Doktoraty (WB)

Permanent URI for this collection

https://repozytorium.amu.edu.pl/handle/10593/763

Browse

Now showing 1 - 20 of 242

Zależna od FUS obróbka snoRNA do sdRNA i regulacja modyfikacji potranskrypcyjnych rybosomowego RNA - powiązania ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS)
(2023) Gawade, Kishor; Raczyńska, Katarzyna Dorota. Promotor
FUS jest białkiem wiążącym DNA/RNA, zaangażowanym w wiele etapów metabolizmu RNA. Mutacje w obrębie sygnału lokalizacji jądrowej (NLS, ang. nuclear localization signal) białka powodują błędną lokalizację FUS w cytoplazmie i w konsekwencji tworzenie agregatów cytoplazmatycznych, co jest powiązane z chorobą neurodegeneracyjną stwardnienie zanikowe boczne, ALS (ang. amyotrophic lateral sclerosis). Małe jąderkowe RNA (snoRNA) to rodzina małych niekodujących RNA, które są zaangażowane w 2'-O-metylację (2'-O-Me) i pseudourydylację rybosomowego RNA (rRNA) i małych jądrowych RNA (snRNA). Te modyfikacje epitranskryptomiczne zapewniają stabilność i zachowanie wiernej struktury rybosomów. Co ciekawe, wbrew wcześniejszemu przekonaniu, około dwie trzecie miejsc w rRNA jest zmodyfikowanych częściowo; zapewnia to dodatkowy poziom generowania heterogeniczności rybosomów.Oprócz funkcji w nadawaniu modyfikacji rRNA i U snRNA, snoRNA klasy C/D i H/ACA mogą być procesowane do mniejszych, stabilnych fragmentów, zwanych sdRNA (ang. snoRNA-derived RNAs, RNA pochodzące ze snoRNA). Cząsteczki sdRNA mogą działać jako mikroRNA i regulować ekspresję genów na poziomie transkrypcji i translacji. Co istotne, rola FUS w biogenezie mikroRNA jest znana i dobrze udokumentowana, nie ma natomiast danych na temat udziału białka FUS w regulacji ekspresji snoRNA i ich dalszej obróbce do sdRNA. W niniejszej pracy, z zastosowaniem technik wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, wykazano, że FUS reguluje poziom snoRNA w komórkach linii ludzkiej neuroblastomy SH-SY5Y. Następnie, ponieważ snoRNA biorą udział w potranskrypcyjnych modyfikacjach rRNA i snRNA, wykorzystano ilościowe techniki oparte na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS, ang. next generation sequencing) typu RiboMeth-seq i HydraPsiSeq, do mapowania zmian w poziomach 2'-O-Me i pseudourydyny, w komórkach typu dzikiego i komórkach pozbawionych białka FUS. W wielu miejscach 2’-O-Me w rybosomowych RNA, które były zmodyfikowane częściowo, obserwowano wzrost poziomu modyfikacji w komórkach pozbawionych FUS. Równocześnie podwyższonej ekspresji ulegała też grupa snoRNA klasy C/D, biorąca udział we wprowadzaniu tych modyfikacji. Ponadto, zaobserwowano drobne zmiany w poziomie pseudourydylacji w komórkach pozbawionych FUS, które również wykazywały tendencję wzrostową, podobnie jak zmiany w ekspresji odpowiedzialnych za te modyfikacje snoRNA klasy H/ACA. W kolejnych analizach, w których wykorzystano komórki SH-SY5Y niosące mutację FUS R495X związaną z ALS, prowadzącą do syntezy białka pozbawionego sygnału NLS, również obserwowano znaczące zmiany w poziomach snoRNA oraz 2’-O-Me i pseudourydyny, w porównaniu z kontrolą typu dzikiego. W badaniach wykorzystano również fibroblasty pochodzące od pacjentów z ALS z mutacjami FUS oraz, jako kontrole, fibroblasty pochodzące od dopasowanych wiekiem i płcią osób zdrowych. Zgodnie z oczekiwaniami, w fibroblastach pochodzących od osób z „silną” mutacją FUS P525L, zaobserwowano największą liczbę znacząco zmienionych miejsc 2’-O-Me, podczas gdy w fibroblastach pochodzących od osób z „łagodnymi” mutacjami FUS R521C i R521L, zmienionych miejsc było mniej. Wyniki te uzupełniono danymi dotyczącymi 2’-O-Me z izogenicznej pary indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z mutacją FUS P525L, różnicowanych następnie do neuronalnych komórek progenitorowych i neuronów ruchowych. Co ciekawe, większość miejsc ze zmienionym profilem 2’-O-Me i pseudourydylacji położona jest w zewnętrznych partiach rybosomu 80S, sugerując, że te częściowo zmodyfikowane miejsca, w zależności od poziomu ich modyfikacji, mogą wpływać na oddziaływania z białkami rybosomalnymi i z innymi czynnikami. Jak wspomniano wyżej, analiza danych pochodzących z sekwencjonowania małych cząsteczek RNA wykazała, że wiele cząsteczek snoRNA ulega zróżnicowanej ekspresji w komórkach SH-SY5Y z wyciszeniem białka FUS. Ponadto, zidentyfikowano liczną grupę sdRNA powstających ze snoRNA klasy C/D i H/ACA. Wiele sdRNA pochodzących ze snoRNA klasy C/D zawierało zakonserwowane motywy „C” lub „D”. Co więcej, z jednego snoRNA mogły powstawać różne sdRNA, wykazujące różne poziomy ekspresji. Profil sdRNA był inny w przypadku proliferujących i zróżnicowanych komórek SH-SY5Y, co sugeruje, że zewnętrzne sygnały, takie jak traktowanie kwasem retinowym, mogą również wpływać na produkcję sdRNA ze snoRNA. Wyniki te wskazują, że białko FUS wpływa na ekspresję snoRNA i modyfikację rybosomalnego RNA. Co więcej, snoRNA są procesowane do sdRNA w sposób zależny od FUS. Jednakże, funkcja tych sdRNA pozostaje wciąż niezbadana. Konieczne są dalsze badania funkcjonalne, aby określić wpływ poszczególnych miejsc modyfikacji rRNA na translację i wpływ mutacji FUS związanej z ALS na ten proces. FUS is a DNA/RNA binding protein involved in many aspects of RNA metabolism. Moreover, mutations within the nuclear localization signal (NLS) of FUS result in the mislocalization of this protein into the cytoplasm, resulting in the formation of cytoplasmic aggregates, and it is associated with amyotrophic lateral sclerosis, a neurodegenerative disease. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) are a family of small non-coding RNAs that guide site-specific 2’-O-methylation (2'-O-Me) and pseudouridylation of ribosomal RNAs (rRNAs) and small nuclear RNAs (snRNAs). These epitranscriptomic modifications provide stability and maintain the structural fidelity of the ribosomes. Additionally, contrary to the previous belief, about two-thirds of these sites on the rRNA are fractionally modified; this provides another layer of generating ribosomal heterogeneity. Not limited to only guiding rRNA and snRNA modifications, both C/D and H/ACA box types of snoRNAs can be processed into smaller, stable fragments called sdRNAs (snoRNA-derived RNAs). These sdRNAs may function as microRNAs and regulate gene expression at transcriptional and translational levels. Moreover, the role of FUS in the biogenesis of microRNAs is known and well documented, but its role in regulating snoRNA expression and processing into sdRNAs is not explored. In this work, using high-throughput sequencing, it was identified that FUS regulates snoRNAs in SH-SY5Y (neuroblastoma) cells. Since snoRNAs are involved in guiding rRNA and snRNA modifications, quantitative, next-generation sequencing (NGS)-based techniques, RiboMeth-seq and HydraPsiSeq were used to map changes in 2’-O-Me and pseudouridine levels in wild-type and FUS-depleted cells (FUS KO). Many fractionally modified 2’-O-Me sites on ribosomal RNAs showed a higher proportion of modification in FUS-depleted cells, and a subset of guide C/D box snoRNAs were also upregulated. Furthermore, pseudouridine changes in the FUS-depleted cells were subtle, but an overall increase in the modification of rRNAs was noticeable, along with changes in guide H/ACA box snoRNAs. Next, SH-SY5Y cells carrying ALS-associated FUS R495X mutation that lack an NLS also displayed significant changes in snoRNAs and 2’-O-Me and pseudouridine levels compared to wild-type control. In addition, ALS-patient-derived fibroblasts with FUS mutations and age-sex-matched controls were used to explore if 2’-O-Me changes are also observed in ALS patients with FUS mutations. As expected, fibroblasts carrying ‘strong’ FUS P525L mutation displayed the highest number of significantly changed 2’-O-Me sites, whereas ‘mild’ FUS mutations R521C and R521L displayed fewer sites. These results were complemented by 2’-O-Me data from an isogenic pair of induced pluripotent stem cells, neural progenitor cells and motor neurons carrying FUS P525L mutation. Interestingly, most of the 2’-O-Me and pseudouridine sites mapped to the outer periphery of the 80S ribosome, suggesting that depending on their modification levels, these fractionally modified sites may regulate the binding of ribosomal proteins or other factors. As mentioned above, small RNA sequencing data showed that some snoRNAs were differentially expressed in SH-SY5Y FUS KO cells and, that many sdRNAs are generated from C/D and H/ACA box snoRNAs. In the case of the C/D box snoRNAs, these sdRNAs showed conserved box C or box D motifs. Moreover, a single snoRNA produced multiple sdRNAs with varying levels of expression. The sdRNA profile was different for proliferating and differentiated SH-SY5Y cells, suggesting that external cues such as retinoic acid treatment can also influence the processing of snoRNAs into sdRNAs. These results indicate that FUS influences snoRNA expression and ribosomal RNA modification. Secondly, some snoRNAs are processed into sdRNAs in a FUS-dependent manner. However, the function of these sdRNAs remains to be explored. Functional studies are necessary to explore the effects of individual rRNA modification sites on translation and how ALS-associated FUS mutation influences this process.
