Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu 

Wydział Biologii 

Instytut Biologii Molekularnej i Biotechnologii 

Zakład Ekspresji Genów 

 

 

 

Rozprawa doktorska 

Zależność biogenezy cząsteczki miR-21 od dojrzewania 

 jej prekursorów na poziomie alternatywnego splicingu  

oraz poliadenylacji 

 

mgr Michał Sekrecki 

 

Promotor: prof. dr hab. Krzysztof Sobczak 

 

 

 

 

Poznań 2021 



2 
 

Finansowanie 

 

Niniejsza rozprawa doktorska zrealizowana została ze wsparciem finansowym: 

 

 
 

Paszport do przyszłości -Interdyscyplinarne studia doktoranckie na Wydziale Biologii UAM 

POWR.03.02.00-00-I006/17 

 

 

Specjalne stypendium naukowe z dotacji podmiotowej w ramach Krajowego Naukowego 

Ośrodka Wiodącego „Poznańskie Konsorcjum RNA” 

 

Narodowego Centrum Nauki (NCN), w ramach projektu pt. Mechanizmy prowadzące do 

zmian poziomu ekspresji i aktywności mikroRNA w dystrofii miotonicznej na podstawie 

decyzji nr 2014/15/B/NZ2/02453 

 

 

 

 

 

 

  



3 
 

Podziękowania 

 

 

Serdeczne podziękowania dla prof. dr hab. Krzysztofa Sobczaka ze te wszystkie lata współpracy, 

dzielenia się swoją wiedzą, uwagami oraz merytorycznym wsparciem podczas trwania całego 

doktoratu. 

Narzeczonej Agacie za silną wiarę w moje dążenie do celu oraz nieocenione wsparcie  

w trudnych chwilach. Bez Ciebie na pewno ta praca by nie powstała. 

Mojej Rodzinie, a zwłaszcza Rodzicom, którzy swoją ciężką pracą i dużym zaangażowaniem 

odpowiednio przygotowali mnie do dorosłego życia. 

Koleżankom oraz Kolegom, tym obecnym oraz byłym, z Laboratorium prof. Sobczaka  

za przyjazną oraz twórczą atmosferę w laboratorium oraz poza nim. 

W szczególny sposób chciałbym podziękować dr Agnieszce Piaseckiej za wspólną walkę  

na tym samym miRNA-froncie. 

Wszystkim Koleżankom i Kolegom z Instytutu Biologii Molekularnej i Biotechnologii  

za tworzenie tak ciekawego oraz inspirującego miejsca pracy naukowej. 

Pracownikom Instytutu Biologii Molekularnej i Biotechnologii za ich merytoryczną, 

techniczną oraz administracyjną pracę na rzecz całego Instytutu. 

Pani dr Karolinie Cerbin za jej nieocenioną pracę oraz pomoc w załatwianiu wszystkich 

formalności. 

 

 

 

 

 

  



4 
 

Dedykacja 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Moim Bliskim  



5 
 

Wykaz skrótów 

2′-OMe-RNA-PS analog RNA ze szkieletem tiofosforanowym (PS, ang. phosphorothioate) 
oraz podstawioną grupą metylowa przy atomie węgla 2′ rybozy 

3’ss miejsce splicingu intronu po stronie 3’ (ang. 3’ splice site) 

5’ss miejsce splicingu intronu po stronie 5’ (ang. 5’ splice site) 

AA aminokwas (ang. amino acid) 

AON antysensowny oligonukleotyd (ang. antisense oligonucleotide) 

APAS alternatywne miejsce sygnału poliadenylacji (ang. alternative 
polyadenylation site) 

CAGE analiza ekspresji genów opierająca się na strukturze cap (ang. Cap Analysis 
of Gene Expression) 

cDNA komplementarny DNA (ang. complementary DNA) 

CDS sekwencja kodująca białko (ang. coding sequence) 

CR-APA alternatywna poliadenylacja wewnątrz sekwencji kodującej białko (ang. 
coding region-APA) 

ENST numer transkryptu wg. bazy Ensembl (ang. Ensembl transcript) 

ER retikulum endoplazmatyczne (ang. endoplasmic reticulum) 

GFP białko zielonej fluorescencji (ang. green fluorescent protein) 

HeLa ludzka, nabłonkowa linia komórkowa, wyizolowana z szyjki macicy 

HSkM ludzka mioblastyczna linia komórkowa (ang. human skeletal myoblast) 

kpz tysięcy par zasad 

lncRNA długie, niekodujące RNA (ang. long noncoding RNA) 

mRNA RNA informacyjne (ang. messenger RNA). 

ncRNA niekodujące RNA (ang. noncoding RNA) 

nt nukleotyd (ang. nucleotide) 

pA poliadenylowany (ang. poliadenylated) 

PAS miejsce sygnału poliadenylacji (ang. polyadenylation signal) 

PAS dyst. dystalne miejsce sygnału poliadenylacji (ang. distal polyadenylation signal) 
 
  



6 
 

  

PAS proks. proksymalne miejsce sygnału poliadenylacji (ang. proximal polyadenylation 
signal) 

piRNA cząsteczki RNA związane z białkiem Piwi (ang. Piwi interacting RNA) 

PR punkt rozgałęzienia (ang. branch point) 

PTBP białko wiążące się do traktu polipirymidynowego (ang. polypirimidine tract 
binding protein) 

RACE technika mapowania końców transkryptów cDNA (ang. Rapid amplification 
of cDNA ends) 

RBP białko wiążące się do RNA (ang. RNA binding protein) 

RNAi interferencja RNA (ang. RNA interference) 

RNA-seq sekwencjonowanie RNA (ang. RNA-seq) 

siRNA małe interferujące RNA (ang. small interfering RNA) 

sncRNA krótkie, niekodujące RNA (ang. short noncoding RNA) 

snRNP małe jądrowe nukleoproteiny (ang. small nuclear ribonucleoproteins) 

TPM normalizacja - transkrypty na million (ang. Transcripts Per Million) 

TSS miejsce startu transkrypcji (ang. transcription start site) 

U2AF czynnik pomocniczy U2 (ang. U2 auxilary factor) 

UCSC Genome 
Browser 

internetowa przeglądarka genomowa (ang. University of California Santa 
Cruz) 

UTR region nie ulegający translacji (ang. untranslated region)  

3’UTR region nie ulegający translacji poniżej ORF  

5’UTR region nie ulegający translacji powyżej ORF 

UTR-APA alternatywna poliadenylacja wewnątrz sekwencji niekodującej białko (ang. 
untranslated region-APA) 

VMP1 wakuolarne białko membranowe 1 (ang. Vacuole membrane protein 1) 

WES sekwencjonowanie całych eksonów (ang. whole-exome sequencing) 

WGS sekwencjonowanie całego genomu (ang. whole-genome sequencing) 
  



7 
 

Spis treści 

 

Finansowanie .......................................................................................................................................... 2 

Podziękowania ........................................................................................................................................ 3 

Dedykacja ................................................................................................................................................ 4 

Wykaz skrótów ........................................................................................................................................ 5 

Spis treści................................................................................................................................................. 7 

Streszczenie ........................................................................................................................................... 10 

Abstract ................................................................................................................................................. 12 

1. Wstęp ............................................................................................................................................ 14 

1.1. Świat RNA .............................................................................................................................. 14 

1.1.1. Dojrzewanie cząsteczek prekursorowych RNA ............................................................. 16 

1.1.1.1. Splicing RNA ........................................................................................................... 16 

Rola rybonukleoprotein (snRNP) w procesie splicingu pre-mRNA ....................................... 18 

1.1.1.2. Alternatywne splicing RNA (AS) ............................................................................ 20 

1.1.1.3. Poliadenylacja na końcu 3’ RNA – dobudowanie ogona poli(A) ........................... 23 

1.1.1.4. Alternatywna poliadenylacja (APA) ....................................................................... 24 

1.1.1.5. Zależność pomiędzy splicingiem, a poliadenylacją ............................................... 26 

1.2. Długie niekodujące RNA (lncRNA) ......................................................................................... 27 

1.3. Krótkie niekodujące RNA (sncRNA) ....................................................................................... 28 

1.3.1. mikroRNA ...................................................................................................................... 29 

1.3.1.1. Biogeneza miRNA - klasyczna droga powstawania miRNA ................................... 30 

1.3.1.2. Mirtrony – alternatywna ścieżka biogenezy miRNA ............................................. 31 

1.3.1.3. Badania genomowe oraz identyfikacja kanonicznych cząsteczek miRNA............. 32 

1.3.1.4. Genomowa lokalizacja miRNA ............................................................................... 33 

1.3.1.5. Mechanizm działania miRNA ................................................................................. 35 

1.3.1.6. Znaczenie cząsteczek miRNA w rozwoju oraz w chorobie .................................... 36 

1.3.2. mikroRNA-21 ............................................................................................................. 37 

1.3.2.1. Genomowa lokalizacja oraz regulacja biogenezy miR-21 ..................................... 37 

1.3.2.2. Znaczenie miR-21 podczas rozwoju embrionalnego ............................................. 38 

1.3.2.3. miR-21 w kancerogenezie ..................................................................................... 39 

2. Cel pracy ........................................................................................................................................ 42 

3. Materiały i metody ........................................................................................................................ 43 

3.1. Konstrukty genetyczne GFP_pri-miR-21 ............................................................................... 43 



8 
 

3.2. Hodowle bakteryjne .............................................................................................................. 46 

3.3. Eksperymenty na liniach komórkowych ................................................................................ 46 

3.3.1. Spis stosowanych linii komórkowych ............................................................................ 46 

3.3.2. Hodowla oraz różnicowanie komórek ........................................................................... 47 

3.3.3. Transfekcje komórek ..................................................................................................... 47 

3.3.4. Spis stosowanych oligonukleotydów ............................................................................ 47 

3.3.5. Izolacja RNA i odwrotna transkrypcja ........................................................................... 49 

3.3.6. Odwrotna transkrypcja dla cząsteczek miRNA .............................................................. 49 

3.4. Analiza danych z portalu GTEx .............................................................................................. 50 

3.5. Analizy RT-PCR oraz RT-qPCR ................................................................................................ 50 

3.5.1. Lista starterów ............................................................................................................... 51 

3.6. Western blot.......................................................................................................................... 53 

3.7. Frakcjonowanie komórek ...................................................................................................... 54 

4. Wyniki ............................................................................................................................................ 55 

4.1. Transkrypty pri-miR-21 powstają niezależnie z własnych miejsc promotorowych, a 

terminacja transkrypcji zachodzi w alternatywnych miejscach poliadenylacji ................................. 55 

4.1.1. Gen VMP1 oraz jego izoformy splicingowe ................................................................... 55 

4.1.2. Pierwotne prekursory pri-miR-21 .................................................................................. 59 

4.1.3. Poziom ekspresji VMP1, lncVMP1 oraz pri-miR-21 jest znacząco odmienny w różnych 

tkankach człowieka ....................................................................................................................... 61 

4.1.4. Komórki z wyciszeniem genu DROSHA stanowią model w badaniu krótko żyjących 

prekursorów pri-miRNA ................................................................................................................ 64 

4.1.5. Zjawisko alternatywnej poliadenylacji prowadzi do powstania poliadenylowanych 

transkryptów pri-miR-21 ............................................................................................................... 65 

4.1.6. Poziom expresji VMP1, pri-miR-21 oraz miR-21 ulega istotnemu podwyższeniu podczas 

proliferacji mioblastów ................................................................................................................. 68 

4.1.7. Brak zmian poziomu mRNA VMP1 w komórkach z niedoborem DROSHA ................... 70 

4.1.8. Podwyższona aktywność transkrypcyja prowadzi do podwyższonegp poziomu miR-21 

w komórkach raka piersi ............................................................................................................... 72 

4.2. Alternatywna poliadenylacja ma bezpośredni wpływ na biogenezę miR-21........................ 75 

4.2.1. Komórki z wyciszeniem CPSF3 jako potencjalny model badania wpływu alternatywnej 

poliadenylacji VMP1/pri-miR-21 na biogenezę miR-21 ................................................................ 75 

4.2.2. Stworzenie konstruktu genetycznego do badań wpływu dojrzewania prekursora pri-

mir-21 na biogenezę miR-21 ......................................................................................................... 77 

4.2.3. Aktywność PAS proks. w RNA VMP1/pri-miR-21 ma bezpośredni wpływ na biogenezę 

miR-21  ....................................................................................................................................... 79 

4.3. Zależność pomiędzy aktywnością czynników splicingowych działających w 3’ss ostatniego 

intronu, a zajściem procesu cięcia i poliadenylacji w pri-miR-21 ...................................................... 82 



9 
 

4.3.1. Blokowanie PAS proks. VMP1/pri-miR-21 oraz jego delecja wpływają na zwiększoną 

retencję ostatniego intronu .......................................................................................................... 82 

4.3.2. Izoformy pri-miR-21 z i bez retencji intronu są prekursorami miR-21 .......................... 84 

4.3.3. Obecność miejsca splicingu 3’ (3’ss) ostatniego intronu pri-miR-21 ma wpływ na 

biogenezę miR-21 .......................................................................................................................... 85 

5. Dyskusja ......................................................................................................................................... 88 

6. Wnioski ........................................................................................................................................ 100 

7. Bibliografia .................................................................................................................................. 101 

8. Spis rycin i tabel ........................................................................................................................... 116 

 

 

  



10 
 

Streszczenie 

Cząsteczki mikroRNA (miRNA) stanowią ważny element regulatorowy utrzymujący 

homeostazę w organizmach żywych. Te krótkie (20-22 nukleotydów), niekodujące RNA 

regulują poziom ekspresji niemal wszystkich genów kodujących białka, na drodze interferencji 

RNA. Na dzień dzisiejszy zidentyfikowanych jest blisko 2000 ludzkich miRNA. Jednym z lepiej 

poznanych jest miR-21. Cząsteczka ta od lat stanowi obiekt badań pod kątem jej roli w procesie 

rozwoju zwierząt, jak również w patogenezie chorób takich jak nowotwory. Pomimo dość 

dobrze opisanych szlaków w których zaangażowany jest miR-21, nadal słabo poznane są 

mechanizmy kontrolujące proces jego biogenezy. Alternatywny splicing (AS) oraz 

alternatywna poliadenylacja (APA) pierwotnych transkryptów są niezwykle ważnymi 

mechanizmami w regulacji ekspresji większości genów kodujących białka. Procesy te zachodzą 

podczas transkrypcji i są ze sobą ściśle związane i wzajemnie na siebie wpływają. Na dzień 

dzisiejszy niewiele prac badawczych skupiało się na udziale tych procesów w regulacji ekspresji 

genów miRNA. 

Głównym celem niniejszej rozprawy doktorskiej było zbadanie zaangażowania AS oraz 

APA w proces biogenezy miR-21. Podczas pierwszego etapu badań wykazano, że pierwotny 

transkrypt pri-miR-21 powstaje niezależnie od pre-mRNA swojego genu-gospodarza VMP1 i 

może podlegać charakterystycznym dla pre-mRNA VMP1 procesom składania. W pracy, dzięki 

analizie danych z sekwencjonowania RNA, określono dużą zmienność w poziomie ekspresji  

pri-miR-21 w różnych ludzkich tkankach. Wyniki te wskazują na obecność precyzyjnych 

mechanizmów, bezpośrednio regulujących transkrypcję pri-miR-21, ale również sugerują 

zachodzenie wariantywnego splicingu tego prekursorowego RNA, co przypuszczalnie 

przekłada się na zróżnicowany poziom ich ekspresji w ludzkich tkankach.  

Wykorzystując model komórkowy ze znacznie ograniczonym tempem przetwarzania 

transkryptów pri-miRNA scharakteryzowano rozmaite izoformy pri-miR-21 w tym izoformy z 

retencją intronu 11. Dodatkowo poprzez zastosowanie blokera oligonukleotydowego 

wiążącego się do określonych sekwencji RNA lub poprzez mutację tego miejsca w konstrukcie 

genetycznym wykazano, że aktywność alternatywnych sygnałów poliadenylacji (APAS) 

występujących w 3’UTR VMP1, ma wpływ na efektywność biogenezy miR-21. Na podstawie 

przeprowadzonych analiz można wnioskować, że powstawanie kilku różnych izoform  

pri-miR-21 odgrywać może ważną rolę w procesie biogenezy miR-21. Dodatkowo badania 



11 
 

wykazały bezpośredni wpływ PAS zlokalizowanego przed sekwencją kodującą miR-21 na ilość 

dojrzałej cząsteczki miR-21. 

 Uwzględniając obecność powszechnej izoformy pri-miR-21 z retencją intronu, w 

ostatnim etapie pracy postanowiono sprawdzić zależność efektywności biogenezy miR-21 od 

splicingu pri-miR-21. Poprzez zablokowanie lub mutagenezę miejsca składania RNA 

zlokalizowanego po stronie 3’ doprowadzono do zaburzenia splicingu pri-miR-21 oraz 

zaobserwowano istotny wzrost poziomu tej cząsteczki RNA, co przełożyło się na zwiększenie 

liczby dojrzałych cząsteczek miR-21. Uzyskane wyniki dowodzą, że obecność izoformy z 

retencją intronu poprzez bezpośredni wpływ na aktywność miejsca 3’ splicingu w 11 intronie 

VMP1, pozytywnie wpływa na biogenezę miR-21.  

Uzyskane w pracy wyniki przyczynią się do lepszego zrozumienia mechanizmów, jakie 

zaangażowane mogą być w regulację poziomu cząsteczki miR-21. Opisywane w pracy 

zależności stanowią solidną podstawę do twierdzenia, że w globalne zmiany ilości cząsteczek 

miRNA zaangażowane są liczne mechanizmy po- i ko-transkrypcyjne. Taka wiedza może 

przyczynić się do wyjaśnienia mechanizmów prawidłowej regulacji ekspresji genów miRNA, 

ale również patomechanizmów wielu chorób oraz w dalszej kolejności do opracowania 

potencjalnych strategii terapeutycznych, w tym terapii celujących w dojrzewanie 

prekursorowych pri-miRNA lub biogenezę miRNA. 

Słowa kluczowe: miR-21, pri-miR-21, alternatywna poliadenylacja, alternatywny splicing, 

VMP1, biogeneza miRNA 

 

  



12 
 

Abstract 

MicroRNAs (miRNAs) are an important regulatory element maintaining homeostasis in 

living organisms. These short (20-22 nucleotides), non-coding RNAs regulate the expression 

level of almost all protein-coding genes through RNA interference mechanism. For now, nearly 

2,000 human miRNAs have been identified. One of the well-known is the miR-21. This 

molecule has been an object of research for many years in terms of its role in the process of 

animal development, as well as in the pathogenesis of diseases such as cancer. Despite the 

fairly well-described pathways in which miR-21 is involved, the mechanisms controlling the 

process of its biogenesis are still poorly understood. Alternative splicing (AS) and alternative 

polyadenylation (APA) of primary transcripts are extremely important mechanisms in 

regulating the expression of most protein-coding genes. These processes take place during 

transcription and are closely related and influence each other. As of today, little research has 

focused on the involvement of these processes in regulating miRNA biogenesis. 

The main purpose of the dissertation was to investigate the involvement of AS and APA 

in the miR-21 biogenesis process. During the first stage of the research, it was shown that the 

primary transcript of pri-miR-21 is generated independently of the pre-mRNA of its host gene 

VMP1 and may undergo splicing processes characteristic of VMP1 pre-mRNA. Due to the 

analysis of RNA sequencing data, the study revealed a high variability in the expression level 

of pri-miR-21 in various human tissues. These results indicate the presence of precise 

mechanisms directly regulating the transcription of pri-miR-21, but also suggest the 

occurrence of variant splicing of precursor RNA, which may have an impact on varying levels 

of expression in human tissues. 

Using a cell model with a significantly reduced processing rate of pri-miRNA transcripts, 

various isoforms of pri-miR-21 were characterized, including isoforms with intron 11 

retention. Alternative polyadenylation signals (APAS) which are present in the 3'UTR of VMP1 

have an impact on the efficiency of miR-21 biogenesis. On the basis of the conducted analyses, 

it can be concluded that the formation of several different isoforms of pri-miR-21 may play an 

important role in the process of miR-21 biogenesis. In addition, studies have shown a direct 

effect of PAS located upstream of the miR-21 coding sequence on the amount of the mature 

miR-21 molecule. 



13 
 

Taking into account the presence of the common pri-miR-21 isoform with an intron 

retention, in the last stage of the work, it was decided to check the dependence of the 

effectiveness of miR-21 biogenesis on pri-miR-21 splicing. By blocking or mutagenesis of the 

RNA splice site located on the 3' side (3’ss), pri-miR-21 splicing was disturbed and a significant 

increase in the level of this RNA molecule was observed, which have an impact on increase in 

the number of mature miR-21 molecules. The obtained results prove that the presence of the 

intron retention isoform positively influences the biogenesis of miR-21 by directly affecting 

the activity of the 3 'splicing site in intron 11 of VMP1. 

The results obtained in this study will contribute to a better understanding of the 

mechanisms that may be involved in the regulation of the miR-21 biogenesis.  

The dependencies described in the paper provide a solid basis for the statement that 

numerous post-and co-transcriptional mechanisms are involved in global changes in the 

number of miRNA molecules. Such knowledge may help to elucidate the mechanisms of the 

correct regulation of miRNA gene expression, but also the pathomechanisms of many 

diseases, and subsequently to the development of potential therapeutic strategies, including 

therapies targeting the maturation of pri-miRNAs or miRNA biogenesis. 

Key words: miR-21, pri-miR-21, alternative polyadenylation, alternative splicing, VMP1, 

miRNA biogenesis 

  



14 
 

1. Wstęp 

1.1. Świat RNA 

Budowa i funkcjonowanie każdego żywego organizmu, a także wirusów opiera się na 

informacji genetycznej zapisanej w genomie. Przeważająca część genomów, w tym genomu 

człowieka, jest zbudowana z DNA (kwasu deoskyrybonukleinowego) a w przypadku niektórych 

wirusów z RNA (kwasu rybonukleinowego). Oba kwasy zbudowane są bardzo podobnie z 

dwoma głównymi różnicami. Pierwszą jest budowa cukru wchodzącego w skład danego kwasu 

nukleinowego, w przypadku RNA jest to ryboza, w przypadku DNA deoksyryboza. Drugą 

różnicą jest obecność w RNA uracylu, w miejscach gdzie w DNA znajdowała by się tymina. 

Grupę czterech nukleozydów tworzących łańcuch RNA stanowią: adenozyna (A), cytydyna (C), 

guanozyna (G) oraz urydyna (U). Ponadto poszczególne części nukleozydów mogą być 

modyfikowane, co zwiększa zmienność strukturalną i funkcjonalną cząsteczek RNA. W obu 

kwasach nukleinowych nukleozydy łączone są dzięki wiązaniom 3’-5’ fosfodiestrowym. 

Jednakże stabilność cząsteczek RNA jest znacznie mniejsza, co wynika z obecności grupy 

hydroksylowej przy węglu 2’ rybozy. RNA swoją długością rzadko przekraczają kilka, 

kilkanaście tysięcy nukleotydów. Pomimo tego, że w cząsteczkach RNA często występują 

wiązania wewnątrzcząsteczkowe, to łańcuchy RNA zazwyczaj mają formę jednoniciową. Co 

również charakterystyczne, cząsteczki RNA mogą przyjmować rozmaite struktury  

II- i III-rzędowe, w tym konformacje globularne. Za oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe 

głównie odpowiedzialne są wiązania wodorowe tworzone przez komplementarne reszty 

nukleotydowe. 

RNA powstaje na bazie matrycy kodującej ją sekwencji DNA podczas procesu zwanego 

transkrypcją. Przeprowadzana jest ona przez enzymy nazwane polimerazami RNA zależnymi 

od DNA, skrótowo nazywanymi polimerazami RNA. Transkrypcja w bakteriach oraz 

organizmach eukariotycznych przebiega w bardzo podobny sposób. Podstawą polimeryzacji 

RNA, wśród wszystkich typów organizmów, stanowi identyczna reakcja chemiczna. Każda z 

trzech eukariotycznych polimeraz RNA strukturalnie przypomina polimerazę bakterii E. coli. 

Oprócz podobieństw, transkrypcja u eukariontów i bakterii ma cechy specyficzne dla danej 

grupy organizmów. W przypadku bakterii nowopowstałe transkrypty, na bazie których w 

późniejszym etapie powstawać będą białka, nie ulegają żadnym procesom obróbki 

potranskrypcyjnej. Powstający transkrypt stanowi dojrzały mRNA, czyli RNA informacyjne 



15 
 

(ang. messenger RNA). W przypadku organizmów eukariotycznych, powstający transkrypt 

musi ulec szeregowi modyfikacji zanim posłuży jako matryca dla rybosomów biorących udział 

w syntezie białka. Wszystkie eukariotyczne mRNA posiadają strukturę tzw. czapeczki na swoim 

końcu 5’, a w większości przypadków są także poliadenylowane (pA, ang. poliadenylated) na 

końcu 3’. Prekursorowe transkrypty (pre-mRNA) również podlegają bardzo często składaniu 

(ang. splicing), czyli wycinaniu intronów i łączeniu eksonów. Warto zauważyć, że wszystkie te 

procesy zachodzą jeszcze w trakcie trwania syntezy nowo powstającego RNA na matrycy DNA 

(1). Czapeczka na końcu 5’ jest dodawana zaraz po tym, jak zainicjowana zostanie transkrypcja. 

Składanie i redagowanie pre-mRNA odbywa się w podczas działania polimerazy RNA. 

Natomiast poliadenylacja końca 3’ transkryptu jest nieodłącznym elementem terminacji 

transkrypcji. 

Ilość RNA w typowej bakterii wynosi między 0,05-0,10 pg, co odpowiada około 6% 

całkowitej masy. W przypadku komórek ssaków, które są znacznie większe od komórek 

bakteryjnych, ilość RNA jest większa i jest to 20-30 pg. Mimo, że jest to ilość większa to stanowi 

zaledwie 1% całkowitej masy komórki. 

 

Rycina 1 Podział RNA występujący w komórkach. Schemat przedstawia ogólny podział RNA występujących we 
wszystkich organizmach z zaznaczeniem frakcji RNA, których występowanie odnotowano jedynie u organizmów 
eukariotycznych. Wartość 100% stanowi całą pulę RNA znajdującego się w komórce. 

Podziałów RNA na typy, można przeprowadzić na wiele sposobów. Jednym z 

najpowszechniejszych jest podział ze względu na pełnione funkcje w komórce (Ryc. 1). 

Podstawowy podział to: RNA kodujący i RNA niekodujący. W obrębie RNA kodujących 

wyróżniamy jedynie mRNA. mRNA są dojrzałymi transkryptami genów, które w procesie 

translacji ulegają przepisaniu na białka. Zawartość mRNA w komórce wynosi ok. 4% z całości 

RNA znajdującego się w komórce. Cząsteczki te cechują się dosyć krótkim okresem półtrwania 



16 
 

i są szybko degradowane. W komórkach eukariotycznych znaczna część mRNA ulega 

degradacji w ciągu kilku godzin. Są jednak i takie, których okres półtrwania wynosi kilka minut. 

Mała stabilność komórkowa cząsteczek mRNA wskazuje na dużą dynamikę i zmienność całego 

transkryptomu w komórce. Drugim rodzajem opisywanych RNA są RNA niekodujące (ncRNA, 

ang. noncoding RNA). Cząsteczki te nie ulegają translacji na białka. Inną stosowaną nazwą dla 

tych cząsteczek jest RNA funkcjonalny, gdyż biorą aktywny udział w wielu istotnych procesach 

w komórce, innych niż kodowanie sekwencji białkowej. Dwie główne kategorie niekodujących 

RNA stanowią RNA rybosomowe (rRNA) oraz RNA transportujące (tRNA). rRNA zidentyfikować 

można we wszystkich organizmach i stanowią one najliczniejszą grupą RNA w komórce. rRNA 

są budulcem rybosomów, odpowiedzialnych za syntezę białek. tRNA, podobnie jak rRNA biorą 

udział w powstawaniu białek i ich rola polega na dostarczaniu aminokwasów do rybosomu w 

procesie syntezy białek. Poza dwoma opisanymi rodzajami niekodujących RNA, rozróżniamy 

wiele innych rodzajów cząsteczek RNA odgrywających znaczące funkcje w komórkach 

eukariotycznych. Cząsteczki te sklasyfikowane są jako krótkie niekodujące RNA (sncRNA, ang. 

short noncoding RNA), nieprzekraczające 200 nukleotydów długości, oraz długie niekodujące 

RNA (lncRNA, ang. long noncoding RNA), których długość szacowana jest na ponad 200 

nukleotydów. Te klasy RNA również mogą powstawać jako cząsteczki prekursorowe i podlegać 

licznym procesom dojrzewania, w tym splicingowi i poliadenylacji. 

