Browse
Recent Submissions
Now showing 1 - 5 of 235
- ItemIdentyfikacja nowego i regulowanego przez ABA miRNA oraz charakterystyka jego genu docelowego - AtBRO1 w procesach wzrostu i w odpowiedzi na stres abiotyczny u Arabidopsis thaliana(2023) Syed, Muhammad Muntazir Mehdi; Ludwików, AgnieszkaWiele czynników środowiskowych, takich jak podwyższona temperatura, zasolenie i susza, mają wpływ na wzrost i produktywność upraw. Kluczowym szlakiem sygnałowym uczestniczącym w regulacji odpowiedzi roślin na stres jest rdzeniowa sygnalizacja kwasu absysynowego (ABA). ABA kontroluje reakcje roślin poprzez regulację ekspresji genów, także z udziałem ścieżek zależnych od miRNA. miRNA biorą udział w różnych procesach biologicznych, w tym w reakcjach adaptacyjnych na stres abiotyczny. Celem mojej pracy doktorskiej była identyfikacja nowych miRNA zaangażowanych w regulację ekspresji genów w odpowiedzi na ABA. Aby zrealizować postawiony cel badania prowadzono z zastosowaniem rośliny modelowej Arabidopsis thalina formy dzikiej (WT) oraz mutantów szlaku sygnałowego ABA: abi1td, mkkk17 i mkkk18. Analizy z wykorzystaniem RNAseq umożliwiły identyfikację 10 nowych miRNA w odpowiedzi na ABA (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) u formy dzikiej A.thaliana oraz 1 nowy miRNA u mutanta mkkk17. Ponadto, analiza wyników ujawniła, że trzy, siedem i dziewięć znanych miRNA ulegało różnej ekspresji w odpowiedzi na ABA u mutantów abi1td, mkkk17 i mkkk18. Wyniki sekwencjonowania zostały potwierdzone za pomocą ilościowego RT-PCR we wszystkich badanych genotypach. By zidentyfikować geny docelowe i potencjalne miejsca cięcia dla nowozidentyfikowanych miRNA wykorzystano psRNA Target oraz 5′ RLM-RACE. Analiza ontologii wykazała, że potencjalne geny docelowe znanych i nowych miRNA reagujących na ABA są zaangażowane w różne procesy komórkowe w roślinach, w tym rozwój i ruchy aparatów szparkowych. Wyniki te sugerują, że wiele zidentyfikowanych miRNA odgrywa ważną rolę w odpowiedziach roślin na stres środowiskowy i może pełnić wspólne funkcje regulacyjne w szlaku sygnałowym ABA. W kolejnym etapie badania koncentrowały się na charakterystyce nieznanego białka BRO1, zawierającego domenę podobną do BRO (AT1G73390), które jest celem jednego z nowo zidentyfikowanych miRNA, ath-miRn-1. W toku analiz wykazano, że w odpowiedzi na zasolenie, ABA i mannitol transkrypt BRO1 ulegał indukcji. Transgeniczne linie A.thaliana z nadekspresją BRO1 wykazywały silną tolerancję na suszę i stres solny wskazując, że BRO1 reguluje reakcje odpornościowe u roślin. Promotor AtBRO1 w fuzji z GUS wykazywał ekspresję głównie w liściach rozety i kwiatach, zwłaszcza w pylnikach. Analiza lokalizacji subkomórkowej BRO1::GFP wykazała, że białko to lokalizuje się przy błonie cytoplazmatycznej protoplastu. Wyniki analizy transkyptomicznej mutanta typu nokaut w genie BRO1, bro1-1, w odniesieniu do linii dzikiej Arabidopsis, wykazały zmiany w ekspresji wielu genów, o których wiadomo, że są zaangażowane w odpowiedź roślin na stres. Podsumowując, stwierdzono, że BRO1 może odgrywać ważną rolę w regulacji odpowiedzi transkrypcyjnej na ABA i indukcji odpowiedzi roślin na stres abiotyczny. Podsumowując, wyniki badań przedstawione w prezentowanej rozprawie, umożliwiły poznanie nowych mechanizmów regulujących odpowiedź roślin na stres abiotyczny i powiązanych z sygnalizacją ABA. Najważniejszym wynikiem pracy jest identyfikacja aż 11 nieznanych miRNA i głębsza charakterystyka funkcjonowania jednego ze z nich - ath-miRn-1 – w powiązaniu z identyfikacją nowego efektora w reakcji roślin na stres i nieznanego dotąd BRO1. Wyniki uzyskane w ramach pracy rzucają światło na mechanizmy leżące u podstaw tolerancji na stres. Many environmental factors, such as increased temperature, salinity and drought, affect the growth and productivity of crops. A key signaling pathway involved in regulating plant responses to stress is the absisic acid (ABA) signaling pathway. ABA controls plant responses through the regulation of gene expression, also through miRNA dependent pathways. miRNAs are involved in various biological processes, including adaptive responses to abiotic stress. The aim of my PhD thesis was the identification of novel miRNAs which are involved in the regulation of gene expression in response to ABA. In order to achieve this goal, the study was carried out using the model plant Arabidopsis thaliana wild type (WT) and mutants of the ABA signalling pathway: abi1td, mkkk17 and mkkk18. The RNAseq analyses identified 10 new miRNAs in response to ABA in the wild type A. thaliana (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) and 1 new miRNA in