Elementy sekwencji i struktury RNA rozpoznawane przez białka z domeną FinO
(2023) Basczok, Maciej; Olejniczak, Mikołaj. Promotor
O bakteryjnych białkach opiekuńczych z domeną FinO wiadomo, że często wiążą RNA za pośrednictwem Rho-niezależnego terminatora transkrypcji. Co ciekawe, ten strukturalny motyw jest również wiązany przez inne białko opiekuńcze, Hfq, jednak z danych profilowania transkryptomu wiadomo, że pule wiązanych cząsteczek RNA przez oba białka pozostają zasadniczo odrębne. W pierwszej części pracy przeanalizowano dostępne dane ligandów RNA białek ProQ i Hfq z E. coli, S. enterica i N. meningitidis. Wykazano, iż region po stronie 5' terminatora w przypadku ligandów RNA białek ProQ z enterobakterii jest wzbogacony w adenozynę, a Hfq w urydynę. Kompozycja tego regionu stanowi element mechanizmu konkurencji o ligandy RNA między białkami ProQ i Hfq u enterobakterii. Natomiast u N. meningitidis zaobserwowano, że ligandy RNA obu białek są wzbogacone w adenozynę oraz że wzbogacenie to jest cechą całego tranksryptomu. Sugeruje to, iż białka ProQ i Hfq z N. meningitidis mogą wykorzystywać inne motywy podczas konkurencji o ligandy RNA. W drugiej części pracy wykazano, że w wiązaniu do białka ProQ z N. meningitidis bierze udział dolna część spinki terminatorowej wraz sekwencjami przylegającymi do niej zarówno po stronie 5' jak i 3', których minimalna długość może się różnić w zależności od cząsteczki RNA, jednak dla silnego wiązania zawsze musi mieć co najmniej kilka nukleotydów. Bacterial RNA chaperones with a FinO domain are known to bind RNA via a Rho-independent transcription terminator. Interestingly, this structural motif is also bound by another chaperone, Hfq, but from transcriptome profiling data it is known that the pools of RNA molecules bound by the two proteins remain essentially distinct. In the first part of the work, available data on RNA ligands of ProQ and Hfq proteins from E. coli, S. enterica and N. meningitidis were analysed. It was shown that the region on the 5' side of the terminator in the case of RNA ligands of ProQ proteins from enterobacteria is enriched in adenosine, while Hfq in uridine. The composition of this region is part of the mechanism of competition for RNA ligands between ProQ and Hfq proteins in enterobacteria. However, in N. meningitidis it was observed that the RNA ligands of both proteins are enriched in adenosine in this region and that this enrichment is a feature of the entire transcriptome. This suggests that the ProQ and Hfq proteins from N. meningitidis may use different motifs when competing for RNA ligands. In the second part of the work, it was shown that the lower part of the terminator hairpin and the sequences adjacent to it both on the 5' and 3' side are involved in binding to the ProQ protein from N. meningitidis, and that the minimum length of which may vary depending on the RNA molecule.
Analiza dynamiki oddziaływań pomiędzy drzewami i konsumentami ich nasion: od globalnych wzorców do zmienności w obrębie gatunku
(2023) Celebias, Paulina; Zwolak, Rafał. Promotor; Bogdziewicz, Michał. Promotor
Interakcje między roślinami a zwierzętami zjadającymi nasiona różnią się w swoim natężeniu, od słabych do silnych, oraz we wpływie jaki mają oddziałujące na siebie organizmy, od negatywnego do pozytywnego. Aby w pełni zrozumieć te zależności, potrzebujemy zarówno globalnej syntezy licznych istniejących już wyników badań, jak i nowych eksperymentów, które pozwolą na opisanie pomijanych dotąd aspektów oddziaływań między roślinami a konsumentami nasion. Moja rozprawa doktorska ma na celu sprostanie obu tym wyzwaniom. Składa się ona z trzech części: (i) meta- analizy hipotezy wysycenia konsumentów nasion, (ii) eksperymentu badającego wpływ wielkości nasion na sposób żerowania gryzoni, (iii) eksperymentu badającego wpływ zmienności wewnątrzgatunkowej gryzoni na roznoszenie nasion. W pierwszej części mojej rozprawy przeprowadziłam meta-analizę 48 opublikowanych badań, które spełniały kryterium zawierania co najmniej 4 lat danych dotyczących produkcji nasion oraz wielkości ich konsumpcji przez zwierzęta. Hipoteza wysycenia konsumentów nasion jest jednym z powszechnie przyjętych wyjaśnień ewolucyjnych korzyści lat nasiennych. Według niej, okresowe występowanie masowego opadu nasion powstało, aby zmniejszyć proporcję nasion niszczonych przez konsumentów. W latach niskiego opadu nasion, populacja konsumentów nasion zmniejsza się w związku z niewystarczającą ilością pożywienia, natomiast w latach nasiennych konsumenci nasion zasypywani są większą ilością nasion, niż są w stanie zjeść, co sprawia, że więcej nasion przeżywa. W swoich badaniach potwierdziłam zarówno efekt zagłodzenia, jak i wysycenia drapieżników, jednak efekt wysycenia był widoczny tylko dla zwierząt bezkręgowych. Co więcej, efekt wysycenia drapieżników w ostatnich latach staje się coraz słabszy, co może mieć związek z globalnymi zmianami antropogenicznymi. W drugiej części mojej rozprawy zbadałam wpływ wielkości nasion dębu szypułkowego (Quercus robur) na ich roznoszenie przez gryzonie. Znaczna zmienność wielkości nasion w obrębie jednego osobnika związana jest z modułową budową drzew. Każdy osobnik posiada wiele kopii tego samego organu, np. nasion, które mogą wykazywać znaczącą zmienność. Wielu konsumentów nasion przejawia preferencje względem nasion o konkretnym rozmiarze, dlatego przewidywałam, że między dużymi i małymi nasionami powstają interakcje pośrednie, które mogą wpływać na przeżywalność nasion. Odkryłam, że interakcje między żołędziami o różnych rozmiarach zmieniały się z roku na rok: w pierwszym, ale nie w drugim roku badania, obecność małych żołędzi chroniła duże przed usunięciem. W trzeciej części mojej rozprawy doktorskiej zbadałam wpływ zmienności wewnątrzgatunkowej myszarki leśnej (Apodemus flavicollis) na roznoszenie nasion dębu szypułkowego (Quercus robur). Wykazałam, że zwierzęta o większej skłonności do eksplorowania nowego środowiska mają tendencję do wynoszenia nasion dalej od drzew. Jednak inne efekty indywidualnych cech myszarki leśnej znacznie różniły się między latami, co wskazuje, że ich wpływ na interakcje z roślinami zmienia się, gdy warunki ekologiczne ulegają wahaniom. Podsumowując, wyniki moich badań podkreślają znaczenie prowadzenia wieloletnich badań w celu wykrycia zależnych od kontekstu interakcji między gatunkami i długoterminowych trendów w zjawiskach ekologicznych. The relationship between plants and granivores varies in magnitude - from weak to strong – and in sign – from negative to positive. To make sense of this variation, we need global syntheses of numerous existing studies, and field studies that focus on overlooked sources of complexity in plant-granivore interactions. My thesis aimed to address both of these goals. The thesis consists of three parts: (i) a meta-analysis of the predator-satiation hypothesis, (ii) a study on the impact of variation in seed size on foraging decisions of rodents, (iii) a study on the effects of intraspecific variation in granivore traits on the patterns of seed dispersal. In the first part of my thesis, I revisited predator-satiation hypothesis in a meta-analysis based on 48 studies that gathered at least 4 years of data on seed production and seed predation. The predator-satiation hypothesis is one of the most widely known hypothesis explaining evolutionary advantages of mast seeding. It states that intermittent, abundant crops evolved to reduce seed losses by starving granivores between mast events and overwhelming them with seeds during mast years. I found evidence of both starvation between mast years and satiation during mast years. However, the effectiveness of predator satiation varied between predator types; there was evidence for satiation of invertebrates, but not vertebrates. Moreover, satiation became less effective over recent decades, probably due to global anthropogenic changes. In the second part of my thesis, I investigated the impact of acorn size on their removal and dispersal by granivores. Because trees have modular construction, copies of the same organ, such as seeds, may exhibit considerable variation. Since most granivores display preferences towards seeds of particular size, indirect interactions can arise between larger and smaller seed, which further impacts seed survival and seedling establishment. I found that interactions among different sized acorns varied from year to year: in the first, but not the second year of the study, the presence of small acorns protected large ones from removal. In the third part of my thesis, I investigated the impact of individual traits of yellow-necked mice on the dispersal of common oak acorns. I found that more explorative individuals tend to disperse seeds further from other trees. However, other effects of individual traits varied substantially among years, indicating that their impact on interactions with plants changes when ecological conditions fluctuate. Overall, my results underscore the importance of conducting multi-year studies to detect context-dependent interactions between species and long-term trends in ecological phenomena.
Nowe funkcje białka hnRNP UL1 w komórkach ludzkich
(2023) Cichocka, Marlena; Raczyńska, Katarzyna Dorota. Promotor
Białko hnRNP UL1 jest zaangażowane w proces transkrypcji, działając głównie jako negatywny regulator hamujący ekspresję określonych genów. Ponadto, białko hnRNP UL1 uczestniczy w procesie splicingu oraz w odpowiedzi komórki na uszkodzenia DNA. Dodatkowo, wyniki naszej grupy badawczej pokazały po raz pierwszy, że hnRNP UL1 przemieszcza się również do jąderek komórek ludzkich. Poznanie funkcji, jakie białko to pełni w jąderkach komórkowych, stanowiło główny temat niniejszej rozprawy doktorskiej. Ponadto, podjęłam również próbę opisania wzajemnych interakcji pomiędzy hnRNP UL1, FUS i U7 snRNP, oraz określenia roli białka hnRNP UL1 w inhibicji genów histonowych poza fazą S cyklu komórkowego, którą pełni wraz z białkiem FUS i cząstką U7 snRNP. Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów wykazałam, że białko hnRNP UL1 w jąderku komórek ludzkich stymuluje transkrypcję genów rRNA, ale nie jest zaangażowane w kolejne etapy biogenezy rybosomów. Dalsze eksperymenty z wykorzystaniem odczynników genotoksycznych CPT i ETO wskazały, że komórki z wyciszeniem białka hnRNP UL1 są wrażliwsze na uszkodzenia DNA. Ponadto, pokazałam, że hnRNP UL1 oddziałuje z białkami szlaków naprawy uszkodzeń rDNA, takimi jak γH2A.X, RPA32, XRCC1 i Chk1, potwierdzając jego udział w tych procesach. Wyniki kolejnych eksperymentów pokazały, że białko hnRNP UL1 oddziałuje z białkiem FUS najsilniej poza fazą S cyklu komórkowego. Co ciekawe, zarówno FUS jak i hnRNP UL1 silniej wiążą U7 snRNA przy braku drugiego białka, wskazując, że oba białka mogą konkurować o dostępność do U7 snRNA. Zauważyłam również, że poziom fosforylacji białka hnRNP UL1 zmienia się w fazach cyklu komórkowego, co sugeruje, że to właśnie ta modyfikacja może regulować zmiennym oddziaływaniem hnRNP UL1 z białkiem FUS; takiej roli nie ogrywają natomiast metylacje argininy. Wykazałam ponadto, że hnRNP UL1 nie pełni roli inhibitora ekspresji genów histonowych w fazie G1 i G2 cyklu komórkowego, wydaje się jednak być inhibitorem ekspresji tych genów w fazie S. The hnRNP UL1 protein is involved in transcription, acting mainly as a negative regulator that inhibits the expression of specific genes. Furthermore, hnRNP UL1 is involved in splicing and the cell response to DNA damage. In addition, the results of our research group showed for the first time that hnRNP UL1 also moves into the nucleoli of human cells. Learning more about the functions of hnRNPUL1 in cell nucleoli was the main topic of this dissertation. In addition, I also attempted to describe the interactions between hnRNP UL1, FUS, and U7 snRNP, and to determine the role of the hnRNP UL1 protein in the inhibition of histone genes outside the S phase of the cell cycle, which it performs together with the FUS protein and U7 snRNP. Based on my experiments, I showed that the hnRNP UL1 protein stimulates the transcription of rRNA genes in the nucleolus of human cells, however, it is not involved in the subsequent steps of ribosome biogenesis. Further experiments using genotoxic reagents CPT and ETO indicated that cells with silencing of the hnRNP UL1 protein are more sensitive to DNA damage. In addition, I showed that hnRNP UL1 interacts with proteins of the rDNA damage repair pathways such as γH2A.X, RPA32, XRCC1, and Chk1, confirming its involvement in these processes. The results of subsequent experiments showed that the hnRNP UL1 protein interacts with the FUS protein the highest outside the S phase of the cell cycle. Interestingly, both FUS and hnRNP UL1 bind U7 snRNA more strongly in the absence of the other protein, indicating that the two proteins can compete for accessibility to U7 snRNA. I also observed that the phosphorylation level of the hnRNP UL1 protein changes during phases of the cell cycle, suggesting that this modification may regulate the variable interaction of hnRNP UL1 with the FUS protein; such a role is not played by arginine methylations. I further demonstrated that hnRNP UL1 does not play a role as an inhibitor of histone gene expression in the G1 and G2 phases of the cell cycle but appears to be an inhibitor of the expression of these genes in the S phase.
Określenie wpływu nieprawidłowości splicingu mRNA czynnika transkrypcyjnego NFIX na patomechanizm dystrofii miotonicznej oraz opracowanie narzędzia terapii genowej dla tej choroby
(2023) Rogalska, Zuzanna; Sobczak, Krzysztof. Promotor
Dystrofia miotoniczna typu 1 (DM1) jest dziedziczną, dominującą chorobą genetyczną, spowodowaną ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń CTG w genie DMPK. Nadmiernie wydłużone powtórzenia CUG (CUGexp) w zmutowanym mRNA są toksycznym produktem zmutowanego genu. Zmutowany mRNA sekwestruje czynniki splicingowe takie jak MBNL, a następnie w wyniku funkcjonalnego niedoboru tych białek wywołuje globalne zmiany w alternatywnym splicingu w mięśniach szkieletowych, sercu i mózgu, czego efektem są objawy charakterystyczne dla DM1. Nieprawidłowości w alternatywnym splicingu są kluczową molekularną przyczyną rozwoju DM1. Profil alternatywny splicingu wielu genów zaangażowanych w homeostazę mięśni i ich prawidłowe funkcjonowanie jest istotnie zaburzony. Niemniej jednak, molekularne konsekwencje zaburzeń alternatywnego splicingu większości genów są nadal nieznane. Jednym z eksonów zależnych od MBNL, którego efektywność włączenia do mRNA w procesie splicingu jest istotnie podwyższona w mięśniach szkieletowych DM, jest ekson 7 NFIX, genu kodującego czynnik transkrypcyjny niezbędny do prawidłowego rozwoju mięśni. Pierwszym celem niniejszej pracy było lepsze zrozumienie patomechanizmu DM w kontekście zaburzeń splicingowych NFIX poprzez zrozumienie wpływu włączenia eksonu 7 na aktywność transkrypcyjną NFIX. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zastosowano dwa alternatywne podejścia. Pierwszym z nich było stworzenie dwóch stabilnych linii komórkowych z indukowalną nadekspresją izoform NFIX z eksonem 7 i bez eksonu 7 (NFIX+7 lub NFIX-7) w oparciu o komórki HEK z funkcjonalnym nokautem endogennego NFIX (NFIX-KO). Nieoczekiwanie wyniki RNA-seq nie wykazały znaczących różnic w aktywności transkrypcyjnej tych dwóch izoform w stworzonych modelach komórkowych, być może z powodu niewłaściwego dopasowania poziomu ekspresji egzogenów (zbyt wysoki). Drugie podejście opierało się na manipulacji włączania egsonu 7 do endogennie eksprymowanego mRNA NFIX przy użyciu antysensownego oligonukleotydu (AON) nakierowanego na połączenie eksonu 7 z intronem 7. W ludzkich komórkach mięśni szkieletowych, w których dominuje izoforma NFIX+7, zastosowany AON indukował efektywne pomijanie eksonu 7 i produkcję głównie izoformy NFIX-7. Takie podejście umożliwiło wygenerowanie modelu komórkowego w kontekście środowiska, w którym NFIX jest naturalnie zaangażowany w proces prawidłowego rozwoju mięśni, ale także w patogenezę DM1. W tych komórkach ekspresja NFIX jest stosunkowo wysoka i jest regulowana przez natywny promotor. Wyniki eksperymentów RNA-seq ujawniły setki genów, których ekspresja uległa istotnym zmianom po traktowaniu AON, co sugeruje, że obie izoformy splicingowe - NFIX+7 i NFIX-7 - różnią się znacząco aktywnością transkrypcyjną. Analiza ontologii genów (GO) wykazała znaczne wzbogacenie klas genów, które są wrażliwe na te dwie izoformy NFIX, ale także zaobserwowano istotną zmianę ich ekspresji w mięśniach pacjentów z DM1. Wśród 5641 genów, których ekspresja jest znacząco zmieniona w tkankach DM1 (P<0,05) zidentyfikowano 2070 genów, których ekspresja była znacząco zmieniona w komórkach mięśniowych poddanych działaniu AON zmieniającemu splicing NFIX. Głównymi terminami GO wzbogaconymi w obu porównaniach (w pierwszym – geny wrażliwe na poziom NFIX oraz na obecność jego izoform splicingowych, w drugim – geny wrażliwe na izoformy splicingowe NFIX oraz zmienione w tkankach pacjentów DM1) były geny składników strukturalnych macierzy zewnątrzkomórkowej i geny białek wiążących się z kolagenami. Są to geny niezmiernie istotne dla prawidłowej budowy i aktywności mięśni szkieletowych, a zatem zaburzenie splicingu NFIX może stanowić istotny element patogenezy DM1. Podsumowując tę część pracy można stwierdzić, że nieprawidłowa dystrybucja eksonu 7 NFIX spowodowana sekwestracją białek MBNL na RNA ze zmutowanym CUGexp wywołuje liczne zmiany ekspresji genów zachodzących w mięśniach szkieletowych, które to mogą być odpowiedzialne za kształtowanie fenotypu chorobowego obserwowanego u pacjentów z DM1. DM jest chorobą nieuleczalną. Kiedy liczba powtórzeń osiąga wysoki poziom (od setek do tysięcy), występujące objawy kliniczne są cięższe oraz wzrasta wydajność sekwestracji zależnej od długości powtórzeń. Proponowane wcześniej strategie terapeutyczne prowadzące do podwyższenia poziomu MBNL1 za pomocą narzędzi terapii genowej wiążą się z występowaniem wielu niepożądanych konsekwencji. Długotrwała, niekontrolowana nadekspresja MBNL1 u myszy prowadzi bowiem do zmniejszenia masy ciała, zwiększonej śmiertelności i uszkodzenia mięśni, w tym mięśnia sercowego. Terapia genowa prowadząca do podwyższenia poziomu MBNL1 u pacjentów z DM1 wiąże się również z wieloma innymi ograniczeniami. Jednym z nich jest niejednorodność sekwestracji MBNL spowodowana mozaicyzmem somatycznym długości powtórzeń CTG w komórkach tego samego pacjenta oraz pomiędzy różnymi osobami ze zdiagnozowanym DM1. Aby sprostać tym ograniczeniom, zaprojektowałam i wygenerowałam autoregulowany konstrukt do nadekspresji MBNL1, który umożliwia produkcję białka MBNL1 dostosowaną do poziomu aktywnej puli endogennych białek MBNL w komórce. Ta strategia terapeutyczna daje więc możliwość przezwyciężenia ograniczeń wynikających z niejednorodności ekspansji powtórzeń CTG i w konsekwencji różnego stopnia niedoboru MBNL w różnych komórkach czy włóknach mięśniowych. Konstrukt ten zawiera sekwencję kodującą MBNL1 przedzieloną fragmentem pre-mRNA ATP2A1 z alternatywnym eksonem wrażliwym na poziom MBNL, który zawiera kodon stop w ramce odczytu dla MBNL1. Włączenie tego eksonu prowadzi więc do tworzenia nieaktywnej, skróconej formy białka, natomiast jego wyłączenie, następujące przy niedoborze MBNL, powoduje wzrost produkcji w pełni aktywnej formy MBNL1. Takie podejście umożliwia ograniczoną i ściśle kontrolowaną nadekspresję MBNL1, w zależności od stopnia niedoboru białka, a zarazem może odpowiadać na niejednorodność długości powtórzeń CUG. Podsumowując tę część pracy można powiedzieć, że przeprowadzone badania wykazały, że nadekspresja MBNL1 ze stworzonego konstruktu genetycznego podlega autoregulacji i ma potencjał terapeutyczny prowadzący do korygowania nieprawidłowości alternatywnego splicingu, co wykazano dla komórek pochodzących od pacjentów z DM1. Myotonic dystrophy type 1 is a hereditary, autosomal disease caused by expansion of trinucleotide CTG repeats in DMPK gene. Expanded CUG repeats in mutant mRNA is a major toxic product of mutant gene. It sequester MBNL splicing factors and due to functional insufficiency of these proteins trigger global changes in alternative splicing in skeletal muscles, heart and brain, which result in symptoms characteristic for DM1. The abnormalities in alternative splicing are crucial molecular feature of DM1. The alternative splicing of many genes engaged in muscle homeostasis and proper functioning is impaired. Although, the molecular consequence of majority of genes with altered splicing pattern is still unknown. One of the MBNL-dependent exons, which inclusion is significantly higher in skeletal muscles of DM, is exon 7 of NFIX, a gene encoding for transcription factor essential for muscle development. First aim of this study was to better understand the pathomechanism of DM in case of abnormalities in the splicing of NFIX. The examination of whether the contribution of exon 7 has an impact on NFIX transcriptional activity gave a deeper understanding of DM1 pathomechanism which is studied for a long time. To answer this question two alternative approaches were used. First of them was generation of two stable cell lines with inducible overexpression of NFIX isoforms with and without exon 7 (NFIX+7 or NFIX-7) based on a HEK cell with functional knockout of endogenous NFIX (NFIX-KO). Unexpectedly, RNA- seq results did not show significant differences in transcriptional activity of these two isoforms in developed cellular models, perhaps due to not well adjusted level of overexpression of exogenes (too high). The second approach based on manipulation of exon 7 inclusion of endogenous NFIX mRNA using the antisense oligonucleotide (AON) targeting (AON) targeting exon 7/intron 7 boundary. In human skeletal muscle cells, in which NFIX+7 isoform predominates, this AON induces efficient exon 7 skipping and production of NFIX-7 isoform. This approach gave the possibility to generate a model with an cellular environment where NFIX is engaged in the developmental process, but also in DM1 pathogenesis. The expression level of NFIX is relatively high in these cells and is driven by the native promoter. The results of RNA-seq revealed hundreds of genes which expression was significantly changed after AON treatment, suggesting that both splicing isoforms, NFIX+7 and NFIX-7, differ significantly in transcriptional activity. Gene ontology (GO) analysis showed significant enrichment of groups of genes that are sensitive to NFIX isoforms and abnormally expressed in DM1 patients. Among 5641 genes which expression is affected in DM1 (P<0.05), 2070 genes were identified which are also sensitive to treatment with AON modulating splicing pattern of NFIX. The major GO molecular function terms enriched in both comparisons (first: genes sensitive to the level of NFIX and its splicing isoforms; second: genes sensitive to the NFIX splicing isoforms and changed in DM1 tissues) were extracellular matrix structural constituent, and collagen binding. These functions are incredibly important for the proper structure and activity of skeletal muscle, therefore NFIX splicing abnormality may be essential trigger of DM1 pathogenesis. Taken together, these results showed that abnormal distribution of NFIX exon 7 caused by sequestration of MBNL proteins on CUGexp affects a subset of gene expression changes occurring in DM1 skeletal muscles, which may be responsible for the development of disease phenotype observed in DM1 patients. DM is an incurable disease. When the number of repeats reach a higher level clinical symptoms are more severe and the sequestration efficiency, which depends on the size expansion, increase. Previously proposed therapeutic strategies leading to increase of the MBNL1 level via gene therapy tools are associated with many undesirable consequences. Uncontrolled MBNL1 overexpression in mice leads to reduced body weight, increased mortality, or muscle damage, including heart muscle. The gene therapy leading to the increase of MBNL1 level is also associated with many limitations. One of them is heterogeneity in sequestration of MBNLs caused by somatic mosaicism of CTG repeat length in cells of the same patient and between individuals with DM1. To deal with these limitations I designed and generated the autoregulated MBNL1 overexpression construct which enables the production of MBNL1 adjusted to the level of active pool of endogenous MBNLs. It was assumed that this therapeutic strategy gave the possibility to overcome the limitations caused by heterogeneity of CTG repeat expansions and as a consequence different levels of MBNL insufficiency in different cells/myofibers. This construct contains MBNL1-coding sequence separated by the fragment of ATP2A1 pre-mRNA with MBNL-sensitive alternative exon containing in frame stop codon. The inclusion of this exon leads to the arrangement of the inactive form of the protein but its exclusion, occurring during MBNL insufficiency, gives rise in production of fully active MBNL1. This approach enables the restricted expression of MBNL1 protein only if its level in cell is too low and potentially can be controlled by heterogeneity of CUGexp load. It was shown that expression of MBNL1 assembled from this construct is tunable and has therapeutic potential to correct the alternative splicing abnormalities in DM1 patients-derived cells.