1.1.1. Dojrzewanie cząsteczek prekursorowych RNA 

1.1.1.1. Splicing RNA 

Niemalże do końca lat 70. XX wieku naukowcy na całym świecie nie zdawali sobie 

sprawy z istnienia intronów. Dopiero w roku 1977, w trakcie sekwencjonowania DNA genów 

eukariotycznych, okazało się że geny te w swojej budowie zawierają tzw. sekwencje 

“wtrącone” (ang. intervening sequences). Sekwencje te w charakterystyczny sposób oddzielały 

fragmenty kodu genetycznego, które w dalszych etapach były odpowiedzialne za kodowanie 

sekwencji białkowej.  

Składanie RNA (ang. RNA splicing) stanowi nieodłączny etap w dojrzewaniu 

prekursorowego RNA (pre-mRNA). Polega na usunięciu niekodujących informacji fragmentów, 

tzw. intronów. Proces splicingu bazuje na reakcjach cięcia i łączenia się eksonów, w wyniku 

czego powstaje dojrzała cząsteczka RNA kodująca białko - mRNA. Proces splicingu pre-mRNA 

stanowi podstawę różnorodności w powstawaniu białek w komórkach eukariotycznych.  



17 
 

U człowieka blisko 95% genów podlega bowiem również alternatywnemu splicingowi (2). 

Charakterystyczną cechą pre-mRNA u eukariotów jest to, że może ono zawierać wiele, w 

niektórych przypadkach ponad 100 intronów, które stanowią znaczącą część całego 

prekursorowego transkryptu.  

Zaraz po tym jak odkryto istnienie intronów, naukowcy zaobserwowali 

zakonserwowane motywy, które jak się okazało w istotny sposób warunkują proces ich 

prawidłowego wycinania intronów z pre-mRNA. Na chwilę obecną opisanych zostało siedem 

odrębnych rodzajów intronów wśród organizmów eukariotycznych. W przeważającej liczbie 

intronów, w genach kodujących białka, pierwszymi dwoma nukleotydami są 5’-GU-3’. 

Natomiast na końcu intronu, znajduje się sekwencja 5’-AG-3’. Introny takie określa się 

intronami “GU-AG” i stanowią one jeden z najpopularniejszych typów. W miarę postępów 

badań nad budową intronu okazało się, że powtarzające się motywy na początku oraz na 

końcu stanowią jedynie część zakonserwowanych sekwencji. Po stronie 3’ intronu, przed 

sekwencją 5’-AG-3’, występuje trakt polipirymidynowy, czyli rejon bogaty w pirymidyny 

(nukleotyd U lub C). Dodatkowo w odległości około 10-40 nt powyżej traktu 

polipirymidynowego znajduje się sekwencja zwana sekwencją rozgałęzienia (ang. branch 

point). Dla kręgowców kanoniczny wariant tej sekwencji to 5’-CURAY-3’, gdzie “R” to puryna, 

a “Y” pirymidyna. 

W latach 1990. badania prowadzone na całym świecie wykazały, że wycinanie 

intronów z pre-mRNA jest procesem wieloetapowym. Pierwszym krokiem jest cięcie w miejscu 

splicingu 5’ intronu (5’ss, ang. 5’ splice site). Następuje to poprzez reakcję transestryfikacji - 

zaangażowanie grupy hydroksylowej przyłączonej od węgla 2’ nukleotydu adenozynowego w 

punkcie rozgałęzienia (PR, ang. branch point), znajdującego się wewnątrz intronu. Skutkiem 

takiego “ataku” jest przecięcie wiązania 3’-5’ fosfodiestrowego po stronie 5’ intronu i 

powstanie nowego wiązania 5’-2’ fosfodiestrowego. Reakcja ta skutkuje utworzeniem się 

charakterystycznego struktury, tzw. lassa (ang. lariat), składającego się z intronu, oraz eksonu 

leżącego po jego 3’ stronie. Druga reakcja transestryfikacji, przeprowadzona po 3’ stronie 

intronu (3’ss, ang. 3’ splice site) uwalnia intron w postaci lassa, który zostaje przekształcone w 

liniową formę i ulega degradacji. W tym samym momencie uwolniony koniec 5’ eksonu, który 

znajdował się poniżej intronu zostaje połączony z 3’ końcem eksonu leżącego przed intronem. 

 



18 
 

Rola rybonukleoprotein (snRNP) w procesie splicingu pre-mRNA 

Z punktu widzenia biochemicznego, dwie reakcje transestryfikacji jakie maja miejsce 

podczas wycinania intronu i składania eksonów, nie stanowią dla komórki dużego wyzwania. 

Jednakże, do przeprowadzenia tego na pozór prostego procesu, zaangażowana musi być liczna 

grupa białek, które ściśle nadzorują ten proces. Nierzadko zdarza się, że dwa eksony oddalone 

są od siebie o nawet kilkadziesiąt tysięcy nukleotydów. Taka sytuacja wymaga obecności całej 

maszynerii białek, która będzie w stanie w odpowiedni sposób zbliżyć do siebie miejsca istotne 

w procesie splicingu. Pamiętać należy, że miejsca składania eksonów w genie są bardzo do 

siebie podobne. Gdyby nie zaangażowanie odpowiednich białek, dochodziłoby do połączenia 

się nieodpowiednich miejsc i tym samym do pominięcia niektórych eksonów. Innym znanym 

zaburzeniem podczas składania eksonów jest wybór miejsc kryptycznych, czyli miejsc 

znajdujących się w intronie bądź eksonie, które swoją sekwencją przypominają właściwe 

miejsca składania pre-mRNA Zadaniem białek kontrolujących proces splicingu jest 

rozpoznawanie takich miejsc i skuteczne ich pomijanie. 

  



19 
 

 

Rycina 2 Schemat splicingu RNA z zaznaczeniem zaangażowanych snRNP przeprowadzających cały proces. 
Zaznaczone na rycinie zostały najważniejsze białka bezpośrednio zaangażowane w proces splicingu. Kluczowym 
momentem jest przyłączenie się kompleksów U1 oraz U2, dzięki którym dochodzi do zbliżenia się fragmentów 
eksonowych. Końcowymi produktami składania są związane ze sobą eksony oraz wypięty intron, który przyjmuje 
formę lassa. W procesie splicingu uczestniczy znacznie więcej białek, które nie zostały przedstawione na 
schemacie. 

Reakcja składania RNA przeprowadzana jest przez kompleksy rybonukleoprotein 

(snRNP), którym towarzyszy ponad 100 innych białek związanych z procesem splicingu (3) 

(Ryc. 2). Kompleks ten nazywany jest spliceosomem. W jego podstawowym składzie zawartych 

jest 5 kompleksów U1, U2, U4, U5 oraz U6 snRNP. Głównym zadaniem wymienionych 

rybonukleoprotein jest rozpoznawanie charakterystycznych miejsc na końcach 5’ oraz 3’ 

intronów, traktów polipirymidynowych oraz miejsc rozgałęzienia w intronie. Aby doszło do 

utworzenia się spliceosomu, U1 snRNP przyłącza się do miejsca splicingu w części 5’ intronu, 



20 
 

a w części 3’ intronu wiąże się czynnik pomocniczy U2 (U2AF, ang. U2 auxilary factor). U2AF 

jest heterodimerem składającym się z podjednostek U2AF65 oraz U2AF35. Obie rozpoznają 

miejsce składania na 3’ końcu intronu wraz z traktem polipirymidynowym. W międzyczasie 

czynnik białkowy SF1 przyłącza się do miejsca rozgałęzienia wewnątrz intronu aby wspólnie z 

U1 oraz U2AF65 i U2AF35 utworzyć kompleks E. Kolejnym etapem jest przekształcenie 

kompleksu E w kompleks A, poprzez zamianę SF1 na U2 snRNP w miejscu rozgałęzienia. Duże 

powinowactwo U1 oraz U2 snRNP wymusza przyciągnięcie miejsca donorowego U1 w 

kierunku punktu rozgałęzienia. Po przyłączeniu się U4, U5 oraz U6 snRNP do intronu powstaje 

kompleks B. W tym momencie dochodzi do zbliżenia miejsca akceptorowego splicingu do 

miejsca donorowego i punktu rozgałęzień. Po uwolnieniu U1 i U4 snRNP tworzy się kompleks 

składania, a miejsca 5’ oraz 3’ wraz z punktem rozgałęzień znajdują się na tyle blisko siebie, że 

dochodzi do reakcji cięcia i łączenia RNA katalizowanych przez U2 i U6 snRNP. Po wycięciu 

intronu, produktem jest transkrypt zawierający połączone eksony. 

1.1.1.2. Alternatywne splicing RNA (AS) 

Na podstawie analiz masowego sekwencjonowania RNA (RNA-seq) zakłada się, że 

zjawisko alternatywnego składania RNA dotyczyć może blisko 95% ludzkich, wieloeksonowych 

genów (2)(37). Pomimo wspomnianego wcześniej faktu, że proces składania RNA z punktu 

widzenia biochemicznego jest prostą reakcją, to precyzja jaką wykazać musi się cała 

maszyneria splicingowa jest zdumiewająca. Kluczowym momentem jest rozpoznanie 

właściwych miejsc splicingu po 5’ oraz 3’ stronie intronu, w szczególności w przypadku genów 

kodujących białko. Wystarczy przesunięcie miejsca złączenia się eksonów o kilka nukleotydów, 

a doprowadzić to może do zmiany całej ramki odczytu (ang. frameshift) i w konsekwencji 

najczęściej do szybkiej degradacji całego nowopowstałego transkryptu na drodze rozpadu 

NMD (ang. nonsense-mediated decay). Ponieważ w powstającym transkrypcie znajduje się 

wiele miejsc rozpoznawanych przez spliceosom, proces składania musi być poddany ścisłej 

kontroli przez wiele czynników promujących bądź hamujących zajście składania w konkretnym 

miejscu. Okazuje się, że na wybór wpięcia bądź wypięcia alternatywnego eksonu ma wpływ 

także polimeraza II RNA odpowiedzialna za proces transkrypcji, który odbywa się w tym 

samym czasie co proces splicingu (4). Dzięki zachodzącym procesom alternatywnego składania 

możliwości powstawania różnorodnych transkryptów stają się praktycznie nieograniczone. 

Wyodrębniono kilka typów zachodzących procesów, prowadzących do powstania 



21 
 

alternatywnych izoform mRNA. Przykładem jest wyłączenie pierwszego (AFE, ang. exclusion of 

first exon) oraz ostatniego eksonu (ALE, ang. exclusion of last exon). Wypinaniu z transkryptu 

mogą podlegać również eksony (alternatywne) znajdujące się pomiędzy konstytutywnymi 

eksonami. Innymi wariantami są: wybór alternatywnych miejsc 5’ i 3’ splicingu czy retencja 

intronu (5) (Ryc. 3). 

 

Rycina 3 Schematyczne przedstawienie możliwych procesów alternatywnego składania RNA. Wyłączanie, bądź 
włączanie eksonów alternatywnych może odbywać się na kilka różnych sposobów. (A,B) Poprzez aktywacje 
alternatywnych miejsc startu transkrypcji, bądź włączanie ostatniego eksonu z aktywnym PAS. (C,F) Włączanie 
lub wyłączanie eksonów alternatywnych znajdujących się wewnątrz genu. (D,E) Pojawienie się dodatkowych 
miejsc 3’ i 5’ skutkuje powstaniem skróconej wersji alternatywnego eksonu. (G) Część intronów może zostać nie 
wycięta. 

Główne znaczenie i wpływ na zachodzący proces alternatywnego splicingu mają 

konkurujące ze sobą miejsca splicingowe. O wyborze konkretnych miejsc decydują 

odpowiednie czynniki białkowe wiążące się w regionach cis RNA, a rozpoznające ulokowane w 

intronach bądź eksonach miejsca SRE (ang. splicing regulatory elements). Poprzez interakcje z 

konkretnymi czynnikami działającymi w trans, miejsca wiązania się białek SRE modulują 

przebieg splicingu. Do czynników działających w trans zalicza się grupę białek SR (ang. Ser/Arg-

rich proteins) oraz hnRNP (ang. heterogeneous ribonucleoprotein). W skład SRE wchodzą 

czynniki pełniące funkcję promującą zachodzenie splicingu, wiążące się w intronach (ISE, ang. 

intron splicingu enhancer) lub w eksonach (ESE, ang. exon splicingu enhancer). Oprócz istnienia 

wzmacniaczy, w rejonach intronowych przyłączają się również inhibitory splicingu (ISS, ang. 

intron splicingu silencer). Podobnie jest w rejonach eksonowych (ESS, ang. exon splicingu 

silencer) (6) (Ryc. 4). 

 



22 
 

 

Rycina 4 Białka regulujące proces składania RNA, w tym alternatywny splicing. Procesu składania RNA stanowi 
kluczowy element w dojrzewaniu prekursorów RNA, który musi podlegać istotnej regulacji. Do 
najpopularniejszych białek kontrolujących splicingu zaliczane są białka hnRNP oraz SR, które łącząc się do 
odpowiednich regionów w eksonach oraz intronach mogą wpływać negatywnie lub pozytywnie na cały proces.  
ISE – intronowy wzmacniacz splicingu; ISS – intronowy wyciszacz splicingu; ESE- eksonowy wzmacniacz splicingu; 
ESS – eksonowy inhibitor splicingu;PR – punkt rozgałęzień; Py – trakt polipirymidynowy. Białka hnRNP zostały 
zaznaczone schematycznie jako czynniki inhibujące a SR jako aktywujące. Tak jest w większości przypadków, 
jednak często te klasy białek mogą pełnić przeciwstawne funkcje. 

W przypadku zachodzenia alternatywnego splicingu, podstawową rolę odgrywa 

definiowanie odpowiednich regionów w nowopowstającym RNA, które fragmenty będą 

stanowić introny, a które eksony. U ssaków, fragmenty eksonowe są istotnie krótsze niż 

intronowe. Przeważa definiowanie tych pierwszych i z dużo większą częstotliwością dochodzić 

może do usunięcia alternatywnego eksonu niż do retencji intronu (7). 

Do głównych czynników mających bezpośredni wpływ na zajście alternatywnego 

splicingu należą białka SR oraz hnRNP. Poprzez oddziaływanie z elementami ISE i ESE, aktywują 

składanie RNA w konkretnych lokalizacjach. Białka SR i hnRNP uczestniczą ponadto w 

formowaniu się spliceosomu. Przykładowo, promowanie łączenia się U1 snRNP determinuje 

wybór miejsca splicingowego 5’, a działanie U2AF determinuje wybór miejsca splicingowego 

3’ (8, 9). Związane białka SR z miejscami ESE wzmacniają łączenie się U2 snRNP do miejsc 

rozgałęzień (10). 

Białka hnRNP są dużą grupą regulatorowych białek wiążących się z RNA, których 

aktywność głównie wiązana jest z wyciszaniem splicingu. Charakteryzują się one 

zróżnicowanym modelem działania. Dla przykładu, udowodniono, że białka hnRNP wchodzić 

mogą w interakcję z czynnikami regulującymi splicing, tj. SC35 i ASF/SF2 (8). 

