Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10593/26438
Title: Mechanizm działania białka opiekuńczego Hfq w tworzeniu kompleksów pomiędzy regulatorowymi RNA MgrR i ChiX a cząsteczkami mRNA u bakterii Escherichia coli
Other Titles: The mechanism of the action of the chaperone protein Hfq in the pairing of regulatory RNAs MgrR and ChiX with mRNA molecules in Escherichia coli
Authors: Kwiatkowska, Joanna
Advisor: Olejniczak, Mikołaj. Promotor
Keywords: Hfq
MgrR
ChiX
sRNA Klasy II
Class II sRNA
Issue Date: 2021
Abstract: U bakterii małe, regulatorowe RNA (sRNA) biorą udział w odpowiedzi na czynniki stresowe pochodzące ze środowiska zewnętrznego. U Escherichia coli oraz pokrewnych gatunków bakterii białko opiekuńcze Hfq stymuluje wiązanie sRNA do regulowanych przez nie cząsteczek mRNA. Białko to posiada trzy powierzchnie oddziaływania z RNA. W oparciu o profile akumulacji sRNA w komórkach E. coli z mutacjami w miejscach wiązania RNA w poprzednich badaniach zaproponowano podział tych cząsteczek na dwie klasy. sRNA Klasy I oddziałują ze stroną proksymalną za pomocą ogona poli(U) zlokalizowanego na ich 3ʹ końcach oraz z powierzchnią dystalną wewnętrznymi motywami bogatymi w reszty U i A. Cząsteczki mRNA regulowane przez te sRNA wiążą się do strony dystalnej Hfq za pomocą motywów ARN. sRNA Klasy II oddziałują z białkiem w alternatywny sposób. W komórkach z mutacją stron proksymalnej i dystalnej charakteryzowała je niższa akumulacja niż w obecności Hfq z mutacją strony bocznej. Na tej podstawie stwierdzono, że sRNA Klasy II kontaktują się z powierzchnią proksymalną i dystalną, podczas gdy mRNA przez nie regulowane wiążą się do strony bocznej. W rozprawie doktorskiej badałam wpływ białka Hfq na asocjację cząsteczek sRNA Klasy II MgrR i ChiX do regulowanych przez nie mRNA, odpowiednio eptB lub ygdQ i chiP. W pierwszym etapie badań wyznaczyłam struktury drugorzędowe badanych RNA. Zbadałam również zależność powinowactwa MgrR do Hfq od mutacji w poszczególnych miejscach wiązania oraz określiłam właściwości tego sRNA w procesie konkurencji o dostęp do Hfq z innymi cząsteczkami. Następnie wykorzystując program KinTek Explorer przeprowadziłam globalną analizę danych asocjacji MgrR do eptB lub ygdQ oraz ChiX do chiP w obecności Hfq i wariantów białka z mutacjami stron rozpoznających RNA. Sprawdziłam także efekt kompetytorowej cząsteczki sRNA na dysocjację kompleksu ChiX-chiP od białka. Otrzymane wyniki pozwoliły na lepsze zrozumienie sposobu rozpoznawania MgrR przez Hfq. Wskazałam również motywy sekwencyjne w MgrR, eptB i ygdQ odpowiadające za kontakt z białkiem. Następnie, scharakteryzowałam wpływ białka na asocjację badanych sRNA Klasy II do regulowanych przez nie mRNA. Zauważyłam także, że mutacja w miejscu wiązania RNA znajdującym się na bocznej stronie Hfq zatrzymywała MgrR i ChiX na białku i uniemożliwiała ich asocjację do mRNA. Co więcej, stwierdziłam, że mutacje w miejscach wiązania RNA na stronach dystalnej i proksymalnej miały bardziej negatywny wpływ na wiązanie MgrR do eptB lub ygdQ niż na wiązanie ChiX do chiP. Jest to zgodne z danymi innych badaczy, potwierdzającymi silniejsze oddziaływanie ChiX z przeciwległymi powierzchniami białka. Wykorzystując program KinTek Explorer wyznaczyłam kinetycznie preferowane ścieżki dla wykonanych reakcji asocjacji. Na ich podstawie zauważyłam, że strona dystalna Hfq jest miejscem wiązania kompetytorowego RNA, które warunkuje uwalnianie kompleksu sRNA Klasy II-mRNA od białka. Obserwację tę potwierdziłam przeprowadzając analizy kinetyk dysocjacji kompleksu ChiX-chiP od Hfq, indukowane obecnością dodatkowej cząsteczki sRNA. Podsumowując, wyniki wykonanych eksperymentów pokazały, że zarówno MgrR jak i ChiX wykorzystują typowy dla sRNA Klasy II model oddziaływania z Hfq. Jednakże cząsteczki te różnią się powinowactwem do poszczególnych miejsc wiązania RNA na powierzchni badanego białka opiekuńczego. Proponuję, że obserwowane różnice mogą mieć wpływ na fizjologiczną rolę badanych sRNA, zapewniającą przystosowanie komórek bakteryjnych do zmieniających się warunków środowiska.