Rola elementów regulatorowych cis w zmutowanym mRNA FMR1 zawierającym ekspansję powtórzeń CGG w tworzeniu struktur typu R-loop i regulacji niekanonicznej translacji patogennego białka
(2023) Niewiadomska, Daria; Sobczak, Krzysztof. Promotor
Ekspansja niestabilnych powtórzeń CGG w regionie 5’ niepodlegającym translacji (5’UTR) genu FMR1 w zależności od wielkości ekspansji została powiązana z patogenezą wielu chorób związanych z łamliwym chromosomem X. Celem pierwszej części projektu było ustalenie roli struktur typu R-loop w procesie patogenezy chorób – FXTAS i FXS. Wyniki uzyskane w tej części pracy potwierdziły, że struktury R-loop tworzone w obrębie regionu 5’UTR genu FMR1 w warunkach FXTAS mają negatywny wpływ na transkrypcję FMR1, co może być częściowo osłabione poprzez zastosowanie ASO-CCG. Jednakże w odniesieniu do warunków FXS, zastosowanie ASO-CCG nie prowadziło do reaktywacji transkrypcji FMR1 w komórkach wyprowadzonych od pacjenta FXS, które charakteryzowały się całkowitym wyciszeniem FMR1. Natomiast traktowanie cząsteczkami ASO-CCG komórek pacjenta z FXS, które posiadały częściowo aktywne locus FMR1, prowadziło do wzmożenia transkrypcji FMR1 oraz zwiększenia puli mRNA FMR1 w cytoplazmie, co jednak nie spowodowało zwiększenia poziomu białka FMRP w tych komórkach. Druga część projektu dotyczyła roli elementów regulatorowych cis zlokalizowanych w regionie 5’UTR FMR1 w regulacji translacji toksycznego białka FMRpolyG inicjowanej z kodonów ACG lub GUG. Uzyskane wyniki wykazały, że zarówno kontekst sekwencyjny, jak i stabilna struktura drugorzędowa tworzona w obrębie mRNA FMR1 mają ogromny wpływ na inicjację translacji białka FMRpolyG, co sugeruje, że proces ten może być również regulowany przez wiele czynników trans wiążących się z regionami cis w obrębie sekwencji mRNA FMR1. The expansion of an unstable CGG repeat sequence within the 5’ untranslated region (5’UTR) ofFMR1 has been implicated in the pathogenesis of multiple fragile X-linked syndromes. The first part of the project aimed to establish the role of R-loops in the pathogenesis of FXTAS and FXS disorders. Results obtained in this part confirmed that R-loops forming within FMR1 5’UTR in FXTAS conditions have a negative effect on the FMR1 transcription which can be partially abolished by ASO-CCG. However, according to FXS, ASO-CCG treatment did not reactivate the FMR1 transcription from FXS cells which were characterized by full FMR1 silencing. On the contrary, ASO-CCG treatment of FXS cells which possessed partially active FMR1 locus resulted in the increased transcription rate of FMR1 and its enhanced mRNA pool in the cytoplasm. Nevertheless, elevated FMR1 mRNA level did not translate into increased FMRP level. The second part of the project was concerning the cis-regulatory elements within FMR1 5’UTR and their involvement in the regulation of initiation of toxic FMRpolyG synthesis from near-cognate ACG or GUG start codons. Obtained data showed that both sequence context as well as stable secondary structure within mRNA have enormous effect on the initiation of FMRpolyG translation suggesting that this process is potentially regulated by many cis- and trans-factors targeting various regions/elements within the FMR1 mRNA sequence.
Efektywność transferu wertykalnego grzybów endofitycznych
(2023) Węgrzyn, Ewa; Lembicz, Marlena. Promotor
Transfer wertykalny to mechanizm, który zapewnia rozprzestrzenianie się endofitów grzybowych. Przez długi czas w badaniach zakładano, że wszystkie nasiona zarażonych roślin zawierają w swoim wnętrzu strzępki endofitów. Okazało się, że tak nie jest. Dotąd nie wiadomo jednak: czy jest to proces uniwersalny, czy występuje u roślin dziko rosnących oraz jakie czynniki wpływają na efektywność transferu wertykalnego. Testowano trzy hipotezy. Hipoteza pierwsza - efektywność transferu wertykalnego jest istotnie większa w przypadku nasion pochodzących z roślin występujących na siedlisku antropogenicznym. Hipoteza druga - w trakcie przemieszczania się mykobiomu na drodze roślina dojrzała – nasiona – siewki transfer wertykalny jest mniej efektywny. Hipoteza trzecia - gradient wysokości istotnie wpływa na skład grzybów endofitycznych wraz z wysokością. Przeprowadzono detekcję oraz identyfikację molekularną grzybów endofitycznych w nasionach/siewkach/liściach badanych roślin. Do identyfikacji molekularnej użyto starterów ITS1F oraz ITS4. Stwierdzono, że efektywność transferu wertykalnego grzybów endofitycznych jest niedoskonała i istotnie zależna od rodzaju siedliska i stadium życiowego rośliny. Nie stwierdzono natomiast istotnego wpływu gradientu wysokości n.p.m na efektywność transferu wertykalnego. Vertical transfer is a mechanism, which allows for the dispersal of fungal endophytes. For a long time many research studies assumed that all the seeds of the infected plants contain the endophyte hyphae inside. This turned out not to be the case. However, it is not yet known: whether it is a universal process, whether it can be found in the wild plants, and what factors can impact the effectiveness of the vertical transfer. Three hypotheses were tested. The first hypothesis - the effectiveness of the vertical transfer is significantly greater in the case of the seeds from the plants found in the anthropogenic habitat. The second hypothesis - during the travel of the mycobiome along the path: mature plant - seeds - seedlings, the vertical transfer is less effective. The third hypothesis - with altitude, the height gradient substantially affects the composition of the endophytic fungi. A detection and molecular identification of the endophytic fungi within the seeds/seedlings/leaves of the studied plants was carried out. The primers ITS1F and ITS4 were used for the molecular identification. It was found that the efficiency of the vertical transfer of the endophytic fungi is imperfect and depends significantly on the type of the habitat and the life stage of the plant. However, there was no significant effect of the height gradient on the effectiveness of the vertical transfer.
