Filogenetyczne i funkcjonalne analizy genów kodujących czynniki transkrypcyjne SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE u wątrobowca Marchantia polymorpha - Alisha, Alisha (My University, 2023)
Czynniki transkrypcyjne z rodziny SPL, SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE, stanowią zróżnicowaną funkcjonalnie grupę białek, które kontrolują szereg podstawowych aspektów wzrostu i rozwoju roślin. Ponieważ geny SPL są specyficzne dla roślin, stąd konieczne jest zrozumienie ich funkcji wśród przedstawicieli żyjących linii roślin lądowych, aby zrozumieć ich ewolucję. W pierwszej części mojej pracy doktorskiej zajęłam się analizą filogenetyczną w celu zbadania relacji między członkami rodziny SPL przedstawicieli wszystkich linii mszaków: dwóch gatunków glewików, Anthoceros agrestis i A. punctatus, wątrobowca Marchantia polymorpha i mchu Physcomitrium patens, oraz rośliny okrytozałążkowej Arabidopsis thaliana. Na podstawie analizy filogenetycznej, białka SPL sklasyfikowano w czterech grupach filogenetycznych. Zaobserwowałam ponadto, że członkowie rodziny SPL w tej samej grupie posiadają podobne struktury genów i podobny zestaw domen białkowych, co może potencjalnie wskazywać na pełnienie podobnych funkcji. Przeprowadzone badania wykazały, że podobnie jak M. polymorpha, przedstawiciele glewików również posiadają \ tylko czterech członków w rodzinie SPL, co stanowi najprostszy zestaw genów SPL wśród roślin lądowych. W drugiej części mojej pracy doktorskiej wykorzystałam szereg narzędzi molekularnych w celu określenia funkcji genów MpSPL3 i MpSPL4 z modelowego gatunku wątrobowca, M. polymorpha. Analiza aktywności transkrypcyjnej promotorów in planta badanych genów przy użyciu genu reporterowego β-glukuronidazy w połączeniu z analizą RT-qPCR wykazała, że oba geny ulegają ekspresji zarówno podczas wegetatywnej jak i reprodukcyjnej fazy cyklu życiowego M. polymorpha. Następnie, w celu uzyskania roślin z wyłączoną funkcją genu MpSPL3 lub MpSPL4 zastosowano podejście CRISPR/Cas9. Otrzymane mutanty ∆Mpspl3ge charakteryzowały się zredukowaną wielkością i kształtem plech oraz opóźnionym wzrostem w porównaniu do roślin typu dzikiego. Co ciekawe, mutanty ∆Mpspl4ge wykazały jeszcze silniejszy fenotyp niż rośliny ∆Mpspl3ge, gdyż rośliny te rosły jako masy komórkowe bez charakterystycznej dla Marchantia budowy plechy. Ponieważ w przypadku obu genów MpSPL utrata ich funkcji spowodowało bardzo silne zaburzenie rozwoju wątrobowca, w kolejnym podejściu zastosowałam sztuczne mikroRNA w celu otrzymania roślin z obniżoną ekspresją badanych genów. W przypadku obu genów, mutanty otrzymane za pomocą sztucznego mikroRNA wykazały opóźnienie wzrostu podczas wegetatywnej fazy cyklu. Co więcej, wytwarzanie gametangioforów zostało całkowicie zablokowane w przypadku silnie obniżonej ekspresji genu MpSPL3, podczas gdy obniżenie ekspresji MpSPL4 spowodował opóźnioną produkcję archegonioforów o zmienionej morfologii w porównaniu do roślin typu dzikiego. Dlatego właściwy poziom ekspresji genów MpSPL3 i MpSPL4 jest niezbędny dla rozwoju organów rozmnażania płciowego. W celu sprawdzenie efektu nadprodukcji białek MpSPL3 i MpSPL4 na rozwój M. polymorpha, przygotowałam rośliny transgeniczne z nadekspresją obu genów. Wstępna analiza roślin z nadekspresją genu MpSPL3 nie wykazała zmian w ich fenotypie podczas wegetatywnej fazy wzrostu w porównaniu do roślin typu dzikiego. Z kolei nadekspresja genu MpSPL4 spowodowała zmiany w morfologii plech, które były mniejsze i węższe w porównaniu do roślin typu dzikiego oraz wytwarzały powiększone miseczkowate zbiorniki produkujące wegetatywne rozmnóżki. Podsumowując, przedstawione wyniki dają znaczący wgląd w podstawowe funkcje genów MpSPL3 i MpSPL4 z rodziny czynników transkrypcyjnych SPL u wątrobowca M. polymorpha, które są kluczowymi faktorami kontrolującymi