Pokonywanie barier w krzyżowaniu międzyrodzajowym Salix x Populus metodą zapylania in vitro oraz in vivo - Zarychta, Łukasz (My University, 2013)
Wzrost znaczenia gospodarczego gatunków znajdujących zastosowanie jako odnawialne surowce energetyczne przyczynił się do intensyfikacji programów hodowlanych m.in. w obrębie rodzaj Salix i Populus. Programy te, ukierunkowane na technologię uprawy wielkotowarowej, zwiększenie produkcji biomasy, poprawę parametrów jakościowych uzyskiwanej biomasy oraz zwiększenie odporności na choroby są systematycznie udoskonalane. Badania nad mieszańcami międzygatunkowymi Salix viminalis L. z kilkoma gatunkami wierzb prowadzone od wielu lat w Europie (Skandynawia, Niemcy) oraz w Polsce (w Zakładach Doświadczalnych Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego) wykazały, że uzyskane już mieszańce posiadają w/w korzystne cechy i są już wykorzystywane w agroenergetyce. W niniejszej pracy podjęto próby uzyskania mieszańców międzyrodzajowych, krzyżując sześć diploidalnych i tetraploidalnych gatunków wierzby (Salix caprea L. – wierzba iwa, Salix cinerea L. – wierzba szara, Salix fragilis L. – wierzba krucha, Salix purpurea L. – wierzba purpurowa, Salix purpurea x S. rubra Huds., Salix pentandra L. – wierzba pięciopręcikowa) z sześcioma gatunkami diploidalnymi topoli (Populus alba L. – topola biała, Populus tremula L. – topola osika, Populus simonii Carr. – topola chińska, Populus xcanescens (Ait.) Smith – topola szara, Populus trichocarpa Torr. et A.Gray ex Hook – topola kalifornijska, Populus tomentosa Carr. – topola biała chińska). Główną przeszkodę uniemożliwiającą powstanie mieszańców międzyrodzajowych Salix x Populus stanowiły prezygotyczne oraz postzygotyczne bariery niekrzyżowalności, które blokują zapłodnienie i rozwój zarodków mieszańcowych. Dlatego w pracy podjęto badania podstawowe dotyczące fenologii i biologii kwitnienia, analizując: procesy kwitnienia osobników żeńskich wierzby i osobników męskich topoli, rozwój kwiatostanów żeńskich wierzby, receptywność znamion wierzby oraz żywotność pyłku topoli. W celu wyeliminowania barier prezygotycznych zastosowano zmodyfikowane metody zapylania, takie jak: nanoszenie pyłku na rozgniecione znamiona, nanoszenie pyłku na słupki pozbawione znamion oraz traktowanie znamion rozpuszczalnikami organicznymi. W celu pokonania barier postzygotycznych zastosowano metodę ratowania zarodków, w której optymalizowano czas potrzebny zarodkom na osiągnięcie wielkości umożliwiającej przeżycie poza zalążkiem. Ponadto, dokonano wyboru pożywek, najefektywniej warunkujących rozwój zarodków mieszańcowych (1. indukujących kiełkowanie zarodków: 1/2 WPM, sacharoza 20 g/l-1, gerlite 2 g/l-1, pH = 5,7 – 5,8 oraz 2. ukorzeniających: 1/2 WPM, NAA 1 mg/l-1, sacharoza 20g/l-1, gerlite 2 g/l-1, pH = 5,7 – 5,8). Na pożywce indukującej, kiełkowało około 70% zarodków, a na pożywce ukorzeniającej około 85% siewek wytwarzało system korzeniowy. W wyniku zapylania uzyskano zarodki mieszańcowe w 30 wariantach krzyżowania, z czego zarodki dojrzałe, po 18 – 20 dniach, uzyskano tylko w kombinacjach Salix cinerea x Populus tremula oraz Salix fragilis x Populus simonii. Z tej ostatniej krzyżówki uzyskano także rośliny mieszańcowe. Ocenę mieszańcowości osobników potomnych Salix fragilis x Populus simonii oparto o wyniki cytometrii przepływowej, analizy markerów izoenzymatycznych oraz mikrosatelitarnych. Każda z tych metod umożliwiła wskazanie wśród potomstwa osobników mieszańcowych, haploidalnych oraz osobników, u których wykluczono pochodzenie mieszańcowe. Jako marker mieszańcowości w analizie izoenzymatycznej wytypowano izomerazę fosfoglukonianową PGI (E.C: 5.3.1.9) natomiast w analizie markerów mikrosatelitarnych – cztery pary markerów: trzy pary markerów heterozygotycznych oraz jedną parę homozygotyczną.

The studies related to the implementation of the PhD thesis entitled “Overcoming of barriers in intergeneric crosses of Salix and Populus, using in vitro and in vivo pollination methods” started in October 2007. The work is realised within the ‘Utilisation of intergeneric hybrids obtained through hybridization of willow and poplar for enhancement of biomass productivity and water stress project in the Department of General Botany, Adam Mickiewicz University in Poznan, supervised of Prof. Dr Elżbieta Zenkteler. In the first stage of work, seven species of willow and six poplar species were selected for further experiments. Only the species with beneficial features, predisposing them for use in the energy industry, and which were also found interesting for cognitive reasons were selected. The female component of the crossing accounted for willows were represented by diploid and tetraploid species of native origin (Salix caprea L. 2n=38, Salix purpurea L. 2n=38, Salix purpurea xrubra Huds. 2n=38, Salix cinerea L. 4n=76, Salix fragilis L. 4n=76, Salix pentandra L. 4n=76). Poplars, which were the component of male crossing, were represented by diploid species of native and foreign origin (Populus tremula L. 2n=38, Populus xcanescens (Ait.) Smith 2n=38, Populus alba L. 2n=38, Populus simonii Carr. 2n=38, Populus tomentosa Carr. 2n=38, Populus trichocarpa Torr.&A.Gray ex Hook 2n=38). Several fundamental studies related to elucidating the knowledge on basic biology and phenology in situ flowering of the selected dioecious species of willows and poplars were carried out in the scope of this work, which also covers the assessment of willow stigma receptiveness, the pollen viability for poplar as well as the time and conditions for its ex situ storage. The germination of poplar pollen grains on the stigmas of willow and the pollen tube penetration of willow ovules was analysed. The occurring pre-zygotic and post-zygotic barriers have been determined and methods of their elimination (in vitro pollination and embryo rescue method) were investigated. The protocol for the embryo rescue method was developed for hybrid Salix x Populus embryos. Different techniques of in vitro pollination were tested: pollen deposition in the ovaries devoid of stigmas, pollen deposition on crushed stigmas and treatment of signs with organic solvents. Several methods potential hybrids identification were applied: flow cytometry, izoenzymatic markes, RAPD markers and SSR microsatellite markers, which have allowed to select hybrids from the plants obtained. The currently performed studies are focused on obtaining a larger number of hybrid plants and the selection of plants which exhibit specific characteristics that predispose them for use in the energy industry.
Overcoming of barriers in intergeneric crosses of Salix and Populus, using in vitro and in vivo pollination methods
Wydział Biologii
Keywords: wierzby; willow; In vitro; metoda ratowania zarodków; embryo rescue; bariery niekrzyżowalności; incompatibility barriers; mieszańce międzyrodzajowe; interspecific hybrids