Fałdowanie i agregacja ludzkiego białka prionowego: biofizyczne badania oddziaływań z jonami metali oraz konstruktem peptydowym NCAM1-Aβ - Gielnik, Maciej (My University, 2022)
Proces nieprawidłowego fałdowania komórkowej formy białka prionowego (PrPC), jest związany z rozwojem śmiertelnych chorób neurodegeneracyjnych znanych jako pasażowalne encefalopatie gąbczaste, do których należy choroba Creutzfeldta-Jakoba występująca u ludzi lub choroba „szalonych krów” występująca u bydła. Proces ten nie jest zjawiskiem wyjątkowym: w odpowiednich warunkach wszystkie białka mogą ulec zmianie strukturalnej z dobrze rozpuszczalnego stanu natywnego do nierozpuszczalnego i włóknistego stanu amyloidowego. Takie błędne fałdowanie białek połączone z ich agregacją związane jest również z kilkoma innymi chorobami neurodegeneracyjnymi. Ludzkie białko PrPC jest zbudowane z 208 aminokwasów i składa się z dwóch strukturalnie różnych domen: nieustrukturyzowanej domeny N-terminalnej (DNT) oraz ustrukturyzowanej, głównie α-helikalnej, domeny C-terminalnej (DCT). DNT posiada ośmioaminokwasową powtarzającą się sekwencję (ang. octarepeat, OR), która poprzez reszty histydynowe wiąże jony metali Cu(II) i Zn(II). Wiele kofaktorów, włączając w to jony metali, wpływa na błędne fałdowanie białka PrPC. W niniejszej pracy zastosowałem różnorodne, komplementarne metody biofizyczne do zbadania strukturalnych skutków wiązania jonów Cu(II) i Zn(II) przez ludzkie białko PrPC oraz przez peptyd zawierający sekwencję OR. Wyniki spektroskopii dichroizmu kołowego (ang. circular dichroism, CD) sugerują, że peptyd OR wiąże cztery jony Cu(II) oraz dwa jony Zn(II). Bliskie stechiometrycznym stężenia jonów obu metali wywołują zmianę helisy poliprolinowej typu II w zwrot β, natomiast stechiometryczne stężenia obu jonów metali wywołują powstanie antyrównoległych arkuszy β. Symulacje dynamiki molekularnej peptydu OR związanego z jonami metalu wskazują formowanie struktur spinek do włosów posiadających antyrównoległe arkusze β. Bezpośrednie dodanie jonów Zn(II) do peptydu OR skutkuje wiązaniem barwników, charakterystycznych dla włókien amyloidowych takich jak tioflawina T oraz czerwień Kongo. Po inkubacji peptydu OR z jonami Zn(II) obrazowanie z zastosowaniem mikroskopii sił atomowych oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujawniło obecność włóknistych struktur. Charakterystyczny obraz dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego wykazał obecność poprzecznych arkuszy β, typowych dla włókien amyloidowych. W związku z powyższym wiązanie jonów Cu(II) i Zn(II) przez peptyd OR może prowadzić do powstania struktur amyloidowych. W przypadku ludzkiego białka PrPC wiązanie jonów Zn(II) przez region OR skutkuje oddziaływaniem pomiędzy DNT i DCT. Spektroskopia CD wskazuje na utratę struktury α-helikalnej na skutek wiązania jonów Zn(II), prawdopodobnie w obrębie helisy drugiej i trzeciej, zlokalizowanych w DCT, oraz powstanie zwrotów β, prawdopodobnie dokoła związanego jonu Zn(II). Wyniki miareczkowania z zastosowaniem spektroskopii fluorescencji oraz CD sugerują, że pozorna stała dysocjacji dla kompleksu PrPC·Zn(II) mieści się w granicy niskich stężeń mikromolowych, przez co można wnioskować, że takie oddziaływanie jest możliwe w warunkach fizjologicznych. Symulacje dynamiki molekularnej dla kompleksu PrPC·Zn(II) wskazują stabilizację trzeciej α-helisy, podczas gdy wyniki małokątowego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego sugerują bardziej kompaktowe zwinięcie białka PrPC związanego z cynkiem. Jako że wiązanie cynku do białka PrPC faworyzuje oddziaływanie międzydomenowe i stabilizuje trzecią α-helisę, cynk może hamować proces agregacji lub tworzenia włókien amyloidowych przez białko PrPC. Ponadto zbadano wpływ zaprojektowanego peptydu NCAM1-Aβ na agregację i tworzenie włókien amyloidowych przez ludzkie białko PrPC. Białko PrPC i peptyd NCAM1-Aβ same tworzą struktury amyloidowe, jednak ich wspólna inkubacja przez trzy dni skutkowała powstaniem wyłącznie niewielkich agregatów. Uzyskane wyniki sugerują bezpośrednie oddziaływanie peptydu NCAM1-Aβ z ludzkim białkiem prionowym, prawdopodobnie poprzezo ddziaływania hydrofobowe, oraz inhibicję agregacji białka PrPC.