Identyfikacja nowego i regulowanego przez ABA miRNA oraz charakterystyka jego genu docelowego - AtBRO1 w procesach wzrostu i w odpowiedzi na stres abiotyczny u Arabidopsis thaliana
(2023) Syed, Muhammad Muntazir Mehdi; Ludwików, Agnieszka. Promotor
Wiele czynników środowiskowych, takich jak podwyższona temperatura, zasolenie i susza, mają wpływ na wzrost i produktywność upraw. Kluczowym szlakiem sygnałowym uczestniczącym w regulacji odpowiedzi roślin na stres jest rdzeniowa sygnalizacja kwasu absysynowego (ABA). ABA kontroluje reakcje roślin poprzez regulację ekspresji genów, także z udziałem ścieżek zależnych od miRNA. miRNA biorą udział w różnych procesach biologicznych, w tym w reakcjach adaptacyjnych na stres abiotyczny. Celem mojej pracy doktorskiej była identyfikacja nowych miRNA zaangażowanych w regulację ekspresji genów w odpowiedzi na ABA. Aby zrealizować postawiony cel badania prowadzono z zastosowaniem rośliny modelowej Arabidopsis thalina formy dzikiej (WT) oraz mutantów szlaku sygnałowego ABA: abi1td, mkkk17 i mkkk18. Analizy z wykorzystaniem RNAseq umożliwiły identyfikację 10 nowych miRNA w odpowiedzi na ABA (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) u formy dzikiej A.thaliana oraz 1 nowy miRNA u mutanta mkkk17. Ponadto, analiza wyników ujawniła, że trzy, siedem i dziewięć znanych miRNA ulegało różnej ekspresji w odpowiedzi na ABA u mutantów abi1td, mkkk17 i mkkk18. Wyniki sekwencjonowania zostały potwierdzone za pomocą ilościowego RT-PCR we wszystkich badanych genotypach. By zidentyfikować geny docelowe i potencjalne miejsca cięcia dla nowozidentyfikowanych miRNA wykorzystano psRNA Target oraz 5′ RLM-RACE. Analiza ontologii wykazała, że potencjalne geny docelowe znanych i nowych miRNA reagujących na ABA są zaangażowane w różne procesy komórkowe w roślinach, w tym rozwój i ruchy aparatów szparkowych. Wyniki te sugerują, że wiele zidentyfikowanych miRNA odgrywa ważną rolę w odpowiedziach roślin na stres środowiskowy i może pełnić wspólne funkcje regulacyjne w szlaku sygnałowym ABA. W kolejnym etapie badania koncentrowały się na charakterystyce nieznanego białka BRO1, zawierającego domenę podobną do BRO (AT1G73390), które jest celem jednego z nowo zidentyfikowanych miRNA, ath-miRn-1. W toku analiz wykazano, że w odpowiedzi na zasolenie, ABA i mannitol transkrypt BRO1 ulegał indukcji. Transgeniczne linie A.thaliana z nadekspresją BRO1 wykazywały silną tolerancję na suszę i stres solny wskazując, że BRO1 reguluje reakcje odpornościowe u roślin. Promotor AtBRO1 w fuzji z GUS wykazywał ekspresję głównie w liściach rozety i kwiatach, zwłaszcza w pylnikach. Analiza lokalizacji subkomórkowej BRO1::GFP wykazała, że białko to lokalizuje się przy błonie cytoplazmatycznej protoplastu. Wyniki analizy transkyptomicznej mutanta typu nokaut w genie BRO1, bro1-1, w odniesieniu do linii dzikiej Arabidopsis, wykazały zmiany w ekspresji wielu genów, o których wiadomo, że są zaangażowane w odpowiedź roślin na stres. Podsumowując, stwierdzono, że BRO1 może odgrywać ważną rolę w regulacji odpowiedzi transkrypcyjnej na ABA i indukcji odpowiedzi roślin na stres abiotyczny. Podsumowując, wyniki badań przedstawione w prezentowanej rozprawie, umożliwiły poznanie nowych mechanizmów regulujących odpowiedź roślin na stres abiotyczny i powiązanych z sygnalizacją ABA. Najważniejszym wynikiem pracy jest identyfikacja aż 11 nieznanych miRNA i głębsza charakterystyka funkcjonowania jednego ze z nich - ath-miRn-1 – w powiązaniu z identyfikacją nowego efektora w reakcji roślin na stres i nieznanego dotąd BRO1. Wyniki uzyskane w ramach pracy rzucają światło na mechanizmy leżące u podstaw tolerancji na stres. Many environmental factors, such as increased temperature, salinity and drought, affect the growth and productivity of crops. A key signaling pathway involved in regulating plant responses to stress is the absisic acid (ABA) signaling pathway. ABA controls plant responses through the regulation of gene expression, also through miRNA dependent pathways. miRNAs are involved in various biological processes, including adaptive responses to abiotic stress. The aim of my PhD thesis was the identification of novel miRNAs which are involved in the regulation of gene expression in response to ABA. In order to achieve this goal, the study was carried out using the model plant Arabidopsis thaliana wild type (WT) and mutants of the ABA signalling pathway: abi1td, mkkk17 and mkkk18. The RNAseq analyses identified 10 new miRNAs in response to ABA in the wild type A. thaliana (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) and 1 new miRNA in the mkkk17 mutant. In addition, analysis of the results showed that three, seven and nine known miRNAs were differentially expressed in response to ABA in the abi1td, mkkk17 and mkkk18 mutants, respectively. In all genotypes tested, the sequencing results were confirmed by quantitative RT-PCR. To identify target genes and potential cleavage sites for newly identified miRNAs, psRNA-Target and 5′ RLM RACE were used. Ontology analysis revealed that the potential target genes of known and novel ABA-responsive miRNAs are involved in various cellular processes in plants, including stomatal development and movement. These results suggest that many of the identified miRNAs play important roles in plant responses to environmental stress. They may have common regulatory functions in the ABA signalling pathway. In the next step, they focused on characterising of the unknown BRO-like domain-containing protein AtBRO1 (AT1G73390) which is targeted by one of the newly identified miRNAs, ath-miRn-1. Analyses showed that BRO1 is induced in response to salinity, ABA and mannitol. Transgenic Arabidopsis lines overexpressing BRO1 showed strong tolerance to drought and salt stress, suggesting that BRO1 regulates stress responses in plants. The BRO1 promoter fused to GUS was expressed mainly in rosette leaves and flowers, especially in anthers. Analysis of the subcellular localisation of BRO1::GFP showed that this protein was localised to the cytoplasmic membrane of the protoplast. The results of the transcriptomic analysis of the knockout mutant in the BRO1 gene, bro1-1, compared to the wild Arabidopsis line showed changes in the expression of many genes known to be involved in plant stress responses. It was concluded that BRO1 may play an important role in regulating the transcriptional response to ABA and in inducing plant responses to abiotic stress. In conclusion, the results presented have allowed the identification of new mechanisms regulating the response of plants to abiotic stress and related to ABA signalling. The most important result is the identification of 11 unknown miRNAs and a deeper characterisation of the function of one of them - ath-miRn-1 - in connection with the identification of a new effector in the plant response to stress - the previously unknown BRO1. The results of this work will shed light on the mechanisms underlying stress tolerance in plants.
Ścieżki transportu ligandów w białkach
(2023) Borja, Carlos Eduardo Sequeiros; Brezovsky, Jan. Promotor
Analiza tuneli białkowych ewoluowała od wizualnej identyfikacji w strukturach statycznych do wykorzystania symulacji dynamiki molekularnej, co prowadzi do obfitości danych. Stanowi to jednak wyzwanie ze względu na ograniczenia zasobów i czasu. W ramach moich badań doktoranckich opracowałem narzędzia i metodologie, aby rozwiązać te problemy. Pierwsza publikacja oferuje zintegrowane podejście do analizy geometrii tunelu i transportu ligandów, zapewniając powtarzalność i niesubiektywne wyniki. Druga publikacja umożliwia szybką i opłacalną analizę tuneli w dużych zbiorach danych, eliminując potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu. Ponadto odkrywa wcześniej przeoczone wąskie tunele przy użyciu mniejszej sondy. W sekcji praktycznych zastosowań, trzecia publikacja bada selektywny transport transportera ABCG46, demonstrując, w jaki sposób modyfikacje tuneli wpływają na translokację ligandów. Czwarty artykuł bada transport wody w enzymach hydrolazowych, ujawniając znaczenie wąskich tuneli, które mogą pomieścić cząsteczki wody mniejsze niż ich promień wąskiego gardła. Protein tunnel analysis has evolved from visual identification in static structures to using molecular dynamics simulations, leading to an abundance of data. However, this poses challenges due to resource and time constraints. In my doctoral research, I developed tools and methodologies to address these issues. The first publication offers an integrative approach for tunnel geometry and ligand transport analysis, ensuring reproducibility and non-subjective results. The second publication enables fast and cost-effective analysis of tunnels in large datasets, eliminating the need for specialized hardware. Additionally, it uncovers previously overlooked narrow tunnels using a smaller probe. In the practical applications section, the third publication investigates the selective transport of the ABCG46 transporter, demonstrating how tunnel modifications impact ligand translocation. The fourth paper explores water transport in hydrolase enzymes, revealing the significance of narrow tunnels that can accommodate water molecules smaller than their bottleneck radii.
Modelowanie molekularne zależności struktura-dynamika-funkcja w białkach
(2023) Surpeta, Bartłomiej; Brezovsky, Jan. Promotor
Ciągły postęp w nauce, metodach obliczeniowych i technologii umożliwia coraz lepsze badanie białek. Na przestrzeni dziesięcioleci stało się jasne, że białka są dynamicznymi jednostkami i aby dokładnie zbadać ich funkcję, nie wystarczy spojrzeć tylko na strukturę, ale także na nieodłączny składnik dynamiczny. W moich badaniach doktoranckich skupiłem się na wygaszaniu kworum, które pozwala na zakłócenie komunikacji bakteryjnej, zmniejszając w ten sposób czynniki wirulencji. Można to osiągnąć enzymatycznie, a zatem takie enzymy były głównym przedmiotem mojej rozprawy doktorskiej. Praca składa się z czterech artykułów. W pierwszym zbadałem szczegóły dynamicznych składników, które determinują i ograniczają aktywność wygaszania kworum w N-końcowych hydrolazach serynowych. Drugi to przegląd literatury podsumowujący podejścia w inżynierii białek, które uwzględniają dynamikę jako kluczową podczas procesu projektowania. Trzecia część przedstawia bibliotekę TransportTools, oprogramowanie opracowane w naszym laboratorium w celu sprostania wyzwaniu spójnej analizy przestrzeni wewnętrznych w danych zespołu białek pochodzących z masowych symulacji dynamiki molekularnej. Ostatnia część rozprawy obejmuje racjonalne projektowanie wariantów acylazy penicyliny G E. coli o ulepszonej aktywności i modulowanej specyficzności wobec cząsteczek sygnałowych różnych patogennych gatunków bakterii. Ongoing advances in science, computational methods, and technology make it possible to study proteins better and better. Over the decades, it has become clear that proteins are dynamic entities, and to accurately study their function, it is not enough to look only at the structure, but also at the inherent dynamic component. In my Ph.D. research, I focused on quorum quenching, which allows the disruption of bacterial communication, thereby reducing virulence factors. It can be achieved enzymatically, and thus such enzymes were the main interest of my dissertation. The thesis consists of four articles. In the first, I investigated details of the dynamic components that determine and limit the quorum quenching activity in N-terminal serine hydrolases. The second is a literature review summarizing approaches in protein engineering that consider dynamics as crucial during the design process. The third part presents the TransportTools library, software developed in our laboratory to address the challenge of consistent analysis of internal spaces in protein ensemble data resulting from massive molecular dynamics simulations. The last part of the thesis covers the rational design of E. coli penicillin G acylase variants with improved activities and modulated specificities towards signaling molecules of different pathogenic bacterial species.