Jednym z lepiej poznanych przedstawicieli grupy białek hnRNP są białka PTBP  

(ang. polypirimidine tract binding protein). Białko PTBP1, znane również pod nazwa hnRNP-I, 

łącząc się do fragmentów nowopowstającego, niedojrzałego transkryptu, bogatych w reszty C 

i U powoduje zahamowanie przebiegu splicingu. Jednocześnie siła działania PTBP może być 

modulowana poprzez specyficzną lokalizację traktów polipirymidynowych. Pojawienie się 



23 
 

dodatkowych miejsc wiązania dla PTB przy końcu 3’ alternatywnie usuwanego eksonu, to 

wzmacnia ono wydajne wycięcie go ze składanego RNA (11). 

1.1.1.3. Poliadenylacja na końcu 3’ RNA – dobudowanie ogona poli(A) 

Obróbka końca 3’ nowopowstałego transkryptu jest jednym z najważniejszych 

procesów zapewniających integralność cząsteczki RNA. Dodanie ogona poli(A) na końcu RNA 

jest zjawiskiem zachodzącym potranskrypcyjnie, dzięki któremu transport do cytoplazmy i 

proces translacji jest bardziej wydajny. Dodatkowo ogon poli(A) zabezpiecza nową cząsteczkę 

RNA przed degradacją (12). Zjawisko cięcia oraz poliadenylacji jest przeprowadzane przez duży 

kompleks białkowy, zawierający cztery główne subkompleksy – czynnik specyficzności cięcia i 

poliadynelacji (CPSF, ang. Cleavage and poliadenylation specific factor), czynnik stymulujący 

cięcie (CsfF, ang. Cleavage stimulation factor), czynnik cięcia I (CF Im, ang. Cleavage factor I) 

oraz czynnik cięcia II (CF IIm, ang. Cleavage factor II) (13). Oprócz tego, w reakcji poliadenylacji 

końca 3’ uczestniczą również polimerazy poliadenylowe (PAP, ang. Poli(A) polymerase), 

jądrowe białko wiążące się do poli(A) (PABPN, ang. Nuclear poly(A) binding protein) i białko 

Symplekin. Czynnik CPSF poprzez wiązanie się do sygnału poliadenylacji 5’-AAUAAA-3’  

(PAS, ang. poliadenylation signal) stanowi niezbędny element w procesie cięcia RNA (12). 

Miejsce PAS zlokalizowane jest w odległości 10-30 nukleotydów od miejsca, w którym zachodzi 

proces cięcia transkryptu. CstF rozpoznaje region bogaty w U bądź G i U. CstF swoją obecnością 

stabilizuje przyłączenie się CPSF do miejsca PAS (14). Czynnik cięcia CF Im wiąże się do 

motywów 5’-UGUA-3’ znajdującymi się przed miejscem PAS. Dzięki zaangażowaniu wszystkich 

wyżej wymienionych czynników (Ryc. 5) możliwe jest endonukleolityczne cięcie RNA, i w 

następnej kolejności dobudowanie do wolnego końca 3’ ogona poli(A) przez PAP. 

 

Rycina 5 Kompleksy białkowe zaangażowane w proces poliadenylacji. Schematyczny obraz regionu 
niekodującego po stronie 3’ (3’UTR) z zaznaczonymi sekwencjami do których wiążą się kompleksy białek 
zaangażowane w cały proces cięcia nowopowstałego RNA, a następnie poliadenylacji. 

 



24 
 

1.1.1.4. Alternatywna poliadenylacja (APA) 

Zjawisko APA zostało po raz pierwszy odnotowane w roku 1980. Badanie opisywało 

geny kodujące immunoglobulinę M (IgM) (15) oraz reduktazę dihydrofolianowej (DHFR) (16). 

Od tamtego momentu, do roku 1997 naukowcom z całego świata udało się opisać jeszcze 

około 95 genów posiadających APA (17). Dzięki rozwojowi bioinformatyki oraz metod analiz 

całotranskryptomowych takich jak RNA-seq wiedza na temat procesów APA jest stale 

poszerzana i uzupełniana. 

 

Rycina 6 Schematyczne przedstawienie możliwych procesów alternatywnej poliadenylacji. W sytuacji kiedy 
wybrane zostanie miejsce PAS wewnątrz sekwencji kodującej białko (CR-APA) prowadzić to może do powstania 
białka o zmienionej budowie. Aktywność PAS w 3’UTR skutkuje powstawaniem 3’UTR o różnej długości (UTR-
APA), co prowadzić może do wzmożonej regulacji konkretnej izoformy przez takie cząsteczki jak miRNA. 

Niemal wszystkie mRNA powstające w komórkach eukariotycznych oraz wiele 

niekodujących RNA to cząsteczki poliadenylowane (18). Wiele genów na końcu 3’ posiada kilka 

alternatywnych miejsc poliadenylacji (APAS, ang. alternative polyadenylation sites). 

Aktywność alternatywnych miejsc prowadzi do powstawania izoform, mogących różnić się 

długością 3’UTR (19). Uwzględniając lokalizacje miejsc poliadenylacji, zjawisko APA można 

podzielić na dwie główne kategorie (Ryc. 6). W pierwszej z nich poliadenylacja będzie 

zachodzić wewnątrz sekwencji kodującej eksony bądź introny i poprzez swoją aktywność 

prowadzić do istotnego skrócenia transkryptu kodującego białko skrócone o koniec 

karboksylowy. Ten typ APA nazwany jest alternatywną poliadenylacją regionów kodujących 

(CR-APA, ang. coding region-APA) (20). W drugiej sytuacji alternatywne miejsca poliadenylacji 

zlokalizowane są w 3’UTR. Ich zmienna aktywność prowadzi do powstawania transkryptów o 

różnej długości 3’UTR (UTR-APA, ang. untranslated region-APA). Wyróżnia się PAS 

proksymalne (PAS proks.), które poprzez swoją aktywność istotnie skracają 3’UTR. Natomiast 

aktywność PAS dystalnych skutkuje wydłużeniem 3’UTR. UTR-APA nie prowadzi do zmian w 



25 
 

sekwencji kodującej białko. Zmiany w długości 3’UTR mogą mieć jednak istotny wpływ na 

stabilność mRNA, efektywność z jaką mRNA będzie przepisywane na białko i transport. Dłuższe 

3’UTR podlegać mogą częściej regulacji przez cząsteczki miRNA (ang. microRNA), oraz białka 

wiążące się do RNA (RBP, ang. RNA binding protein). 

Badania prowadzone w ciągu ostatnich dwóch dekad wykazały tysiące przypadków, w 

których izoformy APA ulegają różnej ekspresji w różnych warunkach komórkowych. Globalna 

analiza sekwencjonowania z wykorzystaniem specjalnie zaprojektowanych bibliotek cDNA, 

takich jak EST (ang. expressed sequence tag) wykazała zmienność w częstości występowania 

APA w różnych tkankach (21). W części analizowanych tkanek dominował konkretny wariant 

RNA wynikający z wyboru odpowiedniego miejsca poliadenylacji, który z kolei w innych typach 

komórek występował rzadko. Dla przykładu PAS dystalne są preferowane w tkankach 

neuronalnych, gdy w przypadku komórek krwi obserwowany jest odwrotny trend (21). 

Również w przypadku różnych etapów procesu spermatogenezy zaobserwowano zmiany w 

wyborze PAS. 

W przypadku komórek nowotworowych zaobserwowano globalny trend 

występowania krótkich 3’UTR (22). Badanie zmian długości 3’UTR w nowotworach o różnym 

stopniu zaawansowania wykazało charakterystyczne zmiany w aktywności APA (23). Takie 

zjawisko wskazuje na bezpośrednie zaangażowanie procesu APA w zwiększony potencjał 

podziałów komórek nowotworowych oraz ich rozwój. Taka wiedza może służyć jako parametr 

prognostyczny oraz być wykorzystana jako ważny indykator stopnia zaawansowania choroby 

w diagnostyce nowotworów. Dzieje się już tak w przypadku badania komórek 

nowotworowych gruczołu piersiowego, gdzie okazało się, że różne typy komórek 

nowotworowych mogą wykazywać inne aktywności APA (24). W przypadku powszechnie 

stosowanych w badaniach modelowych komórek raka piersi MCF-7 dochodziło do skracania 

3’UTR w porównaniu do komórek prawidłowych. Z kolei w innym modelu, komórkach MB231, 

wykazano obecność dłuższych 3’UTR w przypadku większości analizowanych mRNA. 

Okazuje się, że procesowi APA podlegać mogą nie tylko pre-mRNA, ale również 

prekursorowe długie niekodujące RNA. Badanie oparte na analizie mysich lncRNA wykazało, 

że w przypadku co najmniej 66% znanych cząsteczek lncRNA zachodzi proces APA, jednak w 

odróżnieniu od APA w genach kodujących białko, w większości przypadków zachodził na 

początku transkryptów wywołując istotne skrócenie izoform lncRNA (25). Dla przykładu, 



26 
 

transkrypt NEAT1 (ang. nuclear paraspeckle assembly transcript 1) ma dwie izoformy – dłuższą 

(23000 nt) oraz istotnie skróconą (3700 nt). Długość skróconej izoformy wynika z aktywności 

PAS w początkowym rejonie transkryptu. W rezultacie występowanie różnych izoform NEAT1 

wpływał na wydajność tworzenia się skupisk jądrowych (ang. paraspeckles) (26). 

Regulacja aktywności APA zależeć może w dużej mierze od działania RBP (27). Niektóre 

RBP hamują terminację transkrypcji w poszczególnych PAS poprzez blokowanie wiązania się 

podstawowych czynników związanych z procesem poliadenylacji, a niektóre zwiększają wybór 

odpowiednich PAS poprzez rekrutację kluczowych czynników dla terminacji i poliadenylacji. 

Oba kierunki działania mogą być regulowane przez to samo białko w różnych kontekstach, jak 

pokazano dla neuronalnego RBP NOVA. Jego wiązanie w pobliżu PAS inhibuje proces 

poliadenylacji, podczas gdy wiązanie w innym miejscu RNA promuje ten proces (28). 

1.1.1.5. Zależność pomiędzy splicingiem, a poliadenylacją 

Główne mechanizmy, tj. splicing oraz poliadenylacja, będące podstawą w dojrzewaniu 

transkryptów RNA, bardzo często są ze sobą ściśle powiązane i wzajemnie na siebie wpływają. 

Jednym z przykładów jest bezpośrednia zależność pomiędzy jednym z głównych czynników 

odpowiedzialnych za cięcie transkryptu – CPSF-160 – a białkiem U1A snRNP. Poprzez 

bezpośrednią interakcję białko-białko, U1A wzmacnia wiązanie się CPSF-160 do PAS i tym 

samym podnosi wydajność procesu cięcia i poliadenylacji (29). Inną wcześniej opisaną 

zależnością jest oddziaływanie pomiędzy kompleksem CPSF a U2 snRNP (30) oraz U2AF65 a CF 

Im (31). Okazuje się, że sekwencje intronowe zaangażowane w definiowanie ostatniego 

eksonu, a zlokalizowane w pobliżu PAS mogą istotnie wpłynąć na aktywność procesu 

poliadenylacji (32). Delecja miejsc splicingowych 5’ nie wpływa na wydajność poliadenylacji, 

podczas gdy wprowadzenie mutacji 3’ miejsc splicingowych może blokować ten proces, 

potwierdzając że aktywność miejsc 3’ss oraz czynników splicingowych wiążących się z tymi 

miejscami jest ważna dla stymulacji procesu poliadenylacji. Zależność ta może również działać 

w przeciwną stronę. Mutacja w proksymalnym PAS prowadzić może do istotnych zaburzeń 

związanych z wycięciem ostatniego intronu w genach wieloeksonowych (33). 

 

 

 

 



27 
 

1.2. Długie niekodujące RNA (lncRNA) 

Klasyczne postrzeganie ekspresji genów w dużej mierze opierało się na znanym 

dogmacie, opisującym szlak DNA - mRNA - białko. Jednakże, na przestrzeni ostatnich dekad, 

bazując na wynikach analiz RNA-seq okazało się, że aż 75% ludzkiego genomu podlega 

transkrypcji. Dodatkowo ilość transkryptów niekodujących białka, tzw. długich niekodujących 

RNA (lncRNA), jest 4 razy większa niż transkryptów, z których to białka powstają (34). 

Udowodniono również, że lncRNA stanowią bardzo zróżnicowaną grupę cząsteczek, również 

pod względem ich powstawania. Sekwencje dla lncRNA mogą być zlokalizowane w wielu 

miejscach w genomie, tj. wewnątrz intronów genów kodujących pre-mRNA, w samych 

eksonach jak również w przestrzeniach międzygenowych. Tak duża różnorodność utwierdza w 

przekonaniu o modularnym modelu organizacji genów, w którym to możliwe jest 

przepisywanie sekwencji na wiele transkryptów sensowych, antysensowych, kodujących oraz 

niekodujących białko z jednego locus. Tak duża liczba zidentyfikowanych cząsteczek lncRNA 

rodzi zatem pytanie: skoro komórka zużywa tak dużo energii na biosyntezę tych cząsteczek, to 

w jaki sposób mogą być one przydatne dla jej funkcjonowania? Początkowo uznawano, że 

mnogość powstających lncRNA bierze się z mało specyficznego działania polimerazy II RNA 

(35). Na to mógłby dodatkowo wskazywać fakt bardzo niskiego poziomu zakonserwowania 

sekwencji lncRNA. Możliwym wytłumaczeniem jest to, że lncRNA w swojej sekwencji nie 

posiadają otwartej ramki odczytu (ORF, ang. open reading frame). Jednakże występują 

również takie cząsteczki lncRNA, które posiadają w swojej sekwencji krótkie zakonserwowane 

fragmenty, pełniące znaczącą rolę w procesach komórkowych. Przykładem może być gen Xist, 

który odpowiedzialny jest za wyciszanie ekspresji genów pochodzących z jednego z 

chromosomów X, w przypadku komórek żeńskich. W komórkach męskich pełni rolę 

regulatorową (36). Okazuje się jednak, że więcej lncRNA zaangażowanych jest w istotne 

procesy komórkowe, tj. różnicowanie, rozwój czy podziały komórkowe (37). Ich działanie 

opiera się na kontrolowaniu ekspresji genów poprzez wpływ na miejsca promotorowe (38), 

piętnowanie genomowe (ang. genome imprinting) (39) czy utrzymanie odpowiedniego 

uformowania chromatyny w jądrze komórkowym (40). 