the mkkk17 mutant. In addition, analysis of the results showed that three, seven and nine known miRNAs were differentially expressed in response to ABA in the abi1td, mkkk17 and mkkk18 mutants, respectively. In all genotypes tested, the sequencing results were confirmed by quantitative RT-PCR. To identify target genes and potential cleavage sites for newly identified miRNAs, psRNA-Target and 5′ RLM RACE were used. Ontology analysis revealed that the potential target genes of known and novel ABA-responsive miRNAs are involved in various cellular processes in plants, including stomatal development and movement. These results suggest that many of the identified miRNAs play important roles in plant responses to environmental stress. They may have common regulatory functions in the ABA signalling pathway. In the next step, they focused on characterising of the unknown BRO-like domain-containing protein AtBRO1 (AT1G73390) which is targeted by one of the newly identified miRNAs, ath-miRn-1. Analyses showed that BRO1 is induced in response to salinity, ABA and mannitol. Transgenic Arabidopsis lines overexpressing BRO1 showed strong tolerance to drought and salt stress, suggesting that BRO1 regulates stress responses in plants. The BRO1 promoter fused to GUS was expressed mainly in rosette leaves and flowers, especially in anthers. Analysis of the subcellular localisation of BRO1::GFP showed that this protein was localised to the cytoplasmic membrane of the protoplast. The results of the transcriptomic analysis of the knockout mutant in the BRO1 gene, bro1-1, compared to the wild Arabidopsis line showed changes in the expression of many genes known to be involved in plant stress responses. It was concluded that BRO1 may play an important role in regulating the transcriptional response to ABA and in inducing plant responses to abiotic stress. In conclusion, the results presented have allowed the identification of new mechanisms regulating the response of plants to abiotic stress and related to ABA signalling. The most important result is the identification of 11 unknown miRNAs and a deeper characterisation of the function of one of them - ath-miRn-1 - in connection with the identification of a new effector in the plant response to stress - the previously unknown BRO1. The results of this work will shed light on the mechanisms underlying stress tolerance in plants.
- ItemŚcieżki transportu ligandów w białkach(2023) Borja, Carlos Eduardo Sequeiros; Brezovsky, JanAnaliza tuneli białkowych ewoluowała od wizualnej identyfikacji w strukturach statycznych do wykorzystania symulacji dynamiki molekularnej, co prowadzi do obfitości danych. Stanowi to jednak wyzwanie ze względu na ograniczenia zasobów i czasu. W ramach moich badań doktoranckich opracowałem narzędzia i metodologie, aby rozwiązać te problemy. Pierwsza publikacja oferuje zintegrowane podejście do analizy geometrii tunelu i transportu ligandów, zapewniając powtarzalność i niesubiektywne wyniki. Druga publikacja umożliwia szybką i opłacalną analizę tuneli w dużych zbiorach danych, eliminując potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu. Ponadto odkrywa wcześniej przeoczone wąskie tunele przy użyciu mniejszej sondy. W sekcji praktycznych zastosowań, trzecia publikacja bada selektywny transport transportera ABCG46, demonstrując, w jaki sposób modyfikacje tuneli wpływają na translokację ligandów. Czwarty artykuł bada transport wody w enzymach hydrolazowych, ujawniając znaczenie wąskich tuneli, które mogą pomieścić cząsteczki wody mniejsze niż ich promień wąskiego gardła. Protein tunnel analysis has evolved from visual identification in static structures to using molecular dynamics simulations, leading to an abundance of data. However, this poses challenges due to resource and time constraints. In my doctoral research, I developed tools and methodologies to address these issues. The first publication offers an integrative approach for tunnel geometry and ligand transport analysis, ensuring reproducibility and non-subjective results. The second publication enables fast and cost-effective analysis of tunnels in large datasets, eliminating the need for specialized hardware. Additionally, it uncovers previously overlooked narrow tunnels using a smaller probe. In the practical applications section, the third publication investigates the selective transport of the ABCG46 transporter, demonstrating how tunnel modifications impact ligand translocation. The fourth paper explores water transport in hydrolase enzymes, revealing the significance of narrow tunnels that can accommodate water molecules smaller than their bottleneck radii.
