Doktoraty (WB)

Permanent URI for this collection

Browse

Recent Submissions

Now showing 1 - 20 of 257
  • Item
    Identyfikacja i charakterystyka genów warunkujących komórkową homeostazę poliamin w starzeniu liści jęczmienia
    (2024) Stolarska, Ewelina; Sobieszczuk-Nowicka, Ewa. Promotor; Tanwar, Umesh Kumar. Promotor pomocniczy
    Starzenie rozwojowe jest procesem nieodwracalnym, po którym następuje bezