Celewicz, Lech. PromotorBaraniak, Dagmara Sara2012-03-262012-03-262012-03-26http://hdl.handle.net/10593/2334Wydział Chemii: Pracownia Chemii Nukleozydów i NukleotydówNucleoside analogues have found successful application as antiviral and anticancer agents. Among them an important place occupy 2’,3’-dideoxynucleosides (ddNs), i.e. 3’-azido-3’-deoxythymidine (AZT). Notably, AZT has been originally developed as a potential antitumor drug, but later it has found a widespread use as an antiretroviral drug (anti-HIV), and recently it is used as an anticancer agent, especially in combination with cisplatin, methotrexate and 5-fluorouracil. In general, the mechanism of antiviral or cytostatic action of ddNs involves their intracellular conversion to an active form of the drug – the 5’-triphosphates, which are inhibitors of the relevant enzymes in the replication process (HIV reverse transcriptase or DNA polymerase). They act as competitive inhibitors or chain terminator of the nascent DNA strand due to lack of 3’-hydroxyl group of the relevant enzymes. In recent years, a number of attempts were undertaken to design prodrugs like ddNs that do not require the first step of phopshorylation. The subject of presented studies was the synthesis, cytotoxic activity and fluorescent properties of conjugates of nucleosides with Cinchona alkaloids obtained using the methods of click chemistry. At the first stage of the study the synthesis of the following azido-nucleosides was carried out: 3’-azido-3’-deoxythymidine, 5’-azido-5’-deoxythymidine (5’-AZT), 2-azidoadenosine (2-N3-A) and 2-azido-N6-methyladenosine (2-N3-N6-Me-A). Next the modified Cinchona alkaloids, i.e. 10,11-didehydro- and 9-O-propargyl derivatives of alkaloids were obtained, which were containing a terminal triple bond in their structure. The main aim of the study was to develop a general method of synthesis of nucleoside – alkaloid conjugates. For this aim, the Cu(I) catalyzed Huisgen reaction was used (CuAAC), employing as the azide component a azido-nucleoside analogue and as the alkyne component – a modified Cinchona alkaloid. The synthesized compounds were evaluated for cytotoxic activity in KB and MCF-7 cancer cells. For each conjugate was determined IC50 parameter (inhibitory concentration; concentration of compound causing 50% inhibition of tumor cell growth). The high cytotoxic activity against tumor cells showed following conjugates: 3’-azido-3’-deoxythymidine with 10,11-didehydroquinine (IC50 = 1,30 μg/mL), 5’-azido-5’-deoxythymidine with 9-O-propargylqunidine (IC50 = 1,70 μg/mL), 2-azido-N6-methyladenosine with 10,11-didehydroquinine (IC50 = 1,70 μg/mL), 5’-azido-5’-deoxythymidine with 10,11-didehydroqunidine (IC50 = 1,75 μg/mL). Because Cinchona alkaloids display significant fluorescence emission, it was also measured fluorescence emission (in acetonitrile and buffer acetate at pH = 4) for obtained nucleoside–alkaloid conjugates and the fluorescence quantum yield was calculated. The results showed that the position of the maximum emission bands depends on the solvents used and the structure of the compound, but mostly it was observed at about λ = 360 nm in acetonitrile. The acetate buffer was used to check, if the conjugates could be excite in a further range of the spectrum. It was found that emission of these conjugates recorded in acetate buffer are shifted to longer wavelength (400÷450 nm), it means that these compounds can be excited using longer wavelength. The research was also aimed to obtain conjugates of 5’-phosphoramidates of AZT with 10,11-didehydroquinine (DDQn). It is worth noting that nucleoside 5’-phosphoramidates more easily penetrate the phospholipid cell membrane, and after entering the cell are hydrolyzed to 5’-phosphates, bypassing first phosphorylation step. Hence the idea of synthesis of potential prodrugs with masked phosphate group, which include discussed conjugates. Based on this idea, the inverse concept was planned – the synthesis of phosphorylated alkaloid components, namely 9-O-phosphoramidates of DDQn, which underwent coupling with