Kontrola crossing-over poprzez białko MSH2 wykrywające nieprawidłowo dopasowane pary zasad DNA w odpowiedzi na wzór chromosomowej heterozygotyczności u Arabidopsis thaliana
(2023) Dłużewska, Julia; Ziółkowski, Piotr. Promotor
Podczas mejozy chromosomy homologiczne łączą się w pary i wzajemnie wymieniają materiałem genetycznym w procesie zwanym crossing-over lub rekombinacją mejotyczną. Crossing-over jest ważne dla generowania nowych kombinacji alleli, a co najmniej jedno crossing-over na biwalent jest niezbędne do zapewnienia właściwej segregacji chromosomów w mejozie. Co więcej, rozmieszczenie zdarzeń crossing-over nie jest przypadkowe, a ich liczba jest limitowana – na jedną parę chromosomów podczas mejozy przypada tylko około 2-3 crossing-over, niezależnie od fizycznej wielkości genomu. Jednym z czynników wpływających na rozmieszczenie rekombinacji jest polimorfizm pomiędzy chromosomami homologicznymi. Obecność regionu heterozygotycznego obok regionu homozygotycznego na tym samym chromosomie powoduje redystrybucję crossing-over do regionu polimorficznego. Pokazałam, że ów efekt zestawienia heterozygotyczności in cis (ang. heterozygosity juxtaposition effect), zależy od aktywności białka MSH2, kluczowego elementu systemu naprawy nieprawidłowo sparowanych zasad DNA. Moje wyniki wykazują stymulującą rolę MSH2 w tworzeniu crossing-over klasy I. Dzięki całogenomowej analizie crossing-over w mieszańcach z mutacją msh2 wykazałam, że rekombinacja jest redystrybuowana z wysoce polimorficznych regionów okołocentromerowych do mniej polimorficznych regionów przytelomerowych. Interferencja genetyczna nie uległa zmianie w mutancie msh2 w liniach wsobnych i mieszańcowych. Korzystając z panelu linii Arabidopsis thaliana znakowanych fluorescencyjnie (ang. fluorescent-tagged line, FTL) wykazałam, że wzór rekombinacji jest w znacznej mierze podobny między liniami wsobnymi i mieszańcami, jednak obecność regionu heterozygotycznego na w innym wypadku homozygotycznym chromosomie przekierowuje zdarzenia crossing-over do regionu heterozygotycznego. Wzrost rekombinacji obserwuje się głównie w pobliżu granicy pomiędzy regionem heterozygotycznym i homozygotycznym, podczas gdy spadek zdarzeń crossing-over w części homozygotycznej obejmuje cały ten region. Protokół opisujący wykorzystanie FTL w pomiarach częstotliwości rekombinacji również stanowi część mojej rozprawy doktorskiej. Zdarzenia crossing-over klasy II są wrażliwe na obecność polimorfizmu i z tego powodu nie są wydajnie formowane w regionach heterozygotycznych. W mieszańcach, w których aktywna jest wyłącznie klasa II (podwójny mutant fancm zip4) przyczyną obniżonej płodności jest niedobór crossing-over. Poprzez dodatkową inaktywację MSH2 zwiększyłam płodność roślin. Co więcej, moje całogenomowe analizy crossing-over w tle różnych mutantów, w tym w msh2 fancm i msh2 recq4, w połączeniu z pomiarami częstości rekombinacji przy użyciu FTL ujawniły, że MSH2 ogranicza zachodzenie crossing-over klasy II. MSH2 wykazuje więc przeciwstawne działanie w dwóch szlakach crossing-over. W regionach około-centromerowych, które są znacznie bardziej polimorficzne niż reszta chromosomu, inaktywacja MSH2 nie spowodowała zwiększenia częstości crossing-over klasy II w regionach heterozygotycznych. To pokazuje, że polimorfizm może mieć również niezależny od MSH2 wpływ na rekombinację. Ponadto, nadekspresja pro-rekombinacyjnego czynnika HEI10 spowodowała znaczny wzrost rekombinacji we wszystkich testowanych wariantach heterozygotyczności, z wciąż obecną tendencją regionów heterozygotycznych do stymulowania zdarzeń crossing-over. Wykazałam, że w msh2 HEI10-OE rekombinacja jest zwiększona globalnie z powodu promowania klasy I przez HEI10, jednak nie obserwuje się efektu zestawienia heterozygotyczności in cis. Co więcej, w wariancie msh2 fancm zip4 HEI10-OE nie wykryto stymulowania crossing-over przez HEI10, co dowodzi, że HEI10 nie odgrywa żadnej roli w klasie II. Podsumowując, wykazałam pro-rekombinacyjną rolę MSH2 dla crossing-over klasy I oraz antagonistyczną, anty-rekombinacyjną rolę dla crossing-over klasy II. Moja praca pokazuje, że MSH2 jest głównym regulatorem dla obu szlaków crossing-over, co pozwala na dynamiczną regulację rekombinacji mejotycznej, w zależności od poziomu i rozkładu heterozygotyczności pomiędzy chromosomami homologicznymi. During meiosis, homologous chromosomes pair and reciprocally exchange genetic material in a process called crossover or meiotic recombination. Crossover is important for generating new allele combinations and at least one crossover per bivalent is necessary to ensure proper chromosome segregation in meiosis. Moreover, crossover placement is not random and its numbers are limited – there are only about 2-3 crossovers per chromosome pair per meiosis, regardless of the physical size of the genome. One of the factors influencing recombination pattern is interhomolog polymorphism. The presence of heterozygous region juxtaposed to homozygous region on the same chromosome, causes a redistribution of crossovers into the polymorphic region. I showed that this heterozygosity juxtaposition effect depends on the activity of MSH2 protein, key element of mismatch repair system. My results demonstrate MSH2 stimulating role in the formation of Class I crossovers. With genome-wide crossover mapping in msh2 hybrids, I was able to show that recombination is redistributed from highly polymorphic pericentromeres into less polymorphic subtelomeric regions. Genetic interference was not changed in msh2 inbred and hybrid lines. By using a panel of Arabidopsis thaliana fluorescence-tagged lines (FTLs), I showed that recombination landscape is mostly similar between inbred and hybrid lines, however the presence of heterozygous region on an otherwise homozygous chromosome, redirects crossover events into the former. The increase in heterozygous region is mostly observed close to the heterozygous-homozygous regions boarder, whilst decrease in homozygous part spans the entire region. The protocol for FTL use in crossover rate measurements is also included in this dissertation. Class II crossovers are polymorphism-sensitive and cannot be efficiently formed in heterozygous regions. In hybrids exhibiting only Class II (fancm zip4 double mutant), crossover scarcity is the reason for reduced fertility. By additionally inactivating MSH2, I was able to increase plant fertility. Moreover, my genome-wide crossover analysis in different mutant contexts, including msh2 fancm and msh2 recq4, combined with FTL crossover frequency measurements, revealed that MSH2 limits Class II crossovers. Hence, MSH2 has opposite roles in two crossover pathways. In pericentromeric regions, which are much more polymorphic than the rest of the chromosome, MSH2 inactivation was not able to increase Class II crossovers frequency in heterozygous regions. This shows MSH2-independent polymorphism impact on recombination. Finally, the overexpression of pro-crossover HEI10 caused significant increase in recombination in all tested heterozygosity variants, with a trend of heterozygous regions attracting crossovers still present. I showed, that in msh2 HEI10-OE total recombination is increased because of HEI10 promoting Class I, however no juxtaposition effect is observed. What is more, no HEI10 stimulation is detected in msh2 fancm zip4 HEI10-OE variant, proving that HEI10 has no role in Class II. To sum up, I showed pro-recombination role of MSH2 for Class I crossovers and an antagonistic, anti-recombination role for Class II crossovers. Therefore, this work demonstrates that MSH2 is a master regulator of both crossover pathways, which allows for dynamic regulation of meiotic recombination outcomes, depending on the level and distribution of sequence divergence between homologs.
Modelowanie struktur przestrzennych kompleksów makromolekularnych
(2023) Dobrychłop, Mateusz; Bujnicki, Janusz. Promotor
Kompleksy makromolekularne odgrywają fundamentalną rolę w wielu procesach w komórce. Struktury niektórych kompleksów zostały rozwiązane doświadczalnie, jednak dla większości z nich dostępne dane strukturalne są niekompletne. W takich przypadkach możliwe jest zastosowanie narzędzi komputerowych, tworzących modele kompleksów w oparciu o dane pochodzące z różnych źródeł. Takie podejście, nazywane podejściem hybrydowym, wykorzystuje program PyRy3D. Za jego pomocą zbudowano modele dwóch kompleksów, opisane w niniejszej pracy. Pierwszym z nich był edytosom T. brucei - kompleks przeprowadzający proces edycji pre-mRNA u afrykańskich świdrowców. Analiza rozmieszczenia poszczególnych komponentów w modelu pozwala na zaproponowanie mechanizmu działania edytosomu, w którym obecne na powierzchni regiony nieuporządkowane odpowiedzialne są za aktywność remodelującą RNA, natomiast zgromadzone w rdzeniu układu ustrukturyzowane domeny odpowiadają za jego aktywność katalityczną. Drugim opisanym modelem jest model kompleksu karboksylazy acylo-CoA z M. tuberculosis. Kompleks ten katalizuje jedną z reakcji szlaku syntezy kwasów mikolowych u mikobakterii. Uzyskany model sugeruje strukturalne podstawy mechanizmu działania kompleksu, w którym domena BCCP białka AccA3 porusza się między kolejnymi etapami reakcji karboksylacji acylo-CoA, dzięki obecnemu w strukturze białka elastycznemu łącznikowi. Macromolecular complexes play a fundamental role in many processes in the cell. The structures of some complexes have been solved experimentally, but for most of them the available structural data is incomplete. In such cases, it is possible to use computational tools that create models of complexes based on data from different sources. Such an approach, called hybrid approach, is used by the PyRy3D software that was applied to build models of two complexes described in this work. The first was the editosome of T. brucei, a complex that carries out the pre-mRNA editing process in African trypanosomas. Analysis of the distribution of components in the model allows us to propose a mechanism of action, in which disordered regions present on the surface are responsible for RNA remodeling activity, while structured domains accumulated in the core of the system are responsible for its catalytic activity. The second model described is that of an acyl-CoA carboxylase complex from M. tuberculosis. This complex catalyzes one of the reactions of the mycolic acid synthesis pathway in mycobacteria. The resulting model suggests a structural basis for the mechanism of action of the complex, in which the BCCP domain of the AccA3 protein moves between successive steps in the acyl-CoA carboxylation reaction, thanks to a flexible linker present in the structure of the protein.
