Określenie wpływu nieprawidłowości splicingu mRNA czynnika transkrypcyjnego NFIX na patomechanizm dystrofii miotonicznej oraz opracowanie narzędzia terapii genowej dla tej choroby - Rogalska, Zuzanna (My University, 2023)
Dystrofia miotoniczna typu 1 (DM1) jest dziedziczną, dominującą chorobą genetyczną, spowodowaną ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń CTG w genie DMPK. Nadmiernie wydłużone powtórzenia CUG (CUGexp) w zmutowanym mRNA są toksycznym produktem zmutowanego genu. Zmutowany mRNA sekwestruje czynniki splicingowe takie jak MBNL, a następnie w wyniku funkcjonalnego niedoboru tych białek wywołuje globalne zmiany w alternatywnym splicingu w mięśniach szkieletowych, sercu i mózgu, czego efektem są objawy charakterystyczne dla DM1. Nieprawidłowości w alternatywnym splicingu są kluczową molekularną przyczyną rozwoju DM1. Profil alternatywny splicingu wielu genów zaangażowanych w homeostazę mięśni i ich prawidłowe funkcjonowanie jest istotnie zaburzony. Niemniej jednak, molekularne konsekwencje zaburzeń alternatywnego splicingu większości genów są nadal nieznane. Jednym z eksonów zależnych od MBNL, którego efektywność włączenia do mRNA w procesie splicingu jest istotnie podwyższona w mięśniach szkieletowych DM, jest ekson 7 NFIX, genu kodującego czynnik transkrypcyjny niezbędny do prawidłowego rozwoju mięśni. Pierwszym celem niniejszej pracy było lepsze zrozumienie patomechanizmu DM w kontekście zaburzeń splicingowych NFIX poprzez zrozumienie wpływu włączenia eksonu 7 na aktywność transkrypcyjną NFIX. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zastosowano dwa alternatywne podejścia. Pierwszym z nich było stworzenie dwóch stabilnych linii komórkowych z indukowalną nadekspresją izoform NFIX z eksonem 7 i bez eksonu 7 (NFIX+7 lub NFIX-7) w oparciu o komórki HEK z funkcjonalnym nokautem endogennego NFIX (NFIX-KO). Nieoczekiwanie wyniki RNA-seq nie wykazały znaczących różnic w aktywności transkrypcyjnej tych dwóch izoform w stworzonych modelach komórkowych, być może z powodu niewłaściwego dopasowania poziomu ekspresji egzogenów (zbyt wysoki). Drugie podejście opierało się na manipulacji włączania egsonu 7 do endogennie eksprymowanego mRNA NFIX przy użyciu antysensownego oligonukleotydu (AON) nakierowanego na połączenie eksonu 7 z intronem 7. W ludzkich komórkach mięśni szkieletowych, w których dominuje izoforma NFIX+7, zastosowany AON indukował efektywne pomijanie eksonu 7 i produkcję głównie izoformy NFIX-7. Takie podejście umożliwiło wygenerowanie modelu komórkowego w kontekście środowiska, w którym NFIX jest naturalnie zaangażowany w proces prawidłowego rozwoju mięśni, ale także w patogenezę DM1. W tych komórkach ekspresja NFIX jest stosunkowo wysoka i jest regulowana przez natywny promotor. Wyniki eksperymentów RNA-seq ujawniły setki genów, których ekspresja uległa istotnym zmianom po traktowaniu AON, co sugeruje, że obie izoformy splicingowe - NFIX+7 i NFIX-7 - różnią się znacząco aktywnością transkrypcyjną. Analiza ontologii genów (GO) wykazała znaczne wzbogacenie klas genów, które są wrażliwe na te dwie izoformy NFIX, ale także zaobserwowano istotną zmianę ich ekspresji w mięśniach pacjentów z DM1. Wśród 5641 genów, których ekspresja jest znacząco zmieniona w tkankach DM1 (P<0,05) zidentyfikowano 2070 genów, których ekspresja była znacząco zmieniona w komórkach mięśniowych poddanych działaniu AON zmieniającemu splicing NFIX. Głównymi terminami GO wzbogaconymi w obu porównaniach (w pierwszym – geny wrażliwe na poziom NFIX oraz na obecność jego izoform splicingowych, w drugim – geny wrażliwe na izoformy splicingowe NFIX oraz zmienione w tkankach pacjentów DM1) były geny składników strukturalnych macierzy zewnątrzkomórkowej i geny białek wiążących się z kolagenami. Są to geny niezmiernie istotne dla prawidłowej budowy i aktywności mięśni szkieletowych, a zatem zaburzenie splicingu NFIX może stanowić istotny element patogenezy DM1. Podsumowując tę część pracy można stwierdzić, że nieprawidłowa dystrybucja eksonu 7 NFIX spowodowana sekwestracją białek MBNL na RNA ze zmutowanym CUGexp wywołuje liczne zmiany ekspresji genów