Misfolding of the cellular prion protein (PrPC) is associated with the development of fatal neurodegenerative diseases known as Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs), such as Creutzfeldt-Jakob disease in humans and the corresponding “mad cow” disease in cattle. The misfolding of PrPC is not unique process: under specific conditions all proteins can undergo structural transitions from a native soluble state into insoluble and fibrillar amyloid state. Such misfolding followed by aggregation of the proteins is connected with several different neurodegenerative diseases. The 208-residue long human PrPC protein consists of two structurally distinct domains: an intrinsically disordered N-terminal domain (NTD), and a structured, mainly α-helical, C-terminal domain (CTD). The NTD contains the so-called octarepeat (OR) region, which is known to bind Cu(II) and Zn(II) ions by histidine residues. Many cofactors, including metal ions, seem to play an important role in PrPC misfolding. Here, I have used multiple complementary biophysical methods to investigate the structural effects of Cu(II) and Zn(II) binding to the human full-length PrPC protein, and to the isolated OR peptide. Circular dichroism (CD) spectroscopy suggest that OR peptide binds up to four Cu(II) ions, and up to two Zn(II) ions. At sub-stoichiometric concentrations, both metal ions induce polyproline type II helix to β-turn transitions in the OR peptide secondary structure, whereas stoichiometric concentrations of the metal ions seem to induce formation of an antiparallel β-sheet secondary structure. Molecular dynamics (MD) simulations of the isolated OR peptide together with bound metal ions indicate formation of hairpin structures with antiparallel β-sheet properties. Direct addition of Zn(II) ions to the OR peptide results in binding of the amyloid-specific dyes such as Thioflavin T and Congo Red, indicating amyloid formation. After incubation of the OR peptide with Zn(II) ions, imaging with atomic force microscopy (AFM) and transmission electron microscopy (TEM) revealed the presence of fibrillar structures. X-ray diffraction (XRD) analysis identified the amyloid-specific cross-β structure. Hence, binding of Cu(II) and Zn(II) ions to the OR peptide may induce formation of fibrillar amyloid structures. For the full-length human PrPC protein, binding of Zn(II) to the OR region results in an intra-domain interaction between the NTD and CTD. CD spectroscopy suggest loss of α-helical secondary structure upon Zn(II) binding, possibly at helices 2 and 3 from the CTD, together with formation of β-turn secondary structures, probably around the Zn(II) ion. Fluorescence and CD spectroscopy titrations suggest a low micromolar apparent dissociation constant for the PrPC·Zn(II) complex, which makes such interactions possible under physiological conditions. MD simulations of the PrPC·Zn(II) complex indicate stabilization of α-helix 3, while small angle X-ray scattering (SAXS) data suggest an overall more compact conformation of the Zn(II)-bound PrPC protein. As Zn(II) binding to PrPC favorites intra-domain interactions and stabilization of α-helix 3, Zn(II) might have an inhibitory effect on PrPC aggregation or fibrillation. Furthermore, I have investigated a possible inhibitory effect of a bioengineered NCAM1-Amyloidβ (NCAM1-Aβ) peptide on PrPC aggregation and fibrillation. PrPC and NCAM1-Aβ peptide alone formed fibrillar structures. However when incubated together up to three days only small aggregate clumps were observed. The results suggest a direct interaction between the PrPC and NCAM1-Aβ molecules, resulting in inhibition of PrPC aggregation, probably involving hydrophobic forces.
Folding and aggregation of the human prion protein: biophysical studies of interactions with metal ions and the NCAM1-Aβ peptide construct
Wydział Fizyki
Keywords: biofizyka; biophysics; białko prionowe; prion protein; cynk; zinc; miedź; copper; nieprawidłowe fałdowanie białek; protein misfolding