Charakterystyka mechanizmu degradacji proteasomalnej syntazy ACC typu III-ACS7 u Arabidopsis thaliana
(2023) Marczak, Małgorzata; Ludwików, Agnieszka. Promotor
Etylen jest hormonem roślinnym, który uczestniczy w kontroli wzrostu i rozwoju roślin. Biosynteza etylenu złożona jest z dwóch prostych reakcji enzymatycznych, z których istotną reakcją jest przekształcenie S-adenozylometioniny w kwas 1-aminocyklopropano-1-karboksylowy przez syntazy ACC. W przedstawionej pracy skupiono się na syntazie ACC typu III- ACS7 u Arabidopsis thaliana, która charakteryzuje się brakiem C-końcowej domeny zawierającej miejsca fosforylacji dla kinaz MAPK oraz CDPK. Celem badań przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy jest poznanie mechanizmu regulującego stabilność białka ACS7. Analizy mikroskopowe wykazały, że ACS7 oddziałuje z fosfatazami białkowymi 2C z grupy A - ABI1, ABI2 i HAB1. W celu zbadania miejsc oddziaływania analizowanych PP2C z ACS7 przygotowano fragmenty delecyjne syntazy ACS7. Wykorzystując technikę mBiFC wykazano, że wszystkie formy delecyjne oddziałują z testowanymi PP2C. Dodatkowo, na podstawie wyników analizy BiFC-FRET-FLIM stwierdzono, że reszty aminokwasowe ABI1 W300 oraz I298 są istotne dla oddziaływania z ACS7. Dalsze badania wykazały, że analizowane PP2C są zaangażowane w regulację stabilności ACS7 oraz, że reszty serynowe w sekwencji ACS7: S48 oraz S85 mogą być defosforylowane przez ABI1. Ponieważ, nie jest poznany dokładny mechanizm degradacji proteasomalnej ACS7, skupiono się na identyfikacji potencjalnych miejsc ubikwitynacji. Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że lizyny 238 oraz 384 w sekwencji ACS7 wpływają na stabilność syntazy. Wyniki uzyskane skupiają się na poznaniu molekularnych mechanizmów proteasomalnej degradacji ACS7. Ethylene controls plant responses to many environmental factors. Ethylene biosynthesis consists of two simple enzymatic reactions, the most important is the conversion of S-adenosylmethionine to 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid by ACC synthases. This work focuses on the type III synthase from Arabidopsis thaliana, ACS7. ACS7 is characterised by the absence of known phosphorylation sites for MAPKs and CDPKs within the C-terminal domain of the protein. The aim of the research carried out in this thesis is to unravel the mechanism that regulates the stability of the ACS7 protein. Microscopic analyses showed that ACS7 interacts with the ABI1, ABI2 and HAB1 protein phosphatases. To identify the sites of interaction between PP2Cs and ACS7, ACS7 synthase deletion fragments were generated. Using the mBiFC technique, all deletion forms were shown to interact with tested PP2Cs. Additionally, using the BiFC-FRET-FLIM method, the amino acid residues ABI1 W300 and I298 were found to be important for the interaction with ACS7. Further studies it was shown that protein phosphatases are involved in regulating the stability of ACS7. Next, potential serine residues, S48 and S85, that could be dephosphorylated by the ABI1 were identified. Since the exact mechanism of proteasomal degradation of ACS7 is unknown, the focus was on identifying potential ubiquitination sites. Based on the results of the research presented in this thesis, it was shown that lysine 238 and 384 in the ACS7 sequence affect the stability of the synthase. The work results in a focus on understanding the molecular mechanisms of proteasomal degradation of the key enzyme in ethylene biosynthesis – ACS7.
Rozpoznawanie cząsteczek RNA przez domenę FinO białka ProQ z bakterii Escherichia coli
(2023) Stein, Ewa; Olejniczak, Mikołaj. Promotor
Białko ProQ z bakterii Escherichia coli zbudowane z N-końcowej domeny FinO (NTD) i C-końcowej domeny Tudor (CTD) połączonych linkerem, wiąże liczne cząsteczki RNA w komórce, jednak niewiele wiadomo na temat sposobu ich rozpoznawania. Analiza wiązania RNA i ich mutantów do pełnej długości ProQ oraz wyizolowanej NTD wskazała, że elementem struktury rozpoznawanym przez NTD jest terminator transkrypcji niezależny od białka Rho. Znaczenie dla oddziaływania mają też znajdujący się na 3' końcu cząsteczki ogon poliU o dł. co najmniej 4 nt i region dwuniciowy spinki terminatorowej o dł. co najmniej 2 pz. Motyw sekwencji bogatej w adenozyny znajdujący się po 5'-stronie spinki terminatorowej ligandów ProQ odgrywa rolę w kompetycji pomiędzy ProQ i Hfq. Następnie w obrębie NTD wytypowałam 10 reszt aminokwasowych, które zmutowałam i sprawdziłam ich wpływ na wiązanie 7 RNA in vitro. Mutacje w pozycjach R58, Y70 i R80 hamują wiązanie do RNA, mutacje reszt K54 i R62 znacząco je osłabiają, podczas gdy najmniejszy wpływ mają mutacje w pozycjach R32, D41 i T65. Mutacje reszt K35 i R69 miały odmienny wpływ na wiązanie różnych RNA, co może sugerować różnice w sposobach oddziaływania cząsteczek RNA z domeną FinO białka ProQ. Wyniki pozwalają na wyjaśnienie sposobu oddziaływania ProQ z RNA, przez to na lepsze zrozumienie jego udziału w procesach kontroli ekspresji genów zależnych od regulatorowych RNA u bakterii.
Wpływ polimorfizmu DNA pomiędzy homologami na formowanie mejotycznych crossing-over w skali całogenomowej i na poziomie gorących miejsc rekombinacji u Arabidopsis thaliana
(2023) Szymańska-Lejman, Maja; Ziółkowski, Piotr. Promotor
Rekombinacja mejotyczna crossing-over jest kluczowym procesem polegającym na wzajemnej wymianie fragmentów chromosomów homologicznych, który prowadzi do tworzenia nowych kombinacji alleli w organizmach hybrydowych. Podczas rekombinacji mejotycznej, polimorfizm DNA pomiędzy homologami może mieć wpływ na częstość i rozkład crossing-over wzdłuż chromosomów. Jednak efekt ten pozostaje wciąż słabo poznany. Aby zbadać związek między polimorfizmem, a rekombinacją w skali całego genomu zoptymalizowałam metodę genotypowania przez sekwencjonowanie (GBS), która umożliwia mapowanie zdarzeń crossing-over w różnych krzyżówkach Arabidopsis thaliana. Porówanie chromosomowego rozkładu crossing-over w liniach typu dzikiego i w tle mutantów msh2, które nie są zdolne do wykrywania błędnie sparowanych zasad w DNA, ujawniło znaczące różnice. Polegają one na tym, że miejsca bardziej polimorficzne, położone w regionach przycentromerowych są mniej aktywne rekombinacyjnie w mutancie msh2, natomiast crossing-over zachodzi z wyższą częstością w regionach subtelomerowych, które zawierają znacznie mniej polimorfizmów. Ponadto, opracowałam nowe narzędzie do badania rozkładu crossing-over na poziomie gorących miejsc rekombinacji, które nazwaliśmy typowaniem nasion (ang. seed-typing). Metoda ta umożliwia zarówno pomiar częstości crossing-over, jak i precyzyjne mapowanie miejsc zajścia poszczególnych zdarzeń rekombinacyjnych. Korzystając z tego podejścia, zidentyfikowałam bardzo polimorficzny interwał ChP z trzema gorącymi miejscami rekombinacji: Aro, Coco i Nala. Nasze wyniki pokazują, że centra gorących miejsc rekombinacji są praktycznie pozbawione polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. SNP), ale obecność SNP w ich bezpośredniej bliskości stymuluje aktywność crossing-over w danym miejscu. Ponadto, zmiany strukturalne otaczające badany interwał chromosomowy nie mają wpływu na częstość rekombinacji, jeśli nie obejmują bezpośrednio gorących miejsc rekombinacji. Przy użyciu linii A. thaliana z naturalną delecją w Coco lub po wygenerowaniu sztucznej delecji przy pomocy CRSIPR/Cas9, potwierdziliśmy, że u Arabidopsis nie występuje współzawodnictwo między blisko zlokalizowanymi gorącymi miejscami rekombinacji. Dodatkowo, zbadaliśmy związek pomiędzy SNP, MSH2 i rekombinacją poprzez mapowanie crossing-over w tle mutanta msh2. Ujawniło to interesującą tendencję polegającą na tym, że bardziej polimorficzne gorące miejsca rekombinacji są mniej aktywne po wyłączeniu systemu rozpoznawania błędnie sparowanych zasad (tj. w mutancie msh2). Bezpośredni wpływ polimorfizmów został sprawdzony w liniach, które są heterozygotyczne tylko w badanym interwale. Linie te, wykazywały wyższą częstość rekombinacji w badanym interwale w porównaniu z pełni homozygotycznymi liniami wsobnymi. Efekt ten nie był widoczny w roślinach posiadających mutację w genie MSH2, co sugeruje, że MSH2 promuje zachodzenie crossing-over w gorących miejscach rekombinacji otoczonych regionami o wysokiej gęstości SNP.
Charakterystyka genów z rodziny MIR444 w jęczmieniu zwyczajnym (Hordeum vulgare) i ich potencjału kodującego
(2023) Chojnacka, Aleksandra; Szweykowska-Kulińska, Zofia. Promotor
MikroRNA (miRNA) są krótkimi jednoniciowymi cząsteczkami RNA, regulującymi poziom ekspresji innych genów. Geny MIR444 zidentyfikowano jedynie u roślin jednoliściennych i ich charakterystyczną cechą jest obecność intronu, który rozdziela dwie połowy struktury prekursora mikroRNA. Sekwencja mikroRNA* znajduje się w jednym egzonie, natomiast mikroRNA zlokalizowana jest w kolejnym egzonie. W jęczmieniu zidentyfikowano trzy geny MIR444 o złożonej budowie egzonowo-intronowej. Ich transkrypty, pri-miRNA444, podlegają alternatywnemu splicingowi generując izoformy, które można podzielić na funkcjonalne (mikroRNA jest produkowany) i niefunkcjonalne (mikroRNA nie jest produkowany). Z wykorzystaniem analizy bioinformatycznej i techniki profilowania polisomów wykazano, że zidentyfikowane izoformy pri-miR444 posiadają otwarte ramki odczytu, które mogą kodować peptydy o długościach 119 (PEP444a), 51 (miPEP444b) oraz 168 (PEP444c) aminokwasów. Przy użyciu specyficznych przeciwciał potwierdzono obecność PEP444a w pędach jęczmienia w warunkach stresu nadmiaru azotu oraz PEP444c w pędach i korzeniach, zarówno w warunkach kontrolnych jak i w stresie nadmiaru azotu. Wykazano, że mutacje wprowadzone w rejonie sekwencji kodującej PEP444a mają najprawdopodobniej efekt letalny. Mutacje w sekwencji kodującej PEP444c wprowadziły przedwczesny kodon stop. U roślin transgenicznych pep444c ze zmienioną sekwencją aminokwasową PEP444c zaobserwowano obniżony poziom mikroRNA444c w korzeniach, co wskazuje na istotną rolę PEP444c w regulacji poziomu ekspresji genu MIR444c.
Rola komunikacji zapachowej w modyfikowaniu wewnątrzgatunkowej agresji u chomika europejskiego Cricetus cricetus (L.)
