; Luo, J.; Deng, F.; Huang, Y.; Zhou, H. Antibiotic Combination Therapy: A Strat- egy to Overcome Bacterial Resistance to Aminoglycoside Antibiotics. Front. Pharmacol. 2022, 13, doi:10.3389/fphar.2022.839808. 7. Feng, J.; Zheng, Y.; Ma, W.; Ihsan, A.; Hao, H.; Cheng, G.; Wang, X. Multitarget Antibac- terial Drugs: An Effective Strategy to Combat Bacterial Resistance. Pharmacol. Ther. 2023, 252, 108550, doi:10.1016/j.pharmthera.2023.108550. 8. Alkhzem, A.H.; Woodman, T.J.; Blagbrough, I.S. Design and Synthesis of Hybrid Com- pounds as Novel Drugs and Medicines. RSC Adv. 2022, 12, 19470–19484, doi:10.1039/D2RA03281C. 9. Sheyi, R.; de la Torre, B.G.; Albericio, F. Linkers: An Assurance for Controlled Delivery of Antibody-Drug Conjugate. Pharmaceutics 2022, 14, 396, doi:10.3390/pharmaceu- tics14020396. 10. Zawilska, J.B.; Wojcieszak, J.; Olejniczak, A.B. Prodrugs: A Challenge for the Drug De- velopment. Pharmacol. Rep. 2013, 65, 1–14, doi:10.1016/s1734-1140(13)70959-9. 11. Datta, L.P.; Manchineella, S.; Govindaraju, T. Biomolecules-Derived Biomaterials. Bio- materials 2020, 230, 119633, doi:10.1016/j.biomaterials.2019.119633. 12. Meares, C.F. Bioconjugate Chemistry☆. In Reference Module in Chemistry, Molecular Sci- ences and Chemical Engineering; Elsevier, 2014 ISBN 978-0-12-409547-2. 13. Li, F.; Mahato, R.I. Bioconjugate Therapeutics: Current Progress and Future Perspective. Mol. Pharmaceutics 2017, 14, 1321–1324, doi:10.1021/acs.molpharmaceut.7b00263. 14. Mu, R.; Yuan, J.; Huang, Y.; Meissen, J.K.; Mou, S.; Liang, M.; Rosenbaum, A.I. Bioana- lytical Methods and Strategic Perspectives Addressing the Rising Complexity of Novel Bi- oconjugates and Delivery Routes for Biotherapeutics. BioDrugs 2022, 36, 181–196, doi:10.1007/s40259-022-00518-w. 15. Bansal, R.; Suryan, A. A Comprehensive Review on Steroidal Bioconjugates as Promising Leads in Drug Discovery. ACS Bio Med Chem Au 2022, 2, 340–369, doi:10.1021/acsbio- medchemau.1c00071. 16. Benizri, S.; Gissot, A.; Martin, A.; Vialet, B.; Grinstaff, M.W.; Barthélémy, P. Bioconju- gated Oligonucleotides: Recent Developments and Therapeutic Applications. Bioconjugate Chem. 2019, 30, 36