 

 

 



28 
 

1.3. Krótkie niekodujące RNA (sncRNA) 

Do tej grupy zalicza się klasę małych jądrowych RNA (snRNA, small nuclear RNA), które 

tworzą cząsteczki RNA o długości nieprzekraczającej 200 nukleotydów. Zlokalizowane są 

głównie w jądrze komórkowym organizmów eukariotycznych. Do ich podstawowych funkcji 

należy regulacja ekspresji genów. Podczas tego procesu snRNA związane są z zestawem 

specyficznych białek, których kompleksy nazywane są jako małe jądrowe rybonukleoproteiny 

(snRNP, ang. small nuclear ribonucleoprotein). Podklasa snRNP nazywana jest małymi 

jąderkowymi RNA (snoRNA, ang. Small nuleolar RNA), które zlokalizowane są w jąderku i biorą 

udział w procesach dojrzewania takich cząsteczek jak rRNA, tRNA czy snRNA. 

Kolejną klasę tworzą cząsteczki RNA związane z białkiem Piwi (piRNA, ang. Piwi 

interacting RNA). Stanowią liczną grupę krótkich niekodujących RNA występujących w 

komórkach eukariotycznych (41). Ze swoją długością wynoszącą 25-30 nukleotydów są 

nieznacznie większe niż inne regulatorowe krótkie RNA. Poprzez formowanie kompleksów 

RNA-białko, piRNA zaangażowane są w epigenetyczne jak i potranskrypcyjne wyciszenie 

retrotranspozonów oraz innych elementów genetycznych w komórkach biorących udział 

podczas procesu spermatogenezy (42). 

Krótkie interferujące RNA (siRNA, ang. small interfering RNA) stanowią kolejną grupę 

krótkich, dwuniciowych cząsteczek RNA, których długość wynosi od 20-25 nukleotydów. SiRNA 

odgrywają istotną rolę w szlaku interferencji RNA (RNAi, ang. RNA interference) (43). Poprzez 

w pełni komplementarne wiązanie się jednej z nici siRNA, będącej elementem kompleksu 

wyciszającego indukowanego przez RNA (RISC, ang. RNA induced silencing complex), do mRNA 

prowadzą do jej degradacji i tym samym regulują poziom ekspresji genów. Mechanizm 

działania siRNA po raz pierwszy został odkryty w komórkach roślinnych (44), po czym prawie 

natychmiast został on wykorzystany jako molekularne narzędzie do kontrolowania poziomu 

ekspresji konkretnych genów w innych organizmach (45). Działanie siRNA oparte jest na 

podobnych zasadach jak w przypadku trzeciego reprezentanta grupy krótkich niekodujących 

RNA – miRNA. 

 

 

 



29 
 

1.3.1. mikroRNA 

W roku 1993, Victor Ambros wraz z Rosalind Lee oraz Rhondą Feinbaum, badając 

rozwój embrionalny C. elegans, odnotowali nowe zjawisko. Gen lin-4, pełniący istotną rolę 

podczas rozwoju badanego organizmu, okazał się nie być matrycą do produkcji białka, a 

lncRNA (46). Dodatkowo, z transkryptu tego powstawała para krótkich cząsteczek RNA. Jak się 

później okazało, posiadająca komplementarność do wielu miejsc w 3’UTR. Zależność poziomu 

mRNA genu lin-14, poprzez bezpośrednie działanie lin-4 została opisana (47), a następnie 

funkcjonalnie potwierdzona poprzez wykazanie negatywnego wpływu lin-4 na poziom białka 

lin-14, przy jednoczesnym braku obniżenia mRNA lin-14 (48). Wyniki te po raz pierwszy 

zaprezentowały model działania krótkich, niekodujących cząsteczek RNA – mikroRNA 

(miRNA), które poprzez wiązanie się do regionu 3’UTR mRNA regulują ich poziom ekspresji, a 

w następstwie także ilość powstających na bazie tych mRNA białek. 

Po prawie trzech dekadach badań wiemy, że lin-4 okazał się być pierwszym 

reprezentantem bardzo licznej grupy RNA nazwanych miRNA (49). Jest to rodzina krótkich  

(21-25 nt), niekodujących cząsteczek RNA, których obecność została potwierdzona w wielu 

różnych organizmach. Wysoki stopień zakonserwowania ewolucyjnego tych cząsteczek 

wskazuje na ich istotną rolę w toku ewolucji (50). miRNA stanowią ważny element w 

prawidłowym funkcjonowaniu komórek roślinnych oraz zwierzęcych. Szacuje się, że ok 50% 

genów kodujących białka jest pod kontrolą tych krótkich cząsteczek regulatorowych. Badania 

funkcjonalne wskazują, że niemal każdy znany proces komórkowy zależny jest od miRNA, co 

przekłada się na rolę regulatora komórkowej homeostazy. Przeprowadzone badania na 

modelach zwierzęcych, a w szczególności na myszach, polegające na wyłączaniu aktywności 

poszczególnych miRNA wykazały wpływ na działanie wielu narządów. Były to między innymi 

takie organy jak: układ szkieletowy (51), mózg (52), oczy (53), neurony (54), serce (55), mięśnie 

szkieletowe (56), płuca (57), nerki (58), wątroba (59) czy trzustka (60). Mając na uwadze 

istotną rolę, jaką odgrywają cząsteczki miRNA, można przypuszczać że jakakolwiek 

nieprawidłowość w powstawaniu bądź działaniu miRNA, będzie miała konsekwencje w 

funkcjonowaniu komórki, następnie tkanki, a w rezultacie całego organizmu. Przykładem 

takiego zaburzenia jest zmieniony profil ekspresji miRNA i jego następstwa obserwowane w 

komórkach nowotworowych. 

 



30 
 

1.3.1.1. Biogeneza miRNA - klasyczna droga powstawania miRNA 

 

Rycina 7 Schematyczne przedstawienie procesu biogenezy miRNA 

miRNA powstają ze swoich pierwotnych transkryptów zwanych pri-miRNA  

(ang. primary microRNA). Transkrypty te tworzone są w wyniku działania polimerazy II RNA, 

jako takie opatrzone są czapeczką na końcu 5’ (61), lecz nie zawsze poliadenylowane na końcu 

3’. Może mieć to związek z aktywnością działania mikroprocesora zaangażowanego w 

dojrzewanie miRNA, który może wymuszać wcześniejszą terminację transkrypcji (62). 

Utworzona wewnątrz pri-miRNA krótka struktura typu spinki do włosów (ang. hairpin 

structure) rozpoznawana jest przez oraz białko rozpoznające podwójną nić RNA - DGCR8 (ang. 

DiGeorge critical region 8) oraz białko z rodziny RNaz III – DROSHA. Razem białka te tworzą 

kompleks mikroprocesora, którego produktem działania jest ok. 70 nukleotydowa cząsteczka 

pre-miRNA, ciągle tworząca strukturę typu spinki do włosów. W naturze występują tysiące 

cząsteczek RNA, które tworzą strukturę przypominającą spinkę do włosów. Jednak tylko cześć 

z nich jest rozpoznawana jako cząsteczka prekursorowa w pri-miRNA i przetwarzana dalej w 

w kolejnych etapach biogenezy miRNA. Jest to wynikiem ścisłej kontroli biogenezy miRNA 

przez mikroprocesor. Kompleks ten faworyzuje pojedynczą strukturę spinki, której długość 

wynosi około 35 par zasad, oflankowaną z obu stron jednoniciowymi sekwencjami RNA (63). 

Nowopowstałe pre-miRNA następnie zostaje przetransportowane z jądra do cytoplazmy przez 

Eksportynę 5 (XPO5) (64, 65). W cytoplazmie na skutek działania kolejnej RNazy typu III – Dicer, 



31 
 

z pre-miRNA wycinany jest dwuniciowy, 20-25 nukleotydowy dupleks miRNA/miRNA* (66)(8). 

W biologii stosuje się dodatkową nomenklaturę miRNA opierającą się o nić, z które wywodzi 

się dojrzała cząsteczką miRNA. Wyróżniamy w takim wypadku cząsteczkę miRNA z nici od 

strony 5’ - miRNA-5p oraz strony 3’ - miRNA-3p. Co charakterystyczne, u człowieka DICER 

współpracuje razem z innym białkiem wiążącym się do dwuniciowej formy RNA – TRBP (ang. 

dsRBP trans-activation-responsive RNA-binding protein). Jedna z nici w dupleksie, 

reprezentująca dojrzałą formę miRNA, rozpoznawana przez białko Argonaute (AGO), 

wprowadzana jest do kompleksu wyciszającego ekspresję genów przez aktywność miRNA 

(miRISC, ang. miRNA-inducetd silencing complex). Druga z nici – miRNA* – zostaje 

zdegradowana i w tym układzie nie odgrywa ważnej roli w procesie kontroli ekspresji genów 

(67). MiRNA będąc kluczowym elementem w kompleksie miRISC, mimo niepełnej 

komplementarności (w odróżnieniu do siRNA) do docelowego regionu w mRNA (68), 

naprowadza oraz powoduje związanie całego kompleksu i prowadzi w ten sposób do 

zablokowania translacji bądź do deadenylacji i degradacji związanej cząsteczki mRNA (Ryc. 7). 

Potencjalnie oba miRNA, powstające z dupleksu pre-miRNA (miRNA oraz miRNA*) stanowić 

mogą funkcjonalną cząsteczkę.  

W ostatnich latach wykazano pewne wyjątki od reguły, w których to białka DROSHA, 

DICER1 oraz XPO5 stanowią niezbędny element podczas biogenezy miRNA. W 

przeprowadzonym w 2016 roku badaniu (69), po inaktywacji każdego z tyk białek z osobna i 

sekwencjonowaniu całej puli krótkich RNA (ang. small RNA-seq) okazało się, że gdy usunięcie 

Droshy skutkuje istotnym spadkiem poziomu wszystkich miRNA, tak w przypadku 

zablokowania białka Dicer poziom niektórych z miRNA pozostaje niezmieniony. Rezultat ten 

świadczyć może o istnieniu alternatywnych dróg powstawania miRNA, niezależnych od 

kanonicznej ścieżki biogenezy. Pełen proces dojrzewania miRNA może okazać się dużo bardziej 

złożony niż postrzegano do tej pory. 

1.3.1.2. Mirtrony – alternatywna ścieżka biogenezy miRNA 

W 2007 roku udokumentowano istnienie nowej grupy miRNA, tzw. mirtrony (70). 

Istnienie tej puli, 14 miRNA u muszki owocowej oraz 4 miRNA u nicieni, stanowiło niezwykłe 

odkrycie ze względu na fakt, że zlokalizowane są one w intronach genów kodujących białko i 

co najistotniejsze mogą powstawać bez udziału DROSHA. Sytuacja taka jest możliwa dzięki 

zachodzącemu procesowi składania eksonów przy jednoczesnym wycinaniu intronów z pre-



32 
 

mRNA. W tym właśnie momencie z wyciętego intronu, tzw. lariatu formuje się pre-miRNA, 

który następnie jest przetwarzany w dalszych etapach biogenezy miRNA. W konsekwencji 

powstaje dojrzała cząsteczka. Istotnym elementem w tym systemie jest odpowiednia długość 

intronu, który po wycięciu z pre-mRNA swoją długością zbliżony jest do naturalnie 

występujących pre-miRNA. 

1.3.1.3. Badania genomowe oraz identyfikacja kanonicznych cząsteczek 

miRNA 

Pomimo, że cząsteczki miRNA odkryte zostały na początku lat 90. XX wieku, to dopiero 

po około 15 latach technika masowego sekwencjonowania krótkich RNA zrewolucjonizowała 

badania nad miRNA (71, 72). Należy jednak pamiętać, że nie każda odkryta w 

sekwencjonowaniu krótka cząsteczka jest cząsteczką miRNA. Wiele z wyników RNA-seq może 

stanowić, np. wchodzące w interakcje z białkami Piwi krótkie RNA (piRNA, ang. Piwi-

interacting RNA) oraz endogennie występujące krótkie interferujące RNA (siRNA, ang. small 

interfering RNA) (72). W celu uniknięcia takich fałszywie pozytywnych odkryć nowych miRNA, 

postanowiono wprowadzić jasne i klarowne wytyczne co do definicji czy odkryta cząsteczka 

faktycznie jest miRNA. Przede wszystkim koniec 5’ takiego RNA musi być zgodny z przypisaną 

annotacją. Dodatkowo sekwencja musi być ściśle komplementarna z miejscem w genomie, 

gdzie przewidywana jest charakterystyczna struktura spinki do włosów i być komplementarna 

z drugą nicią RNA, wspólnie tworząc dupleks RNA (73). 

Stale rosnąca liczba nowo odkrywanych miRNA wymusiła stworzenie baz danych 

zbierających te wszystkie informacje. Jedną z najpopularniejszych baz jest miRBase 

(http://microrna.sanger.ac.uk) (74), obecnie zawierająca 1917 ludzkich prekursorów miRNA 

oraz 2656 dojrzałych cząsteczek miRNA (wersja V22) (75). Ze względu na ciągłe pojawianie się 

nowych cząsteczek, dużym wyzwaniem stała się weryfikacja tych doniesień.  

W 2019 J. Alles wraz z współpracownikami przeprowadziła eksperyment, mający na 

celu potwierdzenie ile tak naprawdę zdeponowanych krótkich cząsteczek w najpopularniejszej 

bazie danych miRBase jest rzeczywiście cząsteczką miRNA. W badaniu przeanalizowano 28 866 

dostępnych sekwencjonowań krótkich RNA, zawierających niemal 364 miliardy odczytów. 

Wyniki analiz bioinformatycznych zidentyfikowały 65% z 24 127 potencjalnych cząsteczek 

miRNA, jako wyniki fałszywie pozytywne. Ostatecznie wyniki grupy potwierdziły istnienie 2300 

cząsteczek miRNA, z czego 1115 znajduje się w bazie danych miRBase V22 (76).  

http://microrna.sanger.ac.uk/


33 
 

Oprócz bazy danych miRBase istnieje jeszcze kilka innych baz, zbierających informację 

o istniejących miRNA. Jednym z takich zbiorów jest miRGenDB (http://mirgenedb.org) – baza 

danych zawierająca mniejsza liczbę zdeponowanych cząsteczek, ale z dużą pewnością co do 

jakości wyników (77). Inną bazą jest miRCarta (https://mircarta.cs.uni-saarland.de). Zbiór ten 

charakteryzuje się również zweryfikowanymi eksperymentalnie danymi oraz zestawieniem 

literaturowo-potwierdzonych cząsteczek miRNA (78). 

1.3.1.4. Genomowa lokalizacja miRNA 

Obecnie mechanizm biogenezy miRNA z ich prekursorów jest już dość dobrze opisany. 