zachodzących w mięśniach szkieletowych, które to mogą być odpowiedzialne za kształtowanie fenotypu chorobowego obserwowanego u pacjentów z DM1. DM jest chorobą nieuleczalną. Kiedy liczba powtórzeń osiąga wysoki poziom (od setek do tysięcy), występujące objawy kliniczne są cięższe oraz wzrasta wydajność sekwestracji zależnej od długości powtórzeń. Proponowane wcześniej strategie terapeutyczne prowadzące do podwyższenia poziomu MBNL1 za pomocą narzędzi terapii genowej wiążą się z występowaniem wielu niepożądanych konsekwencji. Długotrwała, niekontrolowana nadekspresja MBNL1 u myszy prowadzi bowiem do zmniejszenia masy ciała, zwiększonej śmiertelności i uszkodzenia mięśni, w tym mięśnia sercowego. Terapia genowa prowadząca do podwyższenia poziomu MBNL1 u pacjentów z DM1 wiąże się również z wieloma innymi ograniczeniami. Jednym z nich jest niejednorodność sekwestracji MBNL spowodowana mozaicyzmem somatycznym długości powtórzeń CTG w komórkach tego samego pacjenta oraz pomiędzy różnymi osobami ze zdiagnozowanym DM1. Aby sprostać tym ograniczeniom, zaprojektowałam i wygenerowałam autoregulowany konstrukt do nadekspresji MBNL1, który umożliwia produkcję białka MBNL1 dostosowaną do poziomu aktywnej puli endogennych białek MBNL w komórce. Ta strategia terapeutyczna daje więc możliwość przezwyciężenia ograniczeń wynikających z niejednorodności ekspansji powtórzeń CTG i w konsekwencji różnego stopnia niedoboru MBNL w różnych komórkach czy włóknach mięśniowych. Konstrukt ten zawiera sekwencję kodującą MBNL1 przedzieloną fragmentem pre-mRNA ATP2A1 z alternatywnym eksonem wrażliwym na poziom MBNL, który zawiera kodon stop w ramce odczytu dla MBNL1. Włączenie tego eksonu prowadzi więc do tworzenia nieaktywnej, skróconej formy białka, natomiast jego wyłączenie, następujące przy niedoborze MBNL, powoduje wzrost produkcji w pełni aktywnej formy MBNL1. Takie podejście umożliwia ograniczoną i ściśle kontrolowaną nadekspresję MBNL1, w zależności od stopnia niedoboru białka, a zarazem może odpowiadać na niejednorodność długości powtórzeń CUG. Podsumowując tę część pracy można powiedzieć, że przeprowadzone badania wykazały, że nadekspresja MBNL1 ze stworzonego konstruktu genetycznego podlega autoregulacji i ma potencjał terapeutyczny prowadzący do korygowania nieprawidłowości alternatywnego splicingu, co wykazano dla komórek pochodzących od pacjentów z DM1. Myotonic dystrophy type 1 is a hereditary, autosomal disease caused by expansion of trinucleotide CTG repeats in DMPK gene. Expanded CUG repeats in mutant mRNA is a major toxic product of mutant gene. It sequester MBNL splicing factors and due to functional insufficiency of these proteins trigger global changes in alternative splicing in skeletal muscles, heart and brain, which result in symptoms characteristic for DM1. The abnormalities in alternative splicing are crucial molecular feature of DM1. The alternative splicing of many genes engaged in muscle homeostasis and proper functioning is impaired. Although, the molecular consequence of majority of genes with altered splicing pattern is still unknown. One of the MBNL-dependent exons, which inclusion is significantly higher in skeletal muscles of DM, is exon 7 of NFIX, a gene encoding for transcription factor essential for muscle development. First aim of this study was to better understand the pathomechanism of DM in case of abnormalities in the splicing of NFIX. The examination of whether the contribution of exon 7 has an impact on NFIX transcriptional activity gave a deeper understanding of DM1 pathomechanism which is studied for a long time. To answer this question two alternative approaches were used. First of them was generation of two stable cell lines with inducible overexpression of NFIX isoforms with and without exon 7 (NFIX+7 or NFIX-7) based on a HEK cell with functional knockout of endogenous NFIX (NFIX-KO). Unexpectedly, RNA- seq results did not show significant differences in transcriptional activity of these two isoforms in developed cellular models, perhaps due to not well adjusted level of overexpression of exogenes (too high). The second approach based