Charakterystyka mechanizmu degradacji kinazy kaskady MAP - MAPKKK18 zależnej od proteasomu - Tajdel-Zielińska, Małgorzata (My University, 2022)
Kinazy MAP uczestniczą w szlakach sygnalizacyjnych w postaci kaskady tworzonej przez kolejno aktywowane w wyniku fosforylacji kinazy MAPKKK, MAPKK i MPK. Kaskady kinaz MAP przekształcają bodźce zewnątrzkomórkowe w odpowiedzi wewnątrzkomórkowe, przez co odgrywają kluczową rolę w sprawnym przystosowaniu się do stresów środowiskowych, zarówno o podłożu biotycznym jak i abiotycznym. Jednym z głównych fitohormonów roślinnych związanych z koordynacją odpowiedzi na stresy środowiskowe jest kwas abscysynowy (ABA). Najważniejszymi efektorami sygnalizacji ABA są fosfatazy i kinazy białkowe. Jednak, mimo intensywnych badań niewiele wiadomo na temat roli kinaz MAP, zwłaszcza MAPKKK, w szlaku sygnałowym ABA. Obiektem badań przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy jest kinaza aktywowana przez ABA inicjująca kaskadę kinaz MAP, tj. MAPKKK18. Aby scharakteryzować kaskadę kinaz MAP rozpoczynającą się od kinazy MAPKKK18 podjęto próbę zidentyfikowania kinazy MKK działającej poniżej MAPKKK18. Przeprowadzone analizy wykazały, że jedynym partnerem kinazy MAPKKK18 w kaskadach kinaz MAP jest kinaza MKK3. Aby opisać funkcję biologiczną tego oddziaływania, badano wpływ modułu MAPKKK18-MKK3 na proces rozwoju aparatów szparkowych. Uzyskane wyniki wskazują, że MKK3 działa poniżej MAPKKK18 w rozwoju aparatów szparkowych zarówno na wczesnych, jak i na późniejszych etapach. Oznacza to, że kaskada MAPKKK18-MKK3 może funkcjonować jako efektor sygnalizacji ABA w procesie rozwoju aparatów szparkowych. W kolejnych etapach prac skupiono się na mechanizmach zaangażowanych w regulację aktywności MAPKKK18. Analizowano rolę białek kompleksu podstawowej sygnalizacji ABA w regulacji aktywności MAPKKK18. Z wykorzystaniem drożdżowego systemu dwuhybrydowego, a także techniki pull-down zidentyfikowano oddziaływania między MAPKKK18 i ABI1, a także między MAPKKK18 i SNRK2.6. Tym samym, kompleksy MAPKKK18/ABI1/SnRK2.6 mogą stanowić ważny element skomplikowanego systemu regulacji aktywności MAPKKK18. Ponadto powyższe rezultaty podkreślają istotne znaczenie MAPKKK18 w transdukcji sygnału ABA. Ponieważ integralną częścią transdukcji sygnałów z udziałem efektorów ABA jest degradacja białek przez proteasom 26 S, w niniejszej pracy skupiono się na dwóch niezwykle istotnych molekularnych aspektach degradacji MAPKKK18. Pierwszy dotyczył identyfikacji reszt lizynowych będących miejscem poliubikwitynacji MAPKKK18, a drugi - poznania ligazy ubikwityny E3 specyficznie modyfikującej MAPKKK18. Zidentyfikowano trzy ligazy ubikwityny E3, mogące kierować MAPKKK18 do degradacji, tj. KEG, UPL1 oraz UPL4. Przeprowadzone badania wskazują także, że sygnałem do degradacji MAPKKK18 przez proteasom 26 S jest przyłączenie cząsteczki ubikwityny do lizyny 154 w sekwencji MAPKKK18. Wyniki uzyskane w ramach niniejszej pracy rzucają światło na mechanizmy leżące u podstaw przekazywania zewnątrzkomórkowych sygnałów z udziałem efektorów ABA.

Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway includes a three-kinase cascade, composed of MAPKKK, MAPKK, and MAPK, that are sequentially activated by phosphorylation. MAP kinase cascades convert extracellular stimuli into various intracellular responses, thus play an essential role in the efficient adaptation to both biotic and abiotic stresses. Abscisic acid (ABA) is one of the main plants phytohormones involved in the coordination of responses to environmental stresses. Key players of the ABA-signaling pathway are protein phosphatases and protein kinases. Despite intensive studies, little is known about the role of MAP kinases, especially MAPKKK kinase, in the ABA signaling pathway. This project represents line of research focused on an ABA-activated MAPKKK kinase, MAPKKK18. In this study, to characterize the MAPKKK18 kinase cascade, an attempt was made to identify MKK acting MAPKKK18 downstream. In vitro and in vivo analyses revealed that the only MKK target for MAPKKK18 is MKK3. To establish the biological function of this interaction, the influence of the MAPKKK18-MKK3 module on the development of the stomata was verified. Using Stomatal Index analysis, it was found that MKK3 acts downstream of MAPKKK18 in the early and late stages of stomata development. Hence these results suggest that MAPKKK18-MKK3 cascade functions as an ABA signaling effector in the process of guard cell development. The next phase of this work was focused on resolving the mechanisms involved in the regulation of MAPKKK18 activity. The role of the core components of the ABA signaling pathway in the regulation of the MAPKKK18 activity was analysed. Yeast two-hybrid analysis and pull-down assays allow detection of direct interaction between MAPKKK18 and both ABI1 phosphatase and SnRK2.6 kinase. Thus MAPKKK18/ABI1/SnRK2.6 complexes may play an essential role in the regulation of MAPKKK18 activity. Moreover, these findings highlight the importance of MAPKKK18 in the ABA signaling pathway. Since protein degradation by 26 S proteasome is an integral part of the ABA signal transduction pathway, this work focuses on two remarkably important aspects of the proteasomal degradation mechanism of MAPKKK18 The first aspect concerned the identification of MAPKKK18 ubiquitination sites, and the second one - the identification of the individual E3 ubiquitin ligase tagging MAPKKK18 for degradation. Analyses presented in this dissertation demonstrate that the turnover of MAPKKK18 is controlled by three specific E3 ubiquitin ligases, belonging to HECT and RING families, respectively. In addition to that, we found that ubiquitination of MAPKKK18 implies lysine 154. Preventing ubiquitination at this residue by mutation (K154R) leads to the stabilization of the MAPKKK18 protein. The results obtained in this study shed light on the mechanisms underlying extracellular signaling through ABA effectors.
Characterization of the proteasome-mediated degradation mechanism of MAPKKK18
Wydział Biologii
Keywords: MAPKKK18; kaskady kinaz MAP; ABA; degradacja białek przez proteasom 26S; ubikwitynacja; MAP kinase cascades; 26S proteasome-mediated protein degradation; ubiquitination