Jednakże wpływ oraz kontrola mechanizmów transkrypcyjnych oraz potranskrypcyjnych na 

wydajność biogenezy miRNA nadal wymaga dalszej analizy i badań. Genomowa lokalizacja 

genów kodujących prekursory miRNA jest główną determinantą, sugerującą jakie procesy 

będą zaangażowane, jak wydajnie biogeneza tych cząsteczek będzie przebiegać i jaki wpływ 

może mieć to na poziom ich ostatecznej ilości w komórce. Opierając się na genomowej 

lokalizacji, miRNA możemy ogólnie sklasyfikować jako “wewnątrzgenowe” (ang. intragenic) 

oraz “pozagenowe” (ang. intergenic). MiRNA wewnątrzgenowe zlokalizowane są najczęściej w 

intronach genów kodujących białko oraz lncRNA. Sekwencje kodujące miRNA zlokalizowane 

również mogą być w częściach eksonowych swoich genów-gospodarzy (ang. host gene). W 

dużej części przypadków podlegają tej samej regulacji transkrypcyjnej, co geny wewnątrz 

których się znajdują. Jednak badania wysokoprzepustowe wykazały, że miRNA 

wewnątrzgenowe, zlokalizowane w intronach swoich genów-gospodarzy, mogą powstawać 

jednocześnie jako niezależne jednostki transkrypcyjne, z wykorzystaniem własnych miejsc 

promotorowych (79, 80). Faktem jest, że około 20% miRNA znajdujących się w intronowych 

częściach genów-gospodarzy, poprzez sprzężenie zwrotne reguluje ich własny poziom 

ekspresji (81). Oprócz tego wyróżniamy miRNA znajdujące się na połączeniu intron-ekson oraz 

miRNA, których transkrypcja przebiega na nici antysensownej. miRNA pozagenowe, 

zlokalizowane pomiędzy zdefiniowanymi genami, posiadają swoje własne miejsca 

promotorowe i powstają również przy udziale polimerazy II RNA oraz w rzadkich przypadkach 

polimerazy III RNA. Z przeprowadzonych badań wynika, że miRNA pozagenowe mogą 

powstawać przy udziale dwóch dodatkowych mechanizmów (80). Pierwszy, nazwany 

“przeciekiem” (ang. readthrough), bazuje na zjawisku, podczas którego transkrypcja genu 

przebiega jeszcze kilka tysięcy par zasad za miejscem PAS, w którym dochodzi do przecięcia 

http://mirgenedb.org/
https://mircarta.cs.uni-saarland.de/


34 
 

RNA i dobudowania ogona poli(A). Przykładem miRNA, którego biogeneza może zależeć od 

opisanego przecieku transkrypcji, jest miR-21 (82). Drugim z mechanizmów, który 

odpowiedzialny jest za powstawanie prekursorów miRNA jest mechanizm “rozbieżnej 

transkrypcji” (ang. divergent transcription). W czasie tego procesu, ze wspólnego miejsca 

promotorowego dwie polimerazy RNA przeprowadzają niezależnie od siebie transkrypcję 

genów nici sens oraz antysens (83). 

Według miRBase (miRBase v.20, N=1,870; http://www.mirbase.org/) około 39% 

ludzkich miRNA stanowi grupę miRNA pozagenowych, a zatem w przybliżeniu 61% 

zdeponowanych w bazie danych miRNA stanowią cząsteczki wewnątrzgenowe. Wśród nich, 

około 86% zlokalizowanych jest w genach kodujących białko, a 84% z nich transkrybowana jest 

na tej samej nici kodującej, co pre-mRNA ich genu-gospodarza. Zdecydowana większość 

wewnątrzgenowych miRNA zlokalizowana jest w intronach – 90%. Pozostałe 10% przypisane 

zostało jako miRNA eksonowe, przy czym 80% eksonowych miRNA lokalizuje w niekodujących 

fragmentach genów (5’ oraz 3’ UTR, ang. untranslated region) (84) (Ryc. 8). 

  

http://www.mirbase.org/


35 
 

 

Rycina 8 Genomowy podział cząsteczek miRNA. 

1.3.1.5. Mechanizm działania miRNA 

Działanie miRNA rozpoczyna się od załadowania pojedynczej cząsteczki miRNA do 

kompleksu RISC. Będąc związany w kompleksie, miRNA nakierowuje RISC na mRNA poprzez 

komplementarne połączenie z niekodującym regionem w 3’UTR. Uznaje się, że fragment 

pomiędzy nukleotydami 2 i 8 w cząsteczce miRNA stanowi niezbędny element dla jego 

wiązania się do regulowanego miejsca w mRNA i nazywany jest miejscem źródłowym  

(ang. seed region) (68). Działanie miRNA można podzielić na dwa główne etapy. We wczesnej 

fazie działania regulatorowego miRNA następuje zablokowanie procesu translacji, przy braku 

zmian w stabilności docelowego mRNA. W kolejnych etapach dochodzi do degradacji takiego 

mRNA (85, 86). 

Uwzględniając bardzo krótką sekwencję wymaganą do związania się miRNA z 

docelowym miejscem w 3’UTR regulowanego transkryptu, można przyjąć że cząsteczki miRNA 

odgrywają szczególną rolę w kształtowaniu profilu ekspresji większości powstających genów. 

Biorąc do analizy zidentyfikowane regiony 3’UTR w ludzkim transkryptomie okazuje się, że w 

przypadku każdej z 90 silnie zakonserwowanych ewolucyjnie rodzin miRNA, współdzielących 

region źródłowy, istnieje średnio ponad 300 miejsc w 3’UTR do których będą wiązać się miRNA 



36 
 

na zasadzie 7-8 nukleotydowego sparowania. Jeżeli uwzględni się wiązanie regionu  

6-nukleotydowego, to liczba potencjalnie regulowanych regionów wzrasta średnio do 500 dla 

jednej rodziny miRNA (87). Do niektórych 3’UTR jedna cząsteczka miRNA może przyłączyć się 

w kilku miejscach, jak również jeden 3’UTR w swojej sekwencji może zawierać 

zakonserwowane ewolucyjnie miejsca wiązania dla kilku różnych rodzin miRNA. 

Po związaniu się miRNA z docelowym miejscem w mRNA, białko Argonaut (AGO) 

rekrutuje reprezentanta z grupy białek z licznymi powtórzeniami glicynowo-tryptofanowymi 

(GW). W przypadku ssaków jest to białko TNRC6. Białka te mają duże powinowactwo do AGO 

oraz zawierają domenę wyciszającą. Domena ta posiada reszty tryptofanowe, niezbędne do 

wiązania się z rybonukleazami specyficznymi dla miejsc poli(A) - PARN2 lub dla represora 

katabolitów węglowych (CCR4). CCR4 jest negatywnym regulatorem transkrypcji - jego 

działanie polega na skracaniu ogonów poli(A) w mRNA. Dodatkowym czynnikiem 

wpływającym na obniżenie poziomu regulowanego RNA jest rekrutacja kolejnych białek 

wiążących się do ogona poli(A), które prowadzą do deadenylacji i w następstwie do degradacji 

cząsteczek mRNA. Skrócone, bądź pozbawione całkowicie ogonów poli(A) cząsteczki mRNA 

zostają pozbawione czapeczki na końcu 5’, co skutkuje aktywacją egzonukleazy 1 (XRN2), która 

degraduje mRNA z aktywnością 5’-3’ (68). 

1.3.1.6. Znaczenie cząsteczek miRNA w rozwoju oraz w chorobie 

miRNA stanowią cząsteczki regulujące liczne procesy wewnątrzkomórkowe, a ich 

obecność jest niezbędna do prawidłowego rozwoju organizmu. Wykazano, że nokaut genu 

Dicer w mysim modelu prowadzi do śmierci organizmu w 7. dniu rozwoju embrionalnego (88). 

Oprócz rozwoju embrionalnego udowodniono, że miRNA kontrolują metabolizm, podziały 

komórkowe czy dojrzewanie komórek nerwowych (89). Do procesów, w których miRNA pełnią 

znaczącą funkcje regulatorową zaliczone są rozwój mózgu (90), różnicowania komórek 

mięśniowych (91) czy prawidłowe różnicowanie komórek macierzystych (92). Zaburzenia w 

ilości oraz funkcjonowaniu cząsteczek miRNA prowadzić może do licznych patologii, z pośród 

których dużą grupę stanowią różne etapy nowotworzenia. Ponad 50% miRNA zlokalizowanych 

jest we wrażliwych miejscach w genomie, w których obserwowane są częste delecje lub 

insercje. Potwierdzają to wyniki badań prób pochodzących od pacjentów onkologicznych (93). 

miRNA, w zależności od pełnionej roli, dzieli się na dwie kategorie: onkogeny (ang. OncomiR) 

oraz supresory nowotworzenia (94). OncomiR poprzez blokowanie działania czynników 



37 
 

supresorowych promują rozwój nowotworów. Przykładami oncomiR są miR-221/222 (95), 

miR-27a (96) czy miR-21 (97–99). W odróżnieniu od oncomiR, istnieje grupa miRNA których 

rolą jest blokowanie powstawania nowotworów, poprzez bezpośrednią supresję działania 

onkogenów. Przykładami takich miRNA są miR-145 (100), miRNA z rodziny let-7 (101) oraz  

miR-205 (102). 

1.3.2. mikroRNA-21 

miR-21 już niemal od dwóch dekad stanowi cel badań wielu naukowców na całym 

świecie (103). Ilość i powszechność występowania tej cząsteczki w komórkach różnego typu 

daje podstawy do twierdzenia, iż zaangażowany jest w istotne procesy komórkowe.  

miR-21 występuje niemalże w każdym typie komórek ssaczych i odgrywa szczególną rolę w 

takich procesach jak rozwój komórki, jej podziały czy apoptoza. miR-21 jako jeden z pierwszych 

był intensywnie badany i analizowany pod kątem procesów biogenezy i dojrzewania. 

Podwyższony poziom tego miRNA obserwowany jest w większości nowotworów, jak również 

chorób układu sercowo-naczyniowego. Przykładowo, badania przeprowadzone na myszy z 

podwyższoną ekspresją miR-21 wykazały, że ten miRNA bierze czynny udział w powstawaniu 

chłoniaka złośliwego (ang. Malignant B-cell lymphoma) (104). Pomimo intensywnych badań, 

pozostaje wciąż wiele niewiadomych dotyczących biogenezy miR-21, a przede wszystkim 

mechanizmów regulujących ten proces. Poznanie ich może stanowić możliwość do 

opracowania narzędzi pozwalających wpłynąć bezpośrednio na procesy w które 

zaangażowane jest miR-21. 

1.3.2.1. Genomowa lokalizacja oraz regulacja biogenezy miR-21 

Gen kodujący miR-21 zlokalizowany jest na chromosomie 17 (17q.23.1), w intronie 11. 

genu kodującego wakuolarne białko membranowe VMP1 (ang. Vacuole membrane protein 1). 

Prowadzone badania wykazały, że w obrębie genu kodującego pri-miR-21 znajdują się silnie 

zakonserwowane miejsca promotorowe (105). W 2008 roku została przeprowadzona 

dokładna analiza miejsc promotorowych dla transkrypcji prekursora miR-21 (miPPR-21) 

(106)(50). Miejsce to zawiera charakterystyczne sekwencje promotorowe dla polimerazy RNA 

II, tj. TATA, CCAAT oraz motywy bogate w GC. Dodatkowo zidentyfikowano miejsca wiązania 

dla czynników transkrypcyjnych, tj. białko aktywatorowe 1 (AP-1, ang. Activator protein 1), 

Ets/PU.1, białko alfa wiążące się do motywu CCAAT (C/EBPα, ang. CCAAT/enhancer-binding 

protein alfa,), czynnik jądrowy 1 (NF1, ang. Nuclear factor I), czynnik odpowiedzi na surowicę 



38 
 

(SRF, ang. Serum response factor), białko p53 oraz przekaźnik sygnałów i aktywator 

transkrypcji 3 (STAT3, ang. Signal transducer and activator of transcription 3) (107). 

Potencjalne miejsca wiązania dla tak wielu czynników transkrypcyjnych, zaangażowanych w 

szlaki sygnałowe różnego typu stymulacji po raz kolejny dowodzą istotności miR-21 i jego 

zaangażowania w odpowiedzi na zmieniające się warunki w komórce. 

Transkrypcyjna kontrola poziomu miR-21 wydaje się być swego rodzaju fenomenem. 

Dla większości badanych miRNA, których poziom ulega istotnej zmianie w nowotworach, nie 

zaobserwowano zmian w ilościach ich prekursorów. Taka obserwacja wskazuje na to, że w 

zmienny poziom miRNA w przypadku nowotworów, zaangażowany musi być mechanizm 

potranskrypcyjny. W opisanej analizie, w przypadku miR-21 odnotowano silną korelację 

między wzrostem poziomu transkryptu pri-miR-21, a ilością dojrzałej cząsteczki miRNA (108). 

Badanie z 2007 roku wykazało z kolei, że poziom miR-21 może być także uzależniony 

od hipometylacji DNA, wywołanej np. w nowotworowych komórkach jajnika (OVCAR3) (109). 

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że poziom miR-21 kontrolowany jest nie tylko 

na poziomie transkrypcyjnym, ale również potranskrypcyjnym. Dla przykładu, w komórkach 

mięśni gładkich, białka morfogenetyczne kości (BMP, ang. Bone morphogenic proteins) 

wspólnie z transformującym czynnikiem wzrostu beta (TGF-β, ang. Transforming growth 

factor beta) przyczyniają się do zwiększonego poziom miR-21 poprzez rekrutację RNA helikazy 

p68 (DDX5) do pri-mir-21, która stabilizuję działanie białka DROSHA (110).  

1.3.2.2. Znaczenie miR-21 podczas rozwoju embrionalnego 

Tuż po zapłodnieniu, komórka embrionalna z powodu braku odpowiednich czynników 

transkrypcyjnych, zależna jest od RNA pochodzącego od matki. W momencie, gdy genom 

komórki embrionalnej jest w pełni aktywny, RNA matczyne ulega stopniowej degradacji. 

Dokładnie w tym momencie zaangażowanie cząsteczek miRNA staje się dominujące (111). W 

badaniu przeprowadzonym na modelu zwierzęcym Danio pręgowany (ang. Zebrafish), okazało 

się że miR-21 był obserwowany już we wczesnym stadium rozwoju embrionalnego. Badacze 

zaobserwowali, że w 12-tej godzinie od zapłodnienia poziom tego miRNA stanowił 40% 

wszystkich badanych cząsteczek miRNA (112). W innym doświadczeniu, pracując na modelu 

pstrąga tęczowego (ang. Rainbow trout), naukowcy zaobserwowali istotny przyrost ilości  

miR-21, jak również zwiększoną ekspresję genu Stat3 (czynnika transkrypcyjnego 



39 
 

zaangażowanego w transkrypcję pri-miR-21), podczas rozwoju embrionalnego (113). 