prawidłowy wzrost i rozwój wegetatywnych plech, jak i struktur rozmnażania płciowego u tego wątrobowca. The SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) family of transcription factors is functionally diverse in controlling a number of fundamental aspects of plant growth and development. Since the SPL genes exist amongst plants only, hence, it is imperative to understand their functions amongst basal lineages of land plants, to gain understanding of their evolution. The first part of my thesis presents the phylogenetic relationships between SPL family members from representatives of all lineages of bryophytes: two hornworts, Anthoceros agrestis and A. punctatus, liverwort Marchantia polymorpha, and moss Physcomitrium patens, and angiosperms representatives, Arabidopsis thaliana. The phylogenetic analysis classified SPL proteins in four phylogenetic groups. We found that the SPL family members within the same group share similar gene structures and protein domains which might hint towards the possible overlap in their putative functions. Moreover, there were no SPL genes identified in the hornwort lineage when we started our analysis and our results established that a minimal set of SPL genes is present in hornworts of Anthoceros lineage, which is similar to liverwort, M. polymorpha. In the second part of presented thesis several molecular genetic tools were applied to characterize the function of MpSPL3 and MpSPL4 genes from model liverwort species, M polymorpha. First, combining in planta promoter activity using GUS reporter gene together with RT-qPCR analysis we have shown that both MpSPL3 and MpSPL4 genes are ubiquitously expressed during the vegetative as well as reproductive phases of Marchantia’s life cycle. Next, to obtain knockout plants for each gene, CRISPR/Cas9 approach was used. The obtained two loss-of-function MpSPL3 plants displayed reduced thalli with delayed growth in comparison to wild-type plants. On the other hand, MpSPL4 loss-of-function plants displayed more severe phenotype resembling a prothallus-like stage with no production of gemma cups. As in the case of both genes’ loss-of-function mutations caused very strong effect on Marchantia development, we applied artificial miRNA approach to knockdown the expression of MpSPL3 and MpSPL4 genes. The obtained knockdown plants for both genes displayed growth retardation during their vegetative growth. Moreover, gametangiophores production was completely abolished in Mpspl3-kd lines, while Mpspl4-kd plants exhibited delayed archegoniophores production which additionally showed morphological distortions. Therefore, proper level of MpSPL3 and MpSPL4 genes expression is also indispensable for Marchantia sexual organs development. In third approach, we have prepared overexpression lines of both genes to study how the MpSPL3 and MpSPL4 protein excess will influence Marchantia development. The preliminary phenotypic analysis for gain-of-function MpSPL3 transgenic plants displayed no significant changes in phenotype during vegetative stage of growth as compared to wild-type plants. On the other hand, the plants overexpressing MpSPL4 protein displayed smaller and narrower thalli with bigger gemma cups in comparison to wild-type plants. Taken together, the presented results provide significant insights into the basic functions of MpSPL3 and MpSPL4 genes from the SPL TF family from liverwort M. polymorpha, which are crucial players in controlling proper growth and development of both vegetative thallus and reproductive organs.
Phylogenetic and functional studies of SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE transcription factor gene family members in the liverwort Marchantia polymorpha
Wydział Biologii
Keywords: Marchantia polymorpha; wątrobowiec; czynniki transkrypcyjne SPL; liverwort; SPL transcription factors