Rola kompleksów białkowych GAF, ISGF3 oraz IRF1 w rozwoju transkrypcyjnej odpowiedzi indukowanej IFNα oraz IFNγ oraz ich funkcjonalnym podobieństwie - Sekrecka, Agata (My University, 2022)
Interferony (IFN) są cytokinami odkrytymi dzięki swoim właściwościom interferencji w rozwój zakażenia wirusowego, jednak są one zaangażowane również w inne procesy biologiczne np. w regulację proliferacji komórek, apoptozy czy komórkowej odpowiedzi zapalnej oraz w funkcjonowanie odporności wrodzonej i nabytej. IFNα i IFNγ indukują ekspresję genów stymulowanych przez IFN (ISG) poprzez fosforylację białek STAT1 i/lub STAT2. Czynniki transkrypcyjne jako homodimery STAT1 (zwane dalej GAF, w odpowiedzi na IFNα i IFNγ) lub heterodimery STAT1/2 (GAF-podobne, tylko IFNα) bezpośrednio aktywują geny zawierające element DNA - GAS. Heterodimer białek STAT1/2 wraz z białkiem IRF9 tworzą kompleks ISGF3, który w odpowiedzi na IFNα poszerza zestaw elementów regulatorowych, które mogą być wykorzystane przez szlak JAK-STAT o element ISRE. Oba IFN dodatkowo stymulują ekspresję białka IRF1, które może następnie indukować ekspresję innych ISG w odpowiedzi na IFNα i IFNγ poprzez swoje niezależne wiązanie się do ISRE. Chociaż klasyczne szlaki sygnałowe w odpowiedzi na IFNα i IFNγ są różne, to ich odpowiedzi transkrypcyjne, jak i rola biologiczna w dużym stopniu się pokrywają. Aby wyjaśnić to zjawisko, postawiliśmy hipotezę, że zróżnicowane wiązanie się kompleksów ISGF3, IRF1 i GAF/GAF-podobnych do miejsc regulatorowych ISRE, GAS i ISRE+GAS powoduje oparte na genach STAT1, STAT2, IRF9 i IRF1 pozytywne sprzężenie zwrotne, a także jest podstawą odpowiedzi komórkowej na IFNα i IFNγ wyjaśniając ich funkcjonalne podobieństwo. Wykorzystaliśmy integrację danych pochodzących z całogenomowych eksperymentów ChIP-seq oraz RNA-seq przeprowadzonych na linii Huh7.5. Dostarczyły one informacji o ekspresji genów oraz interakcji chromatyny z czynnikami transkrypcyjnymi indukowanych stymulacją IFNα lub IFNγ. Dzięki temu podejściu zidentyfikowaliśmy 220 genów indukowanych zarówno przez IFNα i IFNγ. Ponadto scharakteryzowaliśmy elementy regulatorowe w ich promotorach i podzieliliśmy je na grupy genów ze względu na posiadanie GAS, ISRE lub kompozytowego miejsca GAS+ISRE. Następnie zidentyfikowaliśmy czynniki transkrypcyjne, które aktywują każdą grupę genów w odpowiedzi na poszczególny IFN. Mimo, że powyższy zestaw genów był aktywowany przez oba IFN, to geny zawierające ISRE były mocniej indukowane w odpowiedzi na IFNα, ze względu na wiązanie silniejszego czynnika - ISGF3. Z drugiej strony, geny zawierające GAS były bardziej wystymulowane przez kompleks GAF w odpowiedzi na IFNγ, niż GAF-podobny w odpowiedzi na IFNα. Ponadto, zidentyfikowaliśmy grupę 47 genów zawierających kompozytowe miejsce wiązania GAS+ISRE, które poprzez wiązanie każdego rodzaju kompleksów, to jest GAF/GAF-podobnych do miejsca GAS oraz