Podobnie jak w analizie przeprowadzonej na Danio pręgowanym, również i w tym przypadku 

wysoki poziom miRNA odpowiedzialny był za degradację matczynego mRNA. 

Represor neuronalny REST (wyciszający czynnik transkrypcyjny RE1, ang. RE1-silencing 

transcription factor) ulega wysokiej ekspresji w mysich komórkach macierzystych. 

Heterozygotyczna delecja tego czynnika, bądź jego wyciszenie przy pomocy siRNA prowadzi 

do zaburzeń w procesie samoodnowy tych komórek. Profilowanie poziomu miRNA wykazało, 

że białko Res wpływa negatywnie na poziom wielu miRNA, w tym miR-21. W takim przypadku, 

brak miR-21 wpływa na zaburzenia poziomu ekspresji czynników kluczowych podczas 

samoodnowy komórek macierzystych, którymi są Oct4, Nanog oraz Sox2. Nadekspresja  

miR-21 obniża możliwości samoodnowy komórek niemalże o 60% (114). Badanie te pokazują, 

że w prawidłowym funkcjonowaniu embrionalnych komórek macierzystych, istotną rolę 

odgrywa prawidłowy poziom miR-21. 

Morfogeneza rozgałęzień (ang. branching morphogenesis) stanowi podstawowy 

proces w rozwoju organów, tj. gruczołów zewnątrzwydzielniczych, płuc czy nerek. Badanie 

mysich embrionalnych gruczołów podżuchwowych stanowi podstawę w badaniu rozwoju 

organów, w tym również morfogenezy rozgałęzień. Wykazano, że degradacja macierzy 

zewnątrzkomórkowej wywołana przez metaloproteinazy macierzy (MMP, ang. matrix 

metalloproteinases) prowadzi do wzmocnienia morfogenezy rozgałęzień, ponieważ macierz 

zewnątrzkomórkowa w mezenchymie ulega przebudowie podczas rozwoju ślinianki 

podżuchwowej. Białko RECK stanowi inhibitor dla MMP i jego inhibicja prowadzi do 

przyspieszenia zajścia morfogenezy. W 2011 roku Hayashi i wsp. wykazali, że miR-21 poprzez 

oddziaływanie na MMP wpływa pośrednio na proces morfogenezy rozgałęzień (115). 

1.3.2.3. miR-21 w kancerogenezie 

Naukowcy na całym świecie zaczęli uważniej przyglądać się udziałowi miRNA w 

chorobach nowotworowych, w momencie odkrycia globalnych zmian w poziomie ekspresji 

wielu reprezentantów tej grupy w materiale pochodzącym z guzów od pacjentów 

onkologicznych (116). Biorąc po uwagę, jak znaczące są zmiany obserwowane w poziomie 

przeważającej liczby miRNA w tkankach nowotworowo zmienionych, uznano, że muszą być 

one zaangażowane w procesy karcynogenezy. W przeprowadzonym wielkoskalowym badaniu, 

w którym uczestniczyło 540 badanych okazało się, że miR-21 jako jedyny ma podwyższony 



40 
 

poziom w większości badanych typów nowotworów takich jak, rak płuca, sutka, prostaty, jelita 

grubego czy trzustki. W kolejnych badaniach miR-21 uzyskał już miano onkogennego miRNA 

(ang. oncomiR) co potwierdził podwyższony poziom tej cząsteczki w przeważającej liczbie 

nowotworów (97–99). 

Badania funkcjonalne wykazały, że rola miR-21 w genezie chorób nowotworowych 

opiera się na jego bezpośrednim zaangażowaniu w procesy proliferacji komórek, 

zahamowanie procesów apoptotycznych, zwiększenie potencjału inwazyjności komórek i 

tworzenia przerzutów (117–120) (Tabela 1). 

  



41 
 

Typ 
nowotworu 

Poziom miR-21 Rola miR-21 

Geny 
regulowane 
przez miR-21 

Referencje 

Rak żołądka Podwyższony 

Promuje podziały 
komórek oraz 
możliwość ich 

przerzutów 

PTEN, PDCD4, 
RECK 

(121, 122) 

Rak jelita 
grubego 

Podwyższony 
Formowanie się 
guza, metastaza 

SMAD7, SMAD6, 
ITGβ4, PDCD4 

(97, 123) 

Glejak Podwyższony 

Wzrost komórek, 
przyspieszone 

podziały 
komórkowe, 
różnicowanie 

komórek 
macierzystych w 
nowotworowe 

PTEN, RECK, 
FasL, PDCD4, 

Bcl2 

(124) 

Rak piersi Podwyższony 

Zwiększona 
przeżywalność 

komórek, 
zmniejszone 

procesy 
apoptotyczne, 
oporność na 

leczenie 

PTEN, PDCD4, 
TPM1, RTN4, 

LZTFL1 

(125, 126) 

Rak płuc Podwyższony 

Zmniejszone 
procesy 

apoptotyczne, 
przyspieszone 

podziały 
komórkowe, 
blokowanie 

aktywacji czynnika 
NF-κB 

PTEN, PDCD4, 
Smad7, Bcl2, 

EGFR, Cas8, TGFβ 

(127, 128) 

Rak prostaty Podwyższony 

Zwiększona 
inwazyjność, 

przerzuty, 
zmniejszone 

procesy 
apoptotyczne, 

niezahamowany 
wzrost 

RECK, MARCKS, 
PDCD4, TPM1, 

PTEN 

(129) 

Tabela 1 Znaczenie miR-21 w różnych typach nowotworów 

  



42 
 

2. Cel pracy 

Cząsteczka regulatorowa miR-21 jest jedną z najpowszechniej występujących form 

miRNA w komórkach zwierzęcych. Odgrywa ważną rolę w rozwoju embrionalnym oraz 

uczestniczy w utrzymaniu homeostazy komórek w dojrzałym organizmie. Jej znacząco 

podwyższony poziom obserwowany jest w większości nowotworów. Mimo dosyć dobrze 

poznanej funkcji jaką pełni miR-21, nadal nie wiadomo jakie procesy molekularne mogą być 

bezpośrednio zaangażowane w regulację poziomu tego miRNA.  

Zasadniczym celem niniejszej pracy było określenie zależności pomiędzy 

potranskrypcyjnymi mechanizmami biorącymi udział w dojrzewaniu pierwotnych 

transkryptów pri-miR-21, takich jak alternatywny splicing (AS) oraz alternatywna 

poliadenylacja (APA), a efektywnością biogenezy miR-21. Te potranskrypcyjne procesy są 

nieodłącznymi elementami dojrzewania niemal wszystkich prekursorowych RNA, w tym 

prekursorów miRNA. Potranskrypcyjne mechanizmy obróbki pri-miR-21 mogą mieć istotne 

znaczenie w fizjologicznej regulacji poziomu miR-21 oraz w patogenezie wielu chorób. 

Sekwencja kodująca miR-21 zlokalizowana jest w regionie 3’UTR genu wakuolarnego 

białka membranowego 1 (VMP1). W literaturze opisanych jest wiele zależności pomiędzy 

poziomem ekspresji genu-gospodarza, a biogenezą zakodowanych w nim miRNA. Dlatego 

pierwszym celem pracy była ocena zależności transkrypcji genu VMP1, a biogenezą miR-21. 

Aktywność alternatywnych miejsc poliadenylacji (APAS) genu VMP1 oraz pri-miR-21 

może mieć istotne znaczenie dla biogenezy miR-21. Dlatego też drugim celem pracy 

doktorskiej było określenie znaczenia APAS w transkryptach powstających z locus VMP1 w 

kształtowaniu ilości dojrzałej cząsteczki miR-21. 

Prekursor pri-miR-21, obejmuje obszar kilku eksonów VMP1, w związku z czym może 

podlegać procesowi składania RNA podobnie jak pre-mRNA jego genu-gospodarza. 

Uwzględniając istnienie zależności pomiędzy procesami splicingu oraz poliadenylacji, 

postanowiono również zbadać potencjalny wpływ alternatywnego splicingu pri-miR-21 na 

wybór APAS i tym samym wydajność biogenezy miR-21. 

 

  



43 
 

3. Materiały i metody 

3.1. Konstrukty genetyczne GFP_pri-miR-21 

Jako matrycy do uzyskania konstruktu GFP_pri-miR-21 zastosowano szkielet wektora  

pEGFP-C1 (Addgene; 6084-1). Na potrzeby badań wektor ten najpierw został odpowiednio 

zmodyfikowany poprzez usunięcie miejsca SV40pA (miejsce sygnałowe dla terminacji 

transkrypcji). Do uzyskania wszystkich konstruktów, jak również do wprowadzenia 

zaplanowanych mutacji korzystano z zestawu NEBUilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit  

(New England Biolabs; E5520), który bazuje na metodzie klonowania Gibsona  

(ang. Gibson assembly). Metoda ta jest bardzo wydajną i efektywną techniką klonowania. 

Opiera się na aktywności egzonukleazy, która poprzez swoje działanie tworzy, tzw. “Lepkie 

końce” od 5’ strony dwuniciowej części DNA, a następnie zawarta w mieszaninie ligaza łączy 

nowo powstałe lepkie końce. Podstawą prawidłowego działania tej metody jest takie 

zaprojektowanie wstawianej części, aby posiadała ona przynajmniej 15-20 komplementarnych 

nukleotydów do wcześniej zlinearyzowanego wektora. Linearyzacja wektora może przebiegać 

w różny sposób, tj. cięcie enzymami restrykcyjnymi bądź reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR, 

ang. polymerase chain reaction) z wykorzystaniem odpowiednio wydajnego enzymu 

polimerazy (ang. High fidelity polymerase). Do linearyzacji wektora pEGFP-C1 używano 

CloneAmp HiFi PCR Premix (Takara Bio; 639298). Dzięki działaniu odpowiednio 

zaprojektowanym starterom możliwe było usunięcie danych fragment z wektora. Razem z 

usunięciem sekwencji SV40pA, do wektora wprowadzona została sekwencję pri-miR-21  

(4469 pz). Sekwencja została namnożona z genomowego DNA z komórek HeLa, z 

wykorzystaniem wysokowydajnej polimerazy Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New 

England Biolabs; M0491). 

Lp. Nazwa Wielkość konstruktu (pz) 

1 GFP_pri-miR-21_wt 8885 

2 GFP_pri-miR-21_wt_miR-21_mut 8885 

3 GFP_pri-miR-21_∆3ss_miR-21_mut 8874 

4 GFP_pri-miR-21_∆PAS proks.1_miR-21_mut 8881 

Tabela 2 Spis konstruktów używanych w pracy doktorskiej. 

 

 



44 
 

 

 

Rycina 9 Schematyczne przedstawienie konstruktów genetycznych GFP_pri-miR-21 stosowanych  
w pracy doktorskiej. 

Starter forward do namnożenia pri-miR-21 

 

 5’-ACGAGCTGTACAAGTGACAAGTCAGAGAGAGGGCG-3’ 

 

Starter reverse do namnożenia pri-miR-21  

 

 5’-TCAGTTATCTAGATCGACTAGAGGCTGACTTAGAAATTT-3’ 

 

Uzyskany wektor GFP_pri-miR-21_wt dodatkowo został zmodyfikowany w taki sposób, 

aby móc być w stanie zliczyć poziom egzogennej cząsteczki miR-21, przy zachowaniu 

niezmienionej struktury drugorzędowej RNA. W tym celu wprowadzono 3 mutacje punktowe 

w miejscu kodującym dojrzałą cząsteczkę miR-21-5p. Mutacje te uzyskano przy użyciu 

starterów: 

 

Starter forward do wprowadzenia mutacji miR-21-5p w GFP_pri-miR-21 

 

 5’-ATCGGACTGCTGTTGGCTGTTGAATCTCATGGCAACACCA-3’ 

 

Starter reverse do wprowadzenia mutacji miR-21-5p w GFP_pri-miR-21 

 



45 
 

 5’-CAACAGCAGTCCGATAAGCTACCCGACAAGGTGGTAC-3’ 

 

W celu uzyskania plazmidu z usuniętym miejscem poliadenylacji (AATAA), który znajduje 

się 198 pz przed sekwencją kodującą miR-21 (PAS proks.) ponownie zastosowano zestaw 

NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England Biolabs; E5520) z zaprojektowanymi 

starterami w taki sposób, aby usunąć dany fragment wektora. Reakcje przeprowadziłem na 

bazie wektora GFP_pri-miR-21_miR-21_mut ze zmienioną sekwencją kodującą miR-21-5p. 

 

Starter forward do delecji fragmentu PAS proks. z wektora GFP_pri-miR-21_miR-21_mut 

 

 5’-GGGAGGAACAATTTTACTTTTTTCCTTTAGGAG-3’ 

 

Starter reverse do delecji fragmentu PAS proks z wektora GFP_pri-miR-21_miR-21_mut 

 

 5’-AAAATTGTTCCTCCCAAGCAAAACA-3’ 

 

W celu uzyskania plazmidu z usuniętym miejscem 3’ splicingu (3’ss) (CTACAGGGAGA), 

ponownie użyto zestawu NEBUilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (New England Biolabs; 

E5520) z zaprojektowanymi starterami w taki sposób, aby usunąć dany fragment wektora. 

Reakcje przeprowadzono na bazie wektora GFP_pri-miR-21_miR-21_mut ze zmienioną 

sekwencją kodującą miR-21-5p. 

 

Starter forward do przeprowadzenia delecji fragmentu 3’ splicingowego z wektora 

GFP_pri-miR-21_miR-21_mut 

 

 5’-ATTTATTTAAACTGGTTGTCCTGGATGTTTGA-3’ 

 

Starter reverse do przeprowadzenia delecji fragmentu 3’ splicingowego z wektora  

GFP_pri-miR-21_miR-21_mut 

 

 5’-CCAGTTTAAATAAATGCAGAACAATGCAATGA- 3’ 

 



46 
 

Produkty PCR wizualizowane były w żelu agarozowym z bromkiem etydyny (Sigma; E1510). 

Następnie wycięte kawałki żelu agarozowego z produktem PCR oczyszczone zostały na 

kolumnach membranowych Gel-Out Concentrator (A&A Biotechnology;023-50). Do reakcji 

ligacji użyto 100ng, zlinearyzowanego plazmidu, który ligowany był z odpowiednią wstawką, 

w molarnym stosunku 1:2 (plazmid:wstawka). Proces ligacji trwał przez 45 minut, w 

temperaturze 50°C. Po tym czasie transformowałem komórki kompetentne E. Coli DH5α 

stosując protokół szoku cieplnego. 