- ItemModelowanie molekularne zależności struktura-dynamika-funkcja w białkach(2023) Surpeta, Bartłomiej; Brezovsky, JanCiągły postęp w nauce, metodach obliczeniowych i technologii umożliwia coraz lepsze badanie białek. Na przestrzeni dziesięcioleci stało się jasne, że białka są dynamicznymi jednostkami i aby dokładnie zbadać ich funkcję, nie wystarczy spojrzeć tylko na strukturę, ale także na nieodłączny składnik dynamiczny. W moich badaniach doktoranckich skupiłem się na wygaszaniu kworum, które pozwala na zakłócenie komunikacji bakteryjnej, zmniejszając w ten sposób czynniki wirulencji. Można to osiągnąć enzymatycznie, a zatem takie enzymy były głównym przedmiotem mojej rozprawy doktorskiej. Praca składa się z czterech artykułów. W pierwszym zbadałem szczegóły dynamicznych składników, które determinują i ograniczają aktywność wygaszania kworum w N-końcowych hydrolazach serynowych. Drugi to przegląd literatury podsumowujący podejścia w inżynierii białek, które uwzględniają dynamikę jako kluczową podczas procesu projektowania. Trzecia część przedstawia bibliotekę TransportTools, oprogramowanie opracowane w naszym laboratorium w celu sprostania wyzwaniu spójnej analizy przestrzeni wewnętrznych w danych zespołu białek pochodzących z masowych symulacji dynamiki molekularnej. Ostatnia część rozprawy obejmuje racjonalne projektowanie wariantów acylazy penicyliny G E. coli o ulepszonej aktywności i modulowanej specyficzności wobec cząsteczek sygnałowych różnych patogennych gatunków bakterii. Ongoing advances in science, computational methods, and technology make it possible to study proteins better and better. Over the decades, it has become clear that proteins are dynamic entities, and to accurately study their function, it is not enough to look only at the structure, but also at the inherent dynamic component. In my Ph.D. research, I focused on quorum quenching, which allows the disruption of bacterial communication, thereby reducing virulence factors. It can be achieved enzymatically, and thus such enzymes were the main interest of my dissertation. The thesis consists of four articles. In the first, I investigated details of the dynamic components that determine and limit the quorum quenching activity in N-terminal serine hydrolases. The second is a literature review summarizing approaches in protein engineering that consider dynamics as crucial during the design process. The third part presents the TransportTools library, software developed in our laboratory to address the challenge of consistent analysis of internal spaces in protein ensemble data resulting from massive molecular dynamics simulations. The last part of the thesis covers the rational design of E. coli penicillin G acylase variants with improved activities and modulated specificities towards signaling molecules of different pathogenic bacterial species.
- ItemKontrola crossing-over poprzez białko MSH2 wykrywające nieprawidłowo dopasowane pary zasad DNA w odpowiedzi na wzór chromosomowej heterozygotyczności u Arabidopsis thaliana(2023) Dłużewska, Julia; Ziółkowski, PiotrPodczas mejozy chromosomy homologiczne łączą się w pary i wzajemnie wymieniają materiałem genetycznym w procesie zwanym crossing-over lub rekombinacją mejotyczną. Crossing-over jest ważne dla generowania nowych kombinacji alleli, a co najmniej jedno crossing-over na biwalent jest niezbędne do zapewnienia właściwej segregacji chromosomów w mejozie. Co więcej, rozmieszczenie zdarzeń crossing-over nie jest przypadkowe, a ich liczba jest limitowana – na jedną parę chromosomów podczas mejozy przypada tylko około 2-3 crossing-over, niezależnie od fizycznej wielkości genomu. Jednym z czynników wpływających na rozmieszczenie rekombinacji jest polimorfizm pomiędzy chromosomami homologicznymi. Obecność regionu heterozygotycznego obok regionu homozygotycznego na tym samym chromosomie powoduje redystrybucję crossing-over do regionu polimorficznego. Pokazałam, że ów efekt zestawienia heterozygotyczności in cis (ang. heterozygosity juxtaposition effect), zależy od aktywności białka MSH2, kluczowego elementu systemu naprawy nieprawidłowo sparowanych zasad DNA. Moje wyniki wykazują stymulującą rolę MSH2 w tworzeniu crossing-over klasy I. Dzięki całogenomowej analizie crossing-over w mieszańcach z mutacją msh2 wykazałam, że rekombinacja jest redystrybuowana z wysoce polimorficznych regionów okołocentromerowych do mniej polimorficznych regionów przytelomerowych. Interferencja genetyczna nie uległa zmianie w mutancie msh2 w