ISGF3/IRF1 do miejsca ISRE, wykazywały porównywalną indukcję w odpowiedzi na obie stymulacje. Co więcej, stosując ukierunkowaną mutagenezę, wykazaliśmy, że geny zawierające kompozyt GAS+ISRE mogą wykorzystywać jedno z elementów regulatorowymi i, do pewnego stopnia, zachowywać ekspresję, gdy drugie z miejsc jest nieaktywne. Dodatkowo, udowodniliśmy, że w traktowanych IFNα i IFNγ mutantach komórek Huh7.5 które nie posiadają jednego z białek: STAT1, STAT2, IRF9, IRF1 lub obu IRF9/IRF1 istnieją alternatywne szlaki sygnałowe, które regulują ekspresję ISG w przypadku braku aktywności podstawowych czynników transkrypcyjnych regulowanych w szlaku odpowiedzi na IFN. Wśród genów zawierających miejsca kompozytowe zidentyfikowaliśmy geny dla białek STAT1 (kompozyt nie w promotorze, lecz w dystalnym elemencie regulatorowym), STAT2 i IRF9, które wraz z genem dla białka IRF1 (zawierającym miejsce GAS w promotorze), ulegają podwyższonej ekspresji w odpowiedzi na stymulację IFNα i IFNγ, powodując w ten sposób nagromadzenie nowych komponentów stymulując formowanie się nowych kompleksów czynników transkrypcyjnych i przyspieszając dodatnie sprzężenie zwrotne, które kontroluje przedłużoną odpowiedź komórkową na IFN. Jako wynik tej pracy proponujemy nowy, szczegółowy model odpowiedzi komórkowej indukowanej przez IFNα i IFNγ, które oparty jest zarówno na niefosforylowanych jak i fosforylowanych kompleksach ISGF3, GAF/GAF-podobnych oraz IRF1. W różnych kombinacjach, a także w zmienny w czasie sposób, kompleksy te pośredniczą w kształtowaniu się wczesnej i przedłużonej odpowiedzi na IFN, działając poprzez geny zawierające miejsca wiązania GAS, ISRE oraz kompozytowe. IFNα oraz IFNγ indukują wspólną pulę genów przez podobny zestaw czynników transkrypcyjnych, co leży u podstaw ich transkrypcyjnego oraz funkcjonalnego podobieństwa. W sercu tego systemu znajdują się geny posiadające oba miejsca wiązania, GAS i ISRE, które z jednej strony regulują ekspresję STAT1, STAT2 i IRF9, wzmacniając w ten sposób tworzenie nowych czynników transkrypcyjnych i przedłużają odpowiedź na IFN, z drugiej strony kontrolują ekspresję wspólnej puli genów o zróżnicowanych funkcjach, kształtując w ten sposób biologiczną rolę IFNα oraz IFNγ. Dodatkowo w modelu tym, następujące po sobie aktywacje konkretnych genów udało nam się powiązać z odpowiedzią biologiczną i tak wczesne geny posiadające GAS odpowiedzialne są za rozpędzenie maszynerii transkrypcyjnej oraz rozbudzenie wczesnej immunologicznej odpowiedzi wrodzonej, podczas gdy późniejsze geny posiadające dodatkowo lub wyłącznie miejsce ISRE, wzmacniają odpowiedź wrodzoną oraz stymulują odpowiedź nabytą, jednocześnie wykazując coraz silniejsze działanie antywirusowe. Aby dopełnić ten model, uwzględniliśmy potencjalną rolę niefosforylowanych STAT1, STAT2, IRF9 i IRF1 zarówno w utrzymywaniu konstytutywnej ekspresji ISG jak i przywracaniu homeostazy.