AZT and gave desired hybrids. In addition, the method of synthesis of 9-O-phosphoramidates of DDQn that was described, it has not been previously presented in the scientific literature and the obtained compounds are a new class of 10,11-didehydroquinine derivatives. The thesis presents the studies on the synthesis of conjugates of azidonucleosides with Cinchona alkaloids, using the copper(I) catalyzed 1,3-dipolar Huisgen cycloaddition reaction in accordance with a novel concept introduced by Sharpless and called click chemistry. Almost all tested conjugates, synthesized in this work, showed high or moderate cytotoxic activity. Moreover, because of the free hydroxyl group at the 3’- or 5’-position the obtained conjugates can be incorporated into synthesized DNA (RNA) respectively at the 5’ or 3’-end. What is more the aromatic quinoline ring of nucleoside  alkaloid conjugates, because of its planar structure, can be inserted between the base pairs of the double helix of DNA (intercalation). It was determined that the synthesized conjugates show strong fluorescence emission therefore can be used as fluorescent probes for oligonucleotides or fragments of DNA. In conclusion, a general method for the synthesis of nucleoside – Cinchona alkaloid conjugates has been developed. What is more the antitumor studies have shown, that it is reasonable to search for determinants of biological activity within the nucleoside conjugates formed with other potentially active compounds such as Cinchona alkaloids. Based on our observation, it can be concluded, that the CuAAC reaction gives the possibility of broad application in the synthesis of conjugates between azidonucleosides and modified Cinchona alkaloids containing terminal triple bond.Analogi nukleozydów znajdują szerokie zastosowanie w leczeniu chorób wirusowych i nowotworowych. Wśród nich główne miejsce zajmują 2’,3’-dideoksynukleozydy (ddN), których ważnym przedstawicielem jest 3’-azydo-3’-deoksytymidyna (AZT). AZT, chociaż w oryginalnym zamierzeniu zsyntetyzowany został jako potencjalny środek przeciwnowotworowy, znalazł szerokie zastosowanie jako lek przeciwwirusowy (anty-HIV), a ostatnio znajduje coraz szersze zastosowanie ponownie jako lek przeciwnowotworowy, szczególnie w kombinacji z cisplatyną, metotreksatem i 5-fluorouracylem. Mechanizm działania ddN jako leków antywirusowych lub cytostatycznych wiąże się z ich przekształceniem wewnątrz komórki w aktywne biologicznie 5’-trifosforany, które działają jako inhibitory kompetycyjne odpowiednich enzymów w procesie replikacji (odwrotnej transkryptazy wirusa HIV lub polimerazy DNA), a w przypadku włączenia do rosnącego łańcucha DNA terminują jego syntezę z powodu braku grupy hydroksylowej w pozycji 3’. W ostatnich latach podejmowane są liczne próby zaprojektowania proleków ddN nie wymagających pierwszej fosforylacji. Przedmiotem badań prezentowanej rozprawy doktorskiej była synteza, zbadanie aktywności cytotoksycznej oraz właściwości fluorescencyjnych nowej klasy połączeń – koniugatów nukleozydów z alkaloidami kory chinowej z zastosowaniem metod chemii ”click”. W pierwszym etapie pracy przeprowadzono syntezę azydo-nuklezydów: 3’-azydo-3’-deoksytymidyny (AZT), 5’-azydo-5’-deoksytymidyny (5’-AZT), 2-azydoadenozyny (2-N3-A) oraz 2-azydo-N6-metyloadenozyny (2-N3-N6-Me-A). Następnie otrzymano modyfikowane alkaloidy kory chinowej zawierające w swojej strukturze terminalne wiązanie potrójne: 10,11-didehydro- oraz 9-O-propargilo-alkaloidy. Głównym założeniem prezentowanej pracy było opracowanie ogólnej metody syntezy adduktów nukleozydowo–alkaloidowych. W tym celu wykorzystano reakcję Huisgena katalizowaną jonami miedzi(I) (w skrócie: CuAAC), w której komponent azydowy stanowił analog nukleozydu, natomiast komponent alkinowy – modyfikowany alkaloid kory chinowej. Celem prowadzonych badań było również określenie aktywności cytotoksycznej otrzymanych związków metodą hodowli tkankowych komórek nowotworowych linii KB lub MCF-7. Dla każdego koniugatu wyznaczono parametr aktywności IC50 (stężenie inhibitorowe, ang. inhibitory concentration, czyli