liniach wsobnych i mieszańcowych. Korzystając z panelu linii Arabidopsis thaliana znakowanych fluorescencyjnie (ang. fluorescent-tagged line, FTL) wykazałam, że wzór rekombinacji jest w znacznej mierze podobny między liniami wsobnymi i mieszańcami, jednak obecność regionu heterozygotycznego na w innym wypadku homozygotycznym chromosomie przekierowuje zdarzenia crossing-over do regionu heterozygotycznego. Wzrost rekombinacji obserwuje się głównie w pobliżu granicy pomiędzy regionem heterozygotycznym i homozygotycznym, podczas gdy spadek zdarzeń crossing-over w części homozygotycznej obejmuje cały ten region. Protokół opisujący wykorzystanie FTL w pomiarach częstotliwości rekombinacji również stanowi część mojej rozprawy doktorskiej. Zdarzenia crossing-over klasy II są wrażliwe na obecność polimorfizmu i z tego powodu nie są wydajnie formowane w regionach heterozygotycznych. W mieszańcach, w których aktywna jest wyłącznie klasa II (podwójny mutant fancm zip4) przyczyną obniżonej płodności jest niedobór crossing-over. Poprzez dodatkową inaktywację MSH2 zwiększyłam płodność roślin. Co więcej, moje całogenomowe analizy crossing-over w tle różnych mutantów, w tym w msh2 fancm i msh2 recq4, w połączeniu z pomiarami częstości rekombinacji przy użyciu FTL ujawniły, że MSH2 ogranicza zachodzenie crossing-over klasy II. MSH2 wykazuje więc przeciwstawne działanie w dwóch szlakach crossing-over. W regionach około-centromerowych, które są znacznie bardziej polimorficzne niż reszta chromosomu, inaktywacja MSH2 nie spowodowała zwiększenia częstości crossing-over klasy II w regionach heterozygotycznych. To pokazuje, że polimorfizm może mieć również niezależny od MSH2 wpływ na rekombinację. Ponadto, nadekspresja pro-rekombinacyjnego czynnika HEI10 spowodowała znaczny wzrost rekombinacji we wszystkich testowanych wariantach heterozygotyczności, z wciąż obecną tendencją regionów heterozygotycznych do stymulowania zdarzeń crossing-over. Wykazałam, że w msh2 HEI10-OE rekombinacja jest zwiększona globalnie z powodu promowania klasy I przez HEI10, jednak nie obserwuje się efektu zestawienia heterozygotyczności in cis. Co więcej, w wariancie msh2 fancm zip4 HEI10-OE nie wykryto stymulowania crossing-over przez HEI10, co dowodzi, że HEI10 nie odgrywa żadnej roli w klasie II. Podsumowując, wykazałam pro-rekombinacyjną rolę MSH2 dla crossing-over klasy I oraz antagonistyczną, anty-rekombinacyjną rolę dla crossing-over klasy II. Moja praca pokazuje, że MSH2 jest głównym regulatorem dla obu szlaków crossing-over, co pozwala na dynamiczną regulację rekombinacji mejotycznej, w zależności od poziomu i rozkładu heterozygotyczności pomiędzy chromosomami homologicznymi. During meiosis, homologous chromosomes pair and reciprocally exchange genetic material in a process called crossover or meiotic recombination. Crossover is important for generating new allele combinations and at least one crossover per bivalent is necessary to ensure proper chromosome segregation in meiosis. Moreover, crossover placement is not random and its numbers are limited – there are only about 2-3 crossovers per chromosome pair per meiosis, regardless of the physical size of the genome. One of the factors influencing recombination pattern is interhomolog polymorphism. The presence of heterozygous region juxtaposed to homozygous region on the same chromosome, causes a redistribution of crossovers into the polymorphic region. I showed that this heterozygosity juxtaposition effect depends on the activity of MSH2 protein, key element of mismatch repair system. My results demonstrate MSH2 stimulating role in the formation of Class I crossovers. With genome-wide crossover mapping in msh2 hybrids, I was able to show that recombination is redistributed from highly polymorphic pericentromeres into less polymorphic subtelomeric regions. Genetic interference was not changed in msh2 inbred and hybrid lines. By using a panel of Arabidopsis thaliana fluorescence-tagged lines (FTLs), I showed that recombination landscape is mostly similar between inbred and hybrid lines, however the presence of heterozygous region on an otherwise homozygous chromosome, redirects crossover events into the former. The increase in heterozygous region is mostly observed close to the heterozygous-homozygous regions boarder, whilst decrease in homozygous part spans the entire region. The protocol for FTL use in crossover rate measurements is also included in this dissertation. Class II crossovers are polymorphism-sensitive and cannot be