Siatecka, Mirosława. PromotorKulczyńska, Klaudia2020-06-042020-06-042020http://hdl.handle.net/10593/25603Wydział BiologiiKrüppel-like factor 1 (KLF1) jest jednym z czynników transkrypcyjnych niezbędnych w trakcie powstawania i dojrzewania erytrocytów. Ma strukturę domenową i składa się z: N-końcowej domeny transaktywacyjnej rekrutującej kofaktory transkrypcji i C-końcowej domeny zbudowanej z trzech palców cynkowych rozpoznających 9nt motyw DNA: 5’NGG-GC/TG-NGG-4’. Mutacja E325K, znajdująca się w drugim palcu cynkowym KLF1 w pozycji funkcjonalnie zaangażowanej w interakcje z DNA, powoduje dziedziczną anemię dyserytropoetyczną (CDA) typu IV. Aby poznać molekularne podstawy mechanizmu leżącego u podstaw tej anemii wyznaczyłam motyw DNA rozpoznawany przez mutanta CDA-KF1. W tym celu wykorzystałam technikę CASTing w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji. Sekwencja konsensusowa została wyznaczona jako: 5’-NGG-GGG/T-G/TG/TG/T-3’. Różni się ona znacznie od motywu rozpoznawanego przez białko typu dzikiego: (1) zawiera guaninę w 5. pozycji, (2) jest zdegenerowana na 3’ końcu. Cechy te wskazują na wzajemnie wykluczające się preferencje wiązania dla CDA-KLF1 w porównaniu z WT-KLF1. W konsekwencji CDA-KLF1 rozpoznaje i wiąże ektopowe miejsca wiązania, co prowadzi do aktywacji puli genów nigdy nie aktywowanych przez WT-KLF1. Dowiodłam, że mutant CDA-KLF1 aktywuje transkrypcję genów, które zawierają nowo zidentyfikowany motyw w miejscach regulatorowych. Wśród tych genów mogą znaleźć się geny neomorficzne, spoza układu hematopoetycznego których ektopowa aktywacja może wyjaśnić obserwowany u pacjentów z CDA typu IV fenotyp.Krüppel like factor 1 (KLF1) is essential transcription factor for erythrocytes development. It consists of two domains: an N-terminal transactivation domain recruiting transcription cofactors and a C-terminal domain comprising three zinc fingers that recognize 9 nucleotide DNA motif: 5’NGG-GC/TG-NGG-3’. The E325K mutation, located in the second zinc finger of KLF1 at position functionally involved in interactions with DNA, causes congenital dyserythropoietic anemia (CDA) type IV. To decipher the molecular mechanism underlying CDA type IV anemia I determined the DNA consensus binding site for CDA-KLF1 mutant. To this end I used in vitro selection (CASTing), combined with new generation sequencing. The DNA binding motif was defined for CDA-KLF1 as: 5’-NGG-GGG/T-G/TG/TG/T-3’. This motif is significantly different from the motif recognized by wild type protein: (1) contains guanine in the 5th position, (2) is degenerated at the 3’ end. These features indicate mutually exclusive binding preferences for the CDA-KLF1 mutant compared to the WT-KLF1. As a consequence the CDA-KLF1 recognizes and binds ectopic DNA binding sites, which leads to the activation of genes not normally regulated by WT-KLF1. The CDA-KLF1 mutant participates in transcription activation of genes that have this newly defined DNA motif in regulatory regions. There may be neomorphic genes between them, outside the hematopoietic system, that ectopic activation would explain the phenotype of patients with CDA type IVpolinfo:eu-repo/semantics/restrictedAccessKrüppel-like Factor 1 (KLF1)oddziaływania białko-DNADNA-protein interactionsselekcja in vitro (CASTing)in vitro selection (CASTingerytropoezaerythropoiesisanemiaDysertacja