on manipulation of exon 7 inclusion of endogenous NFIX mRNA using the antisense oligonucleotide (AON) targeting (AON) targeting exon 7/intron 7 boundary. In human skeletal muscle cells, in which NFIX+7 isoform predominates, this AON induces efficient exon 7 skipping and production of NFIX-7 isoform. This approach gave the possibility to generate a model with an cellular environment where NFIX is engaged in the developmental process, but also in DM1 pathogenesis. The expression level of NFIX is relatively high in these cells and is driven by the native promoter. The results of RNA-seq revealed hundreds of genes which expression was significantly changed after AON treatment, suggesting that both splicing isoforms, NFIX+7 and NFIX-7, differ significantly in transcriptional activity. Gene ontology (GO) analysis showed significant enrichment of groups of genes that are sensitive to NFIX isoforms and abnormally expressed in DM1 patients. Among 5641 genes which expression is affected in DM1 (P<0.05), 2070 genes were identified which are also sensitive to treatment with AON modulating splicing pattern of NFIX. The major GO molecular function terms enriched in both comparisons (first: genes sensitive to the level of NFIX and its splicing isoforms; second: genes sensitive to the NFIX splicing isoforms and changed in DM1 tissues) were extracellular matrix structural constituent, and collagen binding. These functions are incredibly important for the proper structure and activity of skeletal muscle, therefore NFIX splicing abnormality may be essential trigger of DM1 pathogenesis. Taken together, these results showed that abnormal distribution of NFIX exon 7 caused by sequestration of MBNL proteins on CUGexp affects a subset of gene expression changes occurring in DM1 skeletal muscles, which may be responsible for the development of disease phenotype observed in DM1 patients. DM is an incurable disease. When the number of repeats reach a higher level clinical symptoms are more severe and the sequestration efficiency, which depends on the size expansion, increase. Previously proposed therapeutic strategies leading to increase of the MBNL1 level via gene therapy tools are associated with many undesirable consequences. Uncontrolled MBNL1 overexpression in mice leads to reduced body weight, increased mortality, or muscle damage, including heart muscle. The gene therapy leading to the increase of MBNL1 level is also associated with many limitations. One of them is heterogeneity in sequestration of MBNLs caused by somatic mosaicism of CTG repeat length in cells of the same patient and between individuals with DM1. To deal with these limitations I designed and generated the autoregulated MBNL1 overexpression construct which enables the production of MBNL1 adjusted to the level of active pool of endogenous MBNLs. It was assumed that this therapeutic strategy gave the possibility to overcome the limitations caused by heterogeneity of CTG repeat expansions and as a consequence different levels of MBNL insufficiency in different cells/myofibers. This construct contains MBNL1-coding sequence separated by the fragment of ATP2A1 pre-mRNA with MBNL-sensitive alternative exon containing in frame stop codon. The inclusion of this exon leads to the arrangement of the inactive form of the protein but its exclusion, occurring during MBNL insufficiency, gives rise in production of fully active MBNL1. This approach enables the restricted expression of MBNL1 protein only if its level in cell is too low and potentially can be controlled by heterogeneity of CUGexp load. It was shown that expression of MBNL1 assembled from this construct is tunable and has therapeutic potential to correct the alternative splicing abnormalities in DM1 patients-derived cells.
Determination of the impact of splicing abnormalities of the NFIX transcription factor mRNA on the pathomechanism of myotonic dystrophy and development of gene therapy tool for this disease
Wydział Biologii
Keywords: DM1; NFIX; oligonukleotydy antysensowe; MBNL; alternatywne składanie; antisense oligonucleotides; alternative splicing