Interferons (IFN) belong to the superfamily of cytokines discovered as antiviral proteins, but they are also involved in cell proliferation, apoptosis, inflammation, and adaptive immunity. IFNα and IFNγ induce the expression of IFN-stimulated genes (ISG) by phosphorylating Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT)1 and/or STAT2 proteins. Transcription factors (TF) as STAT1 homodimers (GAF, IFNα and IFNγ) or STAT1/2 heterodimers (GAF-like, IFNα) directly activate genes containing the IFNγ-activation site (GAS) DNA element. STAT1/2 heterodimer with interferon regulatory factor (IRF)9 (known as ISGF3) in response to IFNα expands the range of regulatory elements that can be targeted by the JAK-STAT pathway to IFN-stimulated response element (ISRE). Both IFNs induce the expression of IRF1, which can regulate the expression of ISGs in response to IFNα and IFNγ by binding the ISRE independently. Although the core signaling pathways of IFNα and IFNγ are distinct, their transcriptional responses greatly overlap. To explain this phenomenon, we define the hypothesis that differential binding of ISGF3, IRF1 and GAF/GAF-like complexes to ISRE, GAS and ISRE+GAS composite sites regulates positive feedback of the STAT1, STAT2, IRF9 and IRF1 genes and long-term IFNα and IFNγ responsiveness and explains functional overlap. Using the Huh7.5 cell line as a model and genome-wide, integrative approach, which combines binding and expression data, we identified 220 overlapping genes induced by IFNα and IFNγ. Moreover, we characterized the regulatory elements in their promoter and divided them into GAS-, ISRE-, or composite GAS+ISRE-containing gene groups. Next, we assessed the TFs which can activate each gene group in response to IFNα or IFNγ. While being responsive to both stimuli, ISRE-containing genes were higher induced in response to IFNα because of the potency of ISGF3. On the contrary, GAS-containing genes were more responsive to the GAF complex in response to IFNγ. We identified a group of 47 GAS+ISRE composite-containing genes, which by co-recruitment of GAF/GAF-like complexes to the GAS and ISGF3/IRF1 to the ISRE site are highly responsive to both stimulations. Furthermore, using site-directed mutagenesis, we showed that composite-containing genes could switch between regulatory elements and, to some extent, preserve the expression when one of the sites is mutated. What is more, we proved that in IFNα- and IFNγ-treated STAT1-, STAT2-, IRF9-, IRF1- and IRF9/IRF1-mutant Huh7.5 cells confirmed the existence of the alternative signaling pathways, which regulate the ISG expression in the absence of the canonical TFs. Among composite-containing genes, we identified STAT1 (composite in distal regulatory element), STAT2 and IRF9, which, together with GAS-containing IRF1 gene, were up-regulated in response to IFNα and IFNγ, thus enhancing the new complex formation and accelerating the positive feedback loop, which controls the long-term IFN-activated cellular response. Together, we propose a novel, detailed model of IFNα- and IFNγ-induced cellular response, which depend on unphosphorylated and phosphorylated ISGF3, GAF/GAF-like complexes and IRF1. In a combinatorial and timely fashion, these complexes mediate the early and prolonged IFN response through GAS-, ISRE- and composite-containing genes. The core set of these genes and activated TFs are commonly regulated by IFNα and IFNγ what underlies the transcriptional and functional overlap between these two stimulations. In the heart of this system are placed the composite genes, which on the one hand regulate the STAT1, STAT2 and IRF9 expression, thus enhancing the new TF complex formation and long-term IFN response, on the other hand, control many diverse ISG expressions shaping the cellular IFN responsiveness and its biological activity. We combined the consecutive activation of GAS, composite- and ISRE containing gene activation with possible engagement in transcriptional, then innate, towards adaptive immune response. To complete this model, we incorporated the potential role of STAT1, STAT2, IRF9 and IRF1 in constitutive ISG expression and rebalancing the homeostasis.
The role of GAF, ISGF3 and IRF1 complexes in time-dependent IFNα- and IFNγ-activated transcriptional responses and functional overlap
Wydział Biologii
Keywords: Interferon alfa; Interferon alpha; Interferon gamma; szlak JAK-STAT; JAK-STAT pathway; ChIP-seq; RNA-seq