In bacteria, small noncoding RNAs (sRNAs) are involved in response to changes in environmental conditions. The Hfq protein facilitates the base-pairing of sRNAs to their target mRNAs in Escherichia coli and related bacteria. This protein utilizes three distinct RNA binding sites to facilitate RNA interactions. Based on the sRNAs accumulation profile in cells carrying the Hfq protein with mutations in RNA binding sites, sRNAs were previously divided into two classes. Most tested sRNAs showed an overall decrease in accumulation in the rim mutants. These so-called Class I sRNAs bind to the proximal face of Hfq using their 3ʹ-terminal uridine tails, while their internal UA-rich sequences contact the rim of Hfq ring. mRNAs regulated by these sRNAs bind to the distal face of Hfq using repeated ARN sequences. However, a subset of sRNAs, called Class II, were reduced in the distal and proximal face mutants but the levels of a subset of sRNAs increased in the rim mutants. These results suggested that Class II sRNAs interact with opposite sites of the ring, while their target mRNAs interact with the rim of Hfq. In the presented PhD dissertation, the contribution of Hfq protein to association of Class II sRNAs MgrR and ChiX to eptB or ygdQ and chiP mRNAs, respectively, was studied. Firstly, the secondary structures of MgrR and its regulated mRNA fragments were established. Additionally, the affinity of MgrR to RNA recognition sites in Hfq and its properties in the competition to access to the protein were assessed. Then, KinTek Explorer software was used to globally analyze the kinetics data of MgrR and ChiX annealing to regulated mRNAs in the presence of Hfq and its variants with mutations in RNA binding sites. Finally, the effect of an sRNA competitor on the release of the ChiX-chiP complex from the Hfq protein was tested. Overall, the presented results explained how MgrR is recognized by Hfq. Moreover, the sequence motifs in MgrR, eptB and ygdQ responsible for the binding to the chaperone were indicated. The analysis of kinetics of MgrR and ChiX to regulated mRNAs revealed that mutation in the rim of Hfq was the most detrimental as it trapped each sRNA on the Hfq protein and prevented their annealing to regulated mRNAs. On the other hand, the mutations in the proximal and distal face of Hfq were more detrimental for MgrR than ChiX pairing to respective mRNAs, which suggested that ChiX bound tighter than MgrR to each face of Hfq, which would enable it to remain bound to this protein even when one of the binding sites was mutated. Further studies of the effect of sRNA competitor on ChiX annealing to chiP mRNA in presence of Hfq confirmed the role of the Hfq rim site for chiP mRNA binding to Hfq. Additionally, the analysis of kinetically preferred pathways revealed that the distal face of Hfq is a place for RNA competitor binding, enabling the dissociation of sRNA Class II-mRNA complex from the protein. The effect was confirmed by direct dissociation of ChiX-chiP complex from Hfq induced by sRNA competitor. In summary, the data indicate that besides the major similarities in the modes of both Class II sRNAs binding to Hfq there are also subtle differences between them, which can affect the tuning of sRNA-dependent regulation in the adaptation of bacterial cells to changing environmental conditions.
Sponsorship: Badania zawarte w rozprawie doktorskiej były finansowane z środków: 1. Narodowego Centrum Nauki – grant OPUS: 2018/31/B/NZ1/02612 „Mechanizmy rozpoznawania RNA przez białko ProQ oraz rola tego białka w oddziaływaniach pomiędzy niekodującymi RNA a regulowanymi mRNA u bakterii Escherichia coli”, kierownik projektu – dr hab. Mikołaj Olejniczak, prof. UAM. 2. Narodowego Centrum Nauki – grant OPUS: 2014/15/B/NZ1/03330 „Regulacja translacji na etapie elongacji przez niekodujące RNA bakterii”, kierownik projektu – dr hab. Mikołaj Olejniczak, prof. UAM. 3. Narodowego Centrum Nauki – grant OPUS: 2011/01/B/NZ1/05325 „Bakteryjne białko opiekuńcze Hfq w regulacji translacji przez niekodujące RNA”, kierownik projektu – dr hab. Mikołaj Olejniczak, prof. UAM. 4. Fundacji na Rzecz Nauki Polskiej – projekt TEAM: 2011-8/5 „Molecular mechanisms of translation regulation by small RNAs of pathogenic bacteria”, kierownik projektu – dr hab. Mikołaj Olejniczak, prof. UAM. 5. Uniwersytetu im. A. Mickiewicza w Poznaniu - grant Dziekana Wydziału Biologii: GDWB-03/2017 pt. „Wpływ antysensownych oligonukleotydów na zmianę ramki odczytu w mRNA dnaX z Escherichia coli”, kierownik projektu – Joanna Kwiatkowska. 6. Krajowego Naukowego Ośrodka Wiodącego (KNOW) Poznańskiego Konsorcjum RNA (01/KNOW2/2014). 7. Narodowego Centrum Badań i Rozwoju – projekt „Paszport do przyszłości - Interdyscyplinarne studia doktoranckie na Wydziale Biologii UAM” (POWR.03.02.00-00-I006/17).
Description: Wydział Biologii
URI: https://hdl.handle.net/10593/26438
Appears in Collections:Doktoraty (WB)
Doktoraty 2010-2023 /dostęp ograniczony, możliwy z komputerów w Bibliotece Uniwersyteckiej/

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Joanna Kwiatkowska_ praca doktorska.pdf
  Restricted Access
13.29 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record



Items in AMUR are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.