3.2. Hodowle bakteryjne 

Rozmrożone na lodzie komórki kompetentne E. Coli DH5alfa zmieszano z połową 

wcześniej przygotowanej mieszaniny ligacyjnej. Następnie całość inkubowano na lodzie przez 

30 min. Po tym czasie komórki zostały umieszczone w termobloku ustawionym na 42°C na  

2 min, a następnie od razu przełożone komórki do lodu na kolejne dwie minuty. Po inkubacji 

na lodzie do komórek dodano podgrzaną do 37°C pożywkę LB (1% Bacto Tryptone, 0,5% Yeast 

Extract, 1% NaCl) i inkubowano całość w 37°C przez 2 h. Po inkubacji bakterie wysiano na szalki 

z LB z dodatkiem agaru oraz obecnością odpowiedniego antybiotyku (ampicylina 100 mg/ml; 

kanamycyna 50 mg/ml). Po całonocnej inkubacji w cieplarce nastawionej na temperaturę 

37°C, wyselekcjonowano pojedynczą kolonię bakteryjną i przy użyciu PCR kolonijnego 

wstępnie weryfikowano jej zawartość (ang. colony PCR). Kolonie z pozytywnym wynikiem na 

zawartość konstruktu z insertem umieszczano w płynnej pożywce LB z dodatkiem antybiotyku 

i inkubowano kolejną noc w 37°C. 

3.3. Eksperymenty na liniach komórkowych 

3.3.1. Spis stosowanych linii komórkowych 

Nazwa Krótki opis Organizm Numer ATCC 

HeLa Rak szyjki macicy Homo sapiens (ATCC® CRM-CCL-2) 

NIH3T3 Embrionalne komórki skóry Mus musculus (ATCC® CRL-1658) 

HSkM Pierwotne komórki mięśniowe Homo sapiens 
(ATCC® PCS-950-

010) 

MCF-12A 
Komórki niezmienione gruczołu 

piersiowego 
Homo sapiens (ATCC® CRL-10782) 

MCF-7 
Komórki nowotworowe gruczołu 

piersiowego 
Homo sapiens (ATCC® HTB-22) 

Tabela 3 Linie komórkowe używane w pracy doktorskiej 



47 
 

3.3.2. Hodowla oraz różnicowanie komórek 

Do hodowli komórek HeLa, NIH3T3, Cos7, A549 używane było pełne medium hodowlane 

DMEM z L-glutaminą I 4,5g/l glukozą (ang. Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z dodatkiem 

10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS, ang. Fetal Bovine Serum) oraz 1% antybiotykiem-

antymykotykiem (Sigma). Komórki MCF-7 oraz MCF-12A hodowane były w pożywce EMEM 

(ang. Eagle's Minimal Essential Medium; Lonza) suplementowanej do 10% FBS, 1% roztworem 

modyfikowanej ludzkiej insuliny (Insulin, human recombinant), 1% antybiotykiem-

antymykotykiem. Komórki HSkM hodowane były w pożywce HAM-F10, suplementowanej do 

20% FBS, 1% antybiotykiem-antymykotykiem, 10 ng/ml EGF (ang. Epidermal Growth Factor), 

0,4 μg/ml deksametazonem (ang. Dexamethasone).  

Różnicowanie komórek HSkM wykonane zostało poprzez zmianę pożywki na różnicującą - 

DMEM z 4,5 g/l glukozy i suplementowanym do 2% końską surowicą, 1% antybiotykiem-

antymykotykiem. Wszystkie hodowle komórkowe prowadzone były w inkubatorze, w 

standardowych warunkach (37°C i 5% CO2). 

3.3.3. Transfekcje komórek 

Do transfekcji komórek siRNA wykorzystano Lipofektamine RNAiMAX (ThermoFisher; 

13778100). Do transfekcji konstruktami genetycznymi oraz antysensownymi 

oligonukleotydami (AON) wykorzystano Lipofektamine 3000 (ThermoFisher; L3000150). 

Transfekcje wykonywane były zgodnie z protokołami producentów. Informacje dotyczące 

stężeń siRNA/AON oraz czasu traktowania komórek zamieszczone zostały w podpisach do 

odpowiednich rycin. W przypadku eksperymentów z konstruktami genetycznymi, do 

transfekcji używano ilości plazmidu wynoszącego 1-2 µg. 

3.3.4. Spis stosowanych oligonukleotydów 

Oznaczenia stosowane w zapisie mieszanych oligonukleotydów. 

d DNA 

r RNA 

m 2′-O-metylo-RNA (2′OMe-RNA) 

* szkielet tiofosforanowy (PS, ang. phosphorothioate) 

P fosforan 



48 
 

 

 

Antysensowne oligonukleotydy (AON) 

Nazwa Sekwencja 

CTRL AON 

5'-mC*mC*mA*mG*mC*mA*mA*mG*mC*mA*mC*mA*mG*mG*mC 

*mA*mG*mC*mG*mG*mG-3' 

(Eurogentec) 

PAS proks. AON 

5’-mU*mU*mG*mU*mU*mU*mA*mU*mU*mU*mU*mC*mC* 

mU*mC*mC*mC*mA*mA*mG*mC-3’ 

(Eurogentec) 

3’ss AON 

5’-mU*mG*mU*mA*mG*mA*mA*mA*mU*mA*mA*mA*mU* 

mG*mC*mA*mG*mA*mA*mC*mA-3’ 

(Eurogentec) 

Tabela 4 Antysensowne oligonukleotydy (AON) stosowane w pracy doktorskiej 

Dupleksy siRNA 

Nazwa Sekwencja 

siCTRL_S 
5’-P-rUrArArGrGrCrUrArUrGrArArGrArGrArUrArCdTdT-3’  

(Future Synthesis) 

siCTRL_AS 
5’-P-rGrUrArUrCrUrCrUrUrCrArUrArGrCrCrUrUrAdTdT-3’ 

(Future Synthesis) 

siDROSHA_S 
5’-P-rCrGrArGrUrArGrGrCrUrUrCrGrUrGrArCrUrUdTdT-3’ 

(Future Synthesis) 

siDROSHA_AS 
5'-P- rArArGrUrCrArCrGrArArGrCrCrUrArCrUrCrGdTdT-3' 

(Future Synthesis) 

siCPSF3 

SMART Pool ON-TARGETplus siRNA, Human CPSF3 (51692) 

(Dharmacon nr kat. L-006365-01-0005) 

(GTGTCATTATAGCGGGAT, 

GTTCATAATCCTCGGAATA, 

CGATGAATCCCTCCGAGAA, 

TGAGAAACGTGAAGAGCGA) 

Tabela 5 Dupleksy siRNA stosowane w pracy doktorskiej 

 



49 
 

 

 

3.3.5. Izolacja RNA i odwrotna transkrypcja 

Całkowity RNA z komórek izolowany był przy użyciu TRIzol™ Reagent (ThermoFisher; 

15596018) oraz oczyszczany na minikolumnach (AABiotech; 043-100). Dodatkowo w trakcie 

oczyszczania na kolumnach, RNA było trawione DNazą. Do reakcji odwrotnej transkrypcji 

używane było 500-1000 ng całkowitego RNA, z wykorzystaniem zestawu TranScriba Kit 

(AABiotech; 4000-100). W reakcji odwrotnej transkrypcji używano starterów losowych 

heksametrów lub startera oligo-dT. 

3.3.6. Odwrotna transkrypcja dla cząsteczek miRNA 

Do uzyskania materiału, niezbędnego do analiz poziomu ilości miRNA, zastosowano zestaw 

qScript microRNA cDNA Synthesis Kit (Quantabio; 95107-100). W celu utrzymania cDNA z 

krótkich fragmentów RNA, w zestawie wykorzystano metodę dołączenia uniwersalnego 

adaptera na 3’ końcu każdej cząsteczki miRNA, po uprzednim dobudowaniu ogona poli(A), 

przez działanie PAP. Do reakcji używano 1000ng całkowitego RNA, zawierającego również pulę 

krótkich RNA. Dzięki dobudowanemu adapterowi na końcu każdej z krótkich cząsteczek RNA, 

możliwa była analiza wielu różnych miRNA, z tej samej puli matrycy (Ryc. 10). 

 

Rycina 10 Schemat procedury odwrotnej transkrypcji otrzymania cDNA z krótkich RNA jako matrycy 

 



50 
 

 

 

 

3.4. Analiza danych z portalu GTEx 

Dane RNA-Seq użyte do analizy poziomów ekspresji genu VMP1 i jego transkryptów w 

tkankach ludzkich zostały pobrane z portalu The Genotype-Tissue Expression (GTEx) Project 

(wersja bazy danych phs000424.v8.p2 z 01.06.2020) (The Genotype-Tissue Expression (GTEx) 

Project was supported by the Common Fund of the Office of the Director of the National 

Institutes of Health, and by NCI, NHGRI, NHLBI, NIDA, NIMH, and NINDS.). Dane RNA-Seq 

zostały pobrane w formie znormalizowanej w postaci transkryptów na milion (TPM, ang. 

Transcript per Milion). 

TPM oblicza się w następujący sposób: 

1. Surowe wartości odczytów zostają podzielone przed długość transkryptu (wyrażoną 

w tysiącach par zasad (kpz)). Otrzymujemy odczyty na tysiąc par zasad (RPK, ang. Reads 

per Kilobase). 

2. Wartości RPK w jednej próbce zostają zsumowane i podzielone przez 1,000,000. 

Otrzymujemy czynnik skalujący „na milion”. 

3. Wartości RPK zostają podzielone przez czynnik skalujący „na milion”. Otrzymujemy 

TPM 

4. Poziom ekspresji genu otrzymuje się przez dodanie wszystkich wartości TPM 

transkryptów pochodzących z jednego genu 

3.5. Analizy RT-PCR oraz RT-qPCR 

Wszystkie RT-PCR były przeprowadzane z użyciem GoTaq Flexi DNA Polymerase 

według zalecanej procedury (Promega; M3001). Produkty PCR rozdzielane były na żelu 

agarozowym (1-1,5%) z bromkiem etydyny (Sigma; E1510). Do wizualizacji korzystano z 

systemu G:BOX (Syngene), a do analizy poziomu intensywności sygnału używano 

oprogramowania GeneTools (Syngene). 

 W przypadku analiz RT-qPCR, do reakcji używano Maxima SYBR Green/ROX qPCR 

Master Mix (ThermoFisher; K0223). Reakcje oraz analizy były przeprowadzane w aparacie 

QuantStudio™ 7 Flex Real-Time PCR System (ThermoFisher; 4485701). 



51 
 

 

 

Rycina 11 Schemat prezentujący lokalizacje starterów do badania poziomu zmian VMP1/pri-miR-21. 

3.5.1. Lista starterów 

Nazwa Symbol Sekwencja 5’-> 3’ 

Analizy zmian VMP1/pri-miR-21 (Ryc. 11) 

mRNA_VMP1_F F1 TTTCCCGAACCACCCTATCC 

mRNA_VMP1_R R1 CAGACTCTGCATGTTCCAGC 

VMP1_PASproks._F F2 TGAAACTGGGCTGCTGCATA 

VMP1_PASproks._R1 R2 ACACTTACAGAACGGCAAGA 

VMP1_PASproks._R2 R3 GCAGACAGTCAGGCAGGATT 

pri-miR-21_F F3 GGGTTCGATCTTAACAGGCC 

pri-miR-21_R R4 AATGTCAGACAGCCCATCGA 

VMP1/pri-miR-21_intron_F F4 CTCGAGGGAAGCACAGGTTT 

VMP1/pri-miR-21_intron_R R5 CGTGCCTGGAATCACAGCTA 

lncVMP1/pri-miR-21_F F5 TATCCAATCCCTGCCTTTTG 

lncVMP1/pri-miR-21_R R6 AATGGCTTCTGCAGAGATGG 

pri-miR-21_ret#1_intron_F F5 TATCCAATCCCTGCCTTTTG 

pri-miR-21_ret#1_intron_R R7 TTAAGGCAGAACCCATCCAC 

pri-miR-21_ret#2_intron_F F5 TATCCAATCCCTGCCTTTTG 

pri-miR-21_ret#2_intron_R R8 AAGGTGGTACAGCCATGGAG 

Analizy poziomu ekspresji genów regulowanych przez miR-21 

TGFBR2_F TGFBR2_F CAAAGGTCCCATTTGCAGTT 

TGFBR2_F TGFBR2_F GAGACCTTCCACCATCCAAA 

PTEN_F PTEN_F ACCAGGACCAGAGGAAACCT 



52 
 

PTEN_R PTEN_R GCTAGCCTCTGGATTTGACG 

BTG2_F BTG2_F AGTCTCCAGCTAGGCCCTTC 

BTG2_R BTG2_R CACGCAACAGTTCTCTCCAA 

ICAM1_F ICAM1_F AGTCCAGTACACGGTGAGGA 

ICAM1_R ICAM1_R TGTGACCAGCCCAAGTTGTT 

NFIB_F NFIB_F CACCAAGCAGCAAAAGACCC 

NFIB_R NFIB_R CAGGTATTCCGGGATGGTGG 

Poziom pri-miRNA 

pri-miR-23b_F pri-miR-23b_F GAAGCCCAGTGTGTGCAGA 

pri-miR-23b_R pri-miR-23b_R GACCACGGTTTCTGGAGGAG 

pri-miR-27b_F pri-miR-27b_F CTGAGGAAGATGCTCACCGG 

pri-miR-27b_R pri-miR-27b_R CCAGCGGCTCCAACTTAACT 

pri-miR-24-1_F pri-miR-24-1_F CTGAGGCGCTGCTTCTCC 

pri-miR-24-1_R pri-miR-24-1_R CCTCGGGCACTTACAGACAC 

pri-miR-30d_F pri-miR-30d_F TGTCTGTGAATAGCCGGTAGC 

pri-miR-30d_R pri-miR-30d_R AGCTGAAGATGATGACTGGCA 

Badanie poziomu miRNA 

miR-21-5p miR-21-5p TAGCTTATCAGACTGA 

miR-21-5p_mut miR-21-5p_mut TAGCTTATCGGACTGC 

miR-16 miR-16 GGATGACACGCAAATTCGTG 

miR-378a-3p miR-378a-3p ACTGGACTTGGAGTCAGAAG 

miR-23b-3p miR-23b-3p ATCACATTGCCAGGGATTACCAC 

miR-27b miR-27b TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC 

U6 U6 GGATGACACGCAAATTCGTG 

Uniwersalny starter_R Universal_R GCATAGACCTGAATGGCG