(2023) Eichert, Urszula; Ziomek, Joanna. Promotor
Agresja jest zachowaniem częściej obserwowanym u gryzoni podczas eksperymentów laboratoryjnych niż w warunkach naturalnych. Uważa się, że komunikacja zapachowa może wpływać na zmniejszanie liczby agresywnych interakcji poprzez ostrzegawczo-odstraszające działanie na osobniki w populacji. W celu zbadania roli komunikacji zapachowej w zmniejszaniu liczby agresywnych interakcji, przeprowadzono serię eksperymentów na dziko żyjących populacjach chomika europejskiego w miejscowościach Jaworzno (2012-2013) oraz Przybyszów (2014-2015). W eksperymentach przeprowadzonych w warunkach naturalnych zastosowano zmodyfikowane metody Owadowskiej (1999) natomiast w warunkach seminaturalnych zmodifikowany labirynt Y (Ferkin i Seamon 1987).Wykazano, że zapach nie jest dla chomika wabiącym atraktantem, a także bodźcem odstraszającym, niezależnie od płci dawców zapachu/badanego osobnika, czy niezależnie od prawdopodobnej znajomości zapachowej osobników. Stwierdzono również, że rezydenci zamieszkujący dany obszar rzadko reagują na zapach znakowaniem czy stresem. Eksperyment z labiryntem nie wykazał, aby agresywne interakcje dominowały nad zachowaniami defensywno-stresowymi, oraz aby doświadczenia nabyte w labiryncie wpływały na późniejsze unikanie/ignorowanie zapachu osobnika, prezentowanego przy wejściu do ramion labiryntu. Wyniki badań sugerują, że zapach nie pełni funkcji odstraszającej, lecz informacyjną, pozwalającą chomikom oszacować swoje szanse oraz kondycję konkurenta w razie późniejszego bezpośredniego spotkania.
Taksonomia i ewolucja dutkowych roztoczy z rodziny Syringophilidae (Acariformes: Prostigmata) pasożytujących na ptakach gołębiowych (Aves: Columbiformes)
(2023) Kaszewska-Gilas, Katarzyna; Skoracki, Maciej. Promotor
Znajomość różnorodności gatunkowej pasożytów związanych z poszczególnymi grupami żywicieli, ma kluczowe znaczenie w badaniach nad układem pasożyt-żywiciel i ich historii ewolucyjnej. Pasożytnictwo permanentne jest jednym z najbardziej intrygujących rodzajów pasożytnictwa, badania nad tego typu pasożytami mogą pomóc lepiej zrozumieć interakcje i relacje w układach antagonistycznych. Przedmiotem badań w mojej pracy doktorskiej była acarofauna obligatoryjnych oraz wysoce specyficznych ektopasożytniczych roztoczy należących do rodziny Syringophilidae, pasożytujących na ptakach z rzędu Columbiformes. Gołębiowe były jedną z najsłabiej przebadanych grup ptaków pod kątem występowania roztoczy dutkowych oraz wzajemnych relacji w układzie pasożyt-żywiciel. W ramach pracy doktorskiej podjęto następujące cele: 1) zbadanie różnorodności taksonomicznej Syringophilidae z możliwie szerokiego spektrum potencjalnych żywicieli należących do ptaków gołębiowych reprezentujących trzy klady oraz pochodzących ze wszystkich krain zoogeograficznych 2) zbadanie interakcji w układzie pasożyt-żywiciel m. in. określenie prewalencji, specyficzności żywicielskiej i topicznej roztoczy dutkowych związanych z ptakami gołębiowymi. 3) ustalenie relacji filogenetycznych na poziomie rodzajowym Syringophilidae pasożytujących na ptakach gołębiowych. Prezentowana praca doktorska składa się z części taksonomicznej oraz części poświęconej zagadnieniom specyficzności żywicielskiej, interakcjom w układzie pasożyt-żywiciel oraz powiązań filogenetycznym pomiędzy poszczególnymi rodzajami w obrębie Syringophilidae. Podczas badań przebadano 112 gatunków ptaków należących do rzędu Columbiformes. Stwierdzono obecność 25 gatunków roztoczy dutkowych pasożytujących na 65 gatunkach ptaków. Opisano 16 nowych dla wiedzy gatunków dutkowców, będących przedstawicielami następujących rodzajów: Meitingsunes (M. chalcophas, M. turacoenas M. lengai, M. ptilinopus), Peristerophila (P. lature, P. geopelis, P. leucomela), Psittaciphilus (P. montanus, P. patagioenas) oraz Gunabopicobia (G. claravis, G. geotrygoni, G. masalaje, G. metriopelia, G. lathami, G. leptotila, G. verraruxi). Badania taksonomiczne prowadzone były na przedstawicielach wszystkich krain zoogeograficznych w których występują ptaki gołębiowe. Syringophilidae stwierdzono w nowych rejonach zoogeograficznych tj.: Oceania (Papua Nowa Gwinea, Indonezja) oraz kraina Australijska (Australia), poszerzając tym samym wiedzę na temat światowego rozmieszczenia tychże roztoczy na przedstawicielach Columbiformes. W ramach pracy doktorskiej określono prewalencję dla każdego zainfekowanego gatunku żywicielskiego. Indeks prewalencji oscylował między 4.2%– 100%. Otrzymane wyniki pozwoliły na scharakteryzowanie stopnia powiązań pomiędzy poszczególnymi gatunkami pasożytów i ich żywicielami. Na podstawie przeprowadzonej analizy specyficzności żywicielskiej stwierdzono 8 gatunków monoksenicznych, 5 gatunków oligoksenicznych, 8 mesostenokseniczych, 3 metastenoksenicznych oraz 1 polikseniczny. Ponadto zaobserwowano ko-infestację kilku gatunków roztoczy na 11 gatunkach ptaków gołębiowych. Stwierdzono występowanie następujących wzorców multiinfestacji: Syringophilinae-Syringophilinae (Syr-Syr) oraz Syringophilinae-Picobiinae (Syr-Pic), w których czynnikiem rozdzielającym pasożyty była zasiedlana nisza. Tylko w jednym przypadku odnotowano zasiedlanie tego samego typu piór, przez dwa odrębne gatunki dutkowców, jednakże nie zaobserwowano w żadnym z przypadków występowania dwóch różnych gatunków w obrębie tej samej dutki. Kolejnym celem pracy doktorskiej było zbadania interakcji w układzie pasożyt-żywiciel. Przeprowadzono analizę sieci dwudzielnych składających się ze wszystkich dotychczas poznanych gatunków Syringophilidae infestujących ptaki z rzędu Columbiformes. Otrzymana sieć charakteryzowała się następującymi: wartościami współczynników: specjalizacja na poziomie sieciowym H2=0.93, połączeń C=0.90, zagnieżdżenia N=0.908 oraz modularności Q=0.83. Architektura sieci – Syringophilidae-Columbiformes, wskazuje iż roztocze dutkowe pasożytujące na ptakach gołębiowych tworzą wysoce specyficzny układ, o silnej dominacji gatunków wyspecjalizowanych na rzecz pasożytów o szerszym spektrum żywicielskim. Wykazano także tworzenie w ramach sieci 20 modułów (klastrów), które podzielono na 3 grupy: A) skupiające jeden gatunek pasożyta i związany z nim gatunek żywicielski, B) jeden gatunek pasożyta zasiedlający wiele gatunków żywicielskich, C) dwa lub więcej gatunków Syringophilidae skupionych wokół kilku gatunków żywicielskich. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że roztocze dutkowe tworzą trwałe związki pomiędzy żywicielami, z niską tendencją do losowej zmiany żywiciela, na co wskazują słabe interakcje poza zajmowanymi klastrami. W ramach prac badawczych przeprowadzono analizę filogenetyczną opartą na cechach morfologicznych, która wykazała występowanie dwóch odrębnych kladów w obrębie podrodziny Syringophilinae, tj. Meitingsunes-Psittaciphilus oraz Peristerophila-Terratosyringophilus.
Syringophilidae (Acariformes: Prostigmata) pasożytujące na ptakach papugowych (Aves: Psittaciformes)
(2023) Marciniak-Musiał, Natalia; Sikora, Bożena. Promotor
Roztocze dutkowe z rodziny Syringophilidae (Acariformes: Prostigmata: Cheyletoidea) to obligatoryjne, wysoce wyspecjalizowane i szeroko rozpowszechnione ektopasożyty związane z ptakami. Papugowe (Psittaciformes) to liczny w gatunki rząd ptaków, dotąd słabo przebadany pod kątem występowania roztoczy Syringophilidae. Do czasu rozpoczęcia badań znanych było 25 gatunków pasożytniczych roztoczy infestujących 36 gatunków ptaków. Badaniami objęto 50% wszystkich znanych gatunków papug, a ich celem była rewizja fauny pasożytniczych Syringophilidae żerujących na papugowych, poznanie ich preferencji żywicielskich, rozmieszczenia geograficznego oraz odkrycie nieznanych zależności w układzie pasożyt-żywiciel. Podsumowując, obecnie fauna Syringophilidae zasiedlająca ptaki papugowe liczy 46 gatunków roztoczy (w tym 19 nowych dla wiedzy), które żerują na 81 gatunkach papugowych. Ich największe bogactwo gatunkowe występuje w regionach australijskim i neotropikalnym; są to głównie pasożyty monokseniczne (63%) oraz oligokseniczne (18%). Wyniki mojej pracy doktorskiej przyczynią się do poszerzenia wiedzy z zakresu parazytologii, biogeografii, filogenetyki oraz ewolucji pasożytów i żywicieli.
Rola czynnika transkrypcyjnego ETV1 w adhezji ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i rozwoju in vitro ludzkiej endokrynnej trzustki
(2023) Ziojła, Natalia Maria; Borowiak, Małgorzata. Promotor
Trzustka jest narządem gruczołowym zbudowanym z części egzokrynnej i endokrynnej. Komórki endokrynne trzustki tworzą wyspy Langerhansa, w których komórki β obniżają poziom glukozy produkując insulinę, a komórki α go zwiększają wydzielając glukagon. Długotrwałe zakłócenie homeostazy glukozy może prowadzić do przewlekłej choroby metabolicznej–cukrzycy. Zakłócenia homeostazy mogą wynikać z autoimmunologicznej utraty komórek β lub upośledzenia ich funkcji. Obecne terapie nie oferują wyleczenia a regeneracja masy komórek β powstałych z różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) in vitro jest alternatywą przywracania normoglikemii u pacjentów z cukrzycą. Na podstawie danych z scRNA-Seq mysich trzustek z e14,5 wybrano ETV1 jako nowy potencjalny regulator dojrzewania komórek endokrynnych trzustki. Wykorzystując CRISPR/Cas9 wyprowadzono hPSC z wyłączoną ekspresją ETV1. Komórki edytowane wykazywały zwiększoną adhezję, co potwierdzono niezależnymi metodami. Kolejnym celem było określenie roli ETV1 w rozwoju komórek prekursorowych endokrynnej trzustki (EP) podczas różnicowania in vitro z hPSC. Analiza scRNA-Seq pozwoliła na porównanie EP powstających z hPSC typu dzikiego i edytowanych. Podsumowując, niniejsza rozprawa doktorska dostarcza interesującego i głębszego wglądu w podwójną rolę ETV1 zarówno w pluripotencji, jak i rozwoju części endokrynnej trzustki.

Browse

Recent Submissions