efficiently formed in heterozygous regions. In hybrids exhibiting only Class II (fancm zip4 double mutant), crossover scarcity is the reason for reduced fertility. By additionally inactivating MSH2, I was able to increase plant fertility. Moreover, my genome-wide crossover analysis in different mutant contexts, including msh2 fancm and msh2 recq4, combined with FTL crossover frequency measurements, revealed that MSH2 limits Class II crossovers. Hence, MSH2 has opposite roles in two crossover pathways. In pericentromeric regions, which are much more polymorphic than the rest of the chromosome, MSH2 inactivation was not able to increase Class II crossovers frequency in heterozygous regions. This shows MSH2-independent polymorphism impact on recombination. Finally, the overexpression of pro-crossover HEI10 caused significant increase in recombination in all tested heterozygosity variants, with a trend of heterozygous regions attracting crossovers still present. I showed, that in msh2 HEI10-OE total recombination is increased because of HEI10 promoting Class I, however no juxtaposition effect is observed. What is more, no HEI10 stimulation is detected in msh2 fancm zip4 HEI10-OE variant, proving that HEI10 has no role in Class II. To sum up, I showed pro-recombination role of MSH2 for Class I crossovers and an antagonistic, anti-recombination role for Class II crossovers. Therefore, this work demonstrates that MSH2 is a master regulator of both crossover pathways, which allows for dynamic regulation of meiotic recombination outcomes, depending on the level and distribution of sequence divergence between homologs.
- ItemModelowanie struktur przestrzennych kompleksów makromolekularnych(2023) Dobrychłop, Mateusz; Bujnicki, JanuszKompleksy makromolekularne odgrywają fundamentalną rolę w wielu procesach w komórce. Struktury niektórych kompleksów zostały rozwiązane doświadczalnie, jednak dla większości z nich dostępne dane strukturalne są niekompletne. W takich przypadkach możliwe jest zastosowanie narzędzi komputerowych, tworzących modele kompleksów w oparciu o dane pochodzące z różnych źródeł. Takie podejście, nazywane podejściem hybrydowym, wykorzystuje program PyRy3D. Za jego pomocą zbudowano modele dwóch kompleksów, opisane w niniejszej pracy. Pierwszym z nich był edytosom T. brucei - kompleks przeprowadzający proces edycji pre-mRNA u afrykańskich świdrowców. Analiza rozmieszczenia poszczególnych komponentów w modelu pozwala na zaproponowanie mechanizmu działania edytosomu, w którym obecne na powierzchni regiony nieuporządkowane odpowiedzialne są za aktywność remodelującą RNA, natomiast zgromadzone w rdzeniu układu ustrukturyzowane domeny odpowiadają za jego aktywność katalityczną. Drugim opisanym modelem jest model kompleksu karboksylazy acylo-CoA z M. tuberculosis. Kompleks ten katalizuje jedną z reakcji szlaku syntezy kwasów mikolowych u mikobakterii. Uzyskany model sugeruje strukturalne podstawy mechanizmu działania kompleksu, w którym domena BCCP białka AccA3 porusza się między kolejnymi etapami reakcji karboksylacji acylo-CoA, dzięki obecnemu w strukturze białka elastycznemu łącznikowi. Macromolecular complexes play a fundamental role in many processes in the cell. The structures of some complexes have been solved experimentally, but for most of them the available structural data is incomplete. In such cases, it is possible to use computational tools that create models of complexes based on data from different sources. Such an approach, called hybrid approach, is used by the PyRy3D software that was applied to build models of two complexes described in this work. The first was the editosome of T. brucei, a complex that carries out the pre-mRNA editing process in African trypanosomas. Analysis of the distribution of components in the model allows us to propose a mechanism of action, in which disordered regions present on the surface are responsible for RNA remodeling activity, while structured domains accumulated in the core of the system are responsible for its catalytic activity. The second model described is that of an acyl-CoA carboxylase complex from M. tuberculosis. This complex catalyzes one of the reactions of the mycolic acid synthesis pathway in mycobacteria. The resulting model suggests a structural basis for the mechanism of action of the complex, in which the BCCP domain of the AccA3 protein moves between successive steps in the acyl-CoA carboxylation reaction, thanks to a flexible linker present in the structure of the protein.