Browsing by Author "Gielnik, Maciej"

Now showing 1 - 1 of 1
  • Item
    Fałdowanie i agregacja ludzkiego białka prionowego: biofizyczne badania oddziaływań z jonami metali oraz konstruktem peptydowym NCAM1-Aβ
    (2022) Gielnik, Maciej; Kozak, Maciej. Promotor; Wärmländer, Sebastian. Promotor pomocniczy
    Proces nieprawidłowego fałdowania komórkowej formy białka prionowego (PrPC), jest związany z rozwojem śmiertelnych chorób neurodegeneracyjnych znanych jako pasażowalne encefalopatie gąbczaste, do których należy choroba Creutzfeldta-Jakoba występująca u ludzi lub choroba „szalonych krów” występująca u bydła. Proces ten nie jest zjawiskiem wyjątkowym: w odpowiednich warunkach wszystkie białka mogą ulec zmianie strukturalnej z dobrze rozpuszczalnego stanu natywnego do nierozpuszczalnego i włóknistego stanu amyloidowego. Takie błędne fałdowanie białek połączone z ich agregacją związane jest również z kilkoma innymi chorobami neurodegeneracyjnymi. Ludzkie białko PrPC jest zbudowane z 208 aminokwasów i składa się z dwóch strukturalnie różnych domen: nieustrukturyzowanej domeny N-terminalnej (DNT) oraz ustrukturyzowanej, głównie α-helikalnej, domeny C-terminalnej (DCT). DNT posiada ośmioaminokwasową powtarzającą się sekwencję (ang. octarepeat, OR), która poprzez reszty histydynowe wiąże jony metali Cu(II) i Zn(II). Wiele kofaktorów, włączając w to jony metali, wpływa na błędne fałdowanie białka PrPC. W niniejszej pracy zastosowałem różnorodne, komplementarne metody biofizyczne do zbadania strukturalnych skutków wiązania jonów Cu(II) i Zn(II) przez ludzkie białko PrPC oraz przez peptyd zawierający sekwencję OR. Wyniki spektroskopii dichroizmu kołowego (ang. circular dichroism, CD) sugerują, że peptyd OR wiąże cztery jony Cu(II) oraz dwa jony Zn(II). Bliskie stechiometrycznym stężenia jonów obu metali wywołują zmianę helisy poliprolinowej typu II w zwrot β, natomiast stechiometryczne stężenia obu jonów metali wywołują powstanie antyrównoległych arkuszy β. Symulacje dynamiki molekularnej peptydu OR związanego z jonami metalu wskazują formowanie struktur spinek do włosów posiadających antyrównoległe arkusze β. Bezpośrednie dodanie jonów Zn(II) do peptydu OR skutkuje wiązaniem barwników, charakterystycznych dla włókien amyloidowych takich jak tioflawina T oraz czerwień Kongo. Po inkubacji peptydu OR z jonami Zn(II) obrazowanie z zastosowaniem mikroskopii sił atomowych oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujawniło obecność włóknistych struktur. Charakterystyczny obraz dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego wykazał obecność poprzecznych arkuszy β, typowych dla włókien amyloidowych. W związku z powyższym wiązanie jonów Cu(II) i Zn(II) przez peptyd OR może prowadzić do powstania struktur amyloidowych. W przypadku ludzkiego białka PrPC wiązanie jonów Zn(II) przez region OR skutkuje oddziaływaniem pomiędzy DNT i DCT. Spektroskopia CD wskazuje na utratę struktury α-helikalnej na skutek wiązania jonów Zn(II), prawdopodobnie w obrębie helisy drugiej i trzeciej, zlokalizowanych w DCT, oraz powstanie zwrotów β, prawdopodobnie dokoła związanego jonu Zn(II). Wyniki miareczkowania z zastosowaniem spektroskopii fluorescencji oraz CD sugerują, że pozorna stała dysocjacji dla kompleksu PrPC·Zn(II) mieści się w granicy niskich stężeń mikromolowych, przez co można wnioskować, że takie oddziaływanie jest możliwe w warunkach fizjologicznych. Symulacje dynamiki molekularnej dla kompleksu PrPC·Zn(II) wskazują stabilizację trzeciej α-helisy, podczas gdy wyniki małokątowego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego sugerują bardziej kompaktowe zwinięcie białka PrPC związanego z cynkiem. Jako że wiązanie cynku do białka PrPC faworyzuje oddziaływanie międzydomenowe i stabilizuje trzecią α-helisę, cynk może hamować proces agregacji lub tworzenia włókien amyloidowych przez białko PrPC. Ponadto zbadano wpływ zaprojektowanego peptydu NCAM1-Aβ na agregację i tworzenie włókien amyloidowych przez ludzkie białko PrPC. Białko PrPC i peptyd NCAM1-Aβ same tworzą struktury amyloidowe, jednak ich wspólna inkubacja przez trzy dni skutkowała powstaniem wyłącznie niewielkich agregatów. Uzyskane wyniki sugerują bezpośrednie oddziaływanie peptydu NCAM1-Aβ z ludzkim białkiem prionowym, prawdopodobnie poprzezo ddziaływania hydrofobowe, oraz inhibicję agregacji białka PrPC.