takie stężenie substancji testowanej, które hamuje w 50% patologiczne zmiany komórek nowotworowych) – im niższe jest IC50 tym aktywność związku wyższa. W ramach otrzymanych serii pochodnych wysoką aktywność cytotoksyczną wobec komórek nowotworowych wykazują koniugaty: 3’-azydo-3’-deoksytymidyny z 10,11-didehydrochininą (IC50 = 1,30 μg/mL), 5’-azydo-5’-deoksytymidyny z 9-O-propargilochinidyną (IC50 = 1,70 μg/mL), 2-azydo-N6-metyloadenozyny z 10,11-didehydrochininą (IC50 = 1,70 μg/mL) oraz 5’-azydo-5’-deoksytymidyny z 10,11-didehydrochinidyną (IC50 = 1,75 μg/mL). Ponieważ alkaloidy chinowca wykazują silne właściwości fluorescencyjne, zbadano ich właściwości fluorescencyjne w acetonitrylu i buforze octanowym o pH = 4 oraz obliczono wydajności kwantowe fluorescencji. Uzyskane wyniki pokazały, że maksimum emisji zależy od użytego rozpuszczalnika oraz struktury związku, jednak najczęściej obserwowane było przy 360 nm i wzbudzeniu 320 nm (w acetonitrylu). Omawiane silne pasmo emisji pochodzi od fluoroforu – 6-metoksychinoliny obecnej w alkaloidach kory chinowej. Zastosowanie buforu octanowego z użyciem octanu (0,01 mol/L CH3COOH/CH3COONa, pH = 4) miało na celu zbadanie, czy omawiane koniugaty mogą służyć do budowy sond fluorescencyjnych. Eksperyment potwierdził, iż emisja omawianych koniugatów zarejestrowana w buforze octanowym jest bardziej długofalowa (400÷450 nm), co ma istotne znaczenie, gdyż związki te mogą być wzbudzane w dalszym zakresie. Dla niektórych koniugatów zaobserwowano zmniejszenie intensywności emisji fluorescencji, prawdopodobnie jest to spowodowane przestrzennym ułożeniem części alkaloidowej, która oddziałuje z pierścieniem zasady azotowej nukleozydu. Wzbudzona reszta barwnika, zamiast fluoryzować, przekazuje energię nukleozydowi przez co dochodzi do innej drogi dezaktywacji stanu wzbudzonego i wygaszania fluorescencji. Przeprowadzano także syntezy połączeń 5’-amidofosforanów AZT z 10,11-didehydrochininą (DDQn). Nukleozydy o strukturze 5’-amidofosforanów mogą łatwiej przenikać przez fosfolipidową membranę komórkową, a po wniknięciu do wnętrza komórki ulegają hydrolizie do 5’-fosforanów, przez co nie muszą ulegać procesowi pierwszej fosforylacji. Stąd idea syntezy potencjalnych proleków z maskowaną grupą fosforanową, do których zaliczamy omawiane koniugaty. W oparciu o ten pomysł zaplanowano syntezę fosforylowanych komponentów alkaloidowych, a dokładnie 9-O-(amido)fosforanów 10,11-didehydrochininy, które w wyniku reakcji sprzęgania z AZT dały nowe koniugaty. Dodatkowo, komponent alkaloidowy w postaci 9-O-(amido)fosforanu DDQn stanowi nową klasę związków wcześniej nie występującą w literaturze. W pracy przedstawiono wyniki badań nad syntezą kluczowych koniugatów – analogów nukleozydów z modyfikowanymi alkaloidami kory chinowej, które otrzymano na drodze 1,3-dipolarnej cyklooaddycji Huisgena katalizowanej jonami Cu(I) w oparciu o koncepcję click chemistry opracowaną przez Sharpless’a. Prawie wszystkie przebadane koniugaty, zsyntetyzowane w ramach niniejszej pracy, wykazywały wysoką lub umiarkowaną aktywność cytotoksyczną, a zatem stanowią one cenny materiał badawczy do rozwiniętych badań cytostatycznych (in vitro oraz in vivo). Ponadto, otrzymane koniugaty z uwagi na wolną grupę hydroksylową w pozycji 3’ lub 5’ mogą zostać włączone do nowo syntetyzowanego łańcucha DNA (RNA) odpowiednio na końcu 5’ lub 3’. Natomiast aromatyczny pierścień chinolinowy, dzięki swej płaskiej strukturze, umożliwia im wiązanie z DNA poprzez wsunięcie się pomiędzy pary zasad podwójnej helisy, czyli tzw. interkalację. Taka indukowana zmiana konformacyjna lub uszkodzenie DNA są wykorzystywane w nowoczesnych sposobach walki m.in. z nowotworami. Potwierdzono, iż silne właściwości fluorescencyjne, dzięki fluoroforowi chininowemu, stały się cechą charakterystyczną otrzymanych koniugatów i mogą być wykorzystywane do budowy oligo(deoksy)nukleotydowych sond fluorescencyjnych (markerów fluorescencyjnych).plnukleozydynucleosidesAZT3’-azydo-3’-deoksytymidynaalkaloidy kory chinowejcinchona alkaloidschemia clickclick chemistrykoniugatyconjugationDysertacja