Udział miRNA w regulacji alternatywnego splicingu u roślin - Kalak, Małgorzata Maria (My University, 2013)
W czasie splicingu alternatywnego z pre-mRNA pojedynczego genu może powstać wiele różnych wariantów mRNA. Powstające w wyniku expresji genu różne formy mRNA mogą kodować funkcjonalnie odmienne białka i wpływać na wielkość i kompleksowość proteomu. Eksperymenty wykonane w ramach pracy doktorskiej wskazują, że białka kompleksu CBC oddziałują z białkiem SERRATE. Ponadto, analiza RT-PCR ujawniła, że AtSE (podobnie do AtCBC) bierze udział w regulacji splicingu alternatywnego, głównie przez wpływ na wybór alternatywnego miejsca splicingowego typu 5’SS w pierwszym intronie. Białka AtSE i AtCBC współpracują ze sobą, gdyż wiele zmian profilu splicingu alternatywnego obserwowanych w mutancie se-1 jest wspólna ze zmianami w mutantach cbc. W kolejnym etapie badań oceniono wpływ uszkodzenia ścieżki dojrzewania miRNA na profil splicingu alternatywnego wybranych genów. W tym celu analizę RT-PCR rozszerzono o badanie splicingu alternatywnego w innych niż se-1 mutantach genów kodujących białka zaangażowane w biogenezę miRNA – hyl1-2 oraz dcl1-7. Zaobserwowano, że dla kilku genów zmiany w profilu splicingu alternatywnego są wspólne dla wszystkich analizowanych mutantów, co może wskazywać na istnienie nowego mechanizmu regulacji splicingu alternatywnego u roślin - poprzez udział miRNA lub innych sRNA. Dla jednego ze zmienionych genów w wyniku analizy bioinformatycznej wyłoniono cząsteczkę sRNA pochodzącą z Gln-tRNATTG, która może hybrydyzować do najdłuższej izoformy mRNA czynnika splicingowego AtRS31 i naznaczać ją do degradacji. W analizowanych mutantach poziom tRF-AS jest obniżony, podczas gdy poziom najdłuższej izoformy genu AtRS31 wzrasta. Na podstawie uzyskanych wyników potwierdzono hipotezę o udziale sRNA w regulacji splicingu alternatywnego u roślin. Dalsza analiza bioinformatyczna ujawniła istnienie większej ilości cząsteczek sRNA , które powstają z tRNA. Obecność in vivo kilku wyselekcjonowanych cząsteczek potwierdzono poprzez hybrydyzację typu Northern blot.

Alternative splicing of precursor messenger RNA (pre-mRNA) is a process by which multiple mRNA isoforms are generated from a single gene. The experiments described in my PhD thesis have suggested that AtCBC interacts with SERRATE (AtSE) through binding to the large subunit of CBC, AtCBP80. Morover, using the RT-PCR alternative splicing panel I have also demonstrated that AtSE (similar to AtCBC) influences alternative splicing, mostly affecting selection of 5’ splice site of first introns. The AtSE protein acts in cooperation with AtCBC: many changes observed in the mutant lacking the correct SERRATE activity were common to that observed in the cbc mutant. I also investigated a possible effect of miRNA maturation disorder on alternative splicing of pre-mRNA. For this purpose, the RT-PCR analysis was extended and other mutants of plant miRNA biogenesis pathway, hyl1 and dcl1-7 were studied. Interestingly, some changes in the ratio of splicing isoforms were observed in all miRNA biogenesis mutants, suggesting a novel mechanism of alternative splicing regulation in plants. The most intriguing cases were analyzed in terms of finding small RNAs that can influence the level of a particular isoform. Using RNA deep sequencing and in silico approach I found a small RNA fragment derived from Gln-tRNATTG (tRF-AS), which was able to hybridize to the longest mRNA isoform of splicing factor AtRS31, and targeted it for degradation. In conclusion, experiments performed during my PhD studies confirmed that small RNAs can regulate the level of some mRNA isoforms. Further bioinformatic analysis revealed the existence of a large number of sRNA molecules that arise from regions of tRNA. The presence in vivo of several selected molecules was confirmed by Northern blot hybridization.
Involvement of miRNA in the regulation of alternative splicing in plant
Wydział Biologii
Keywords: splicing alternatywny; alternative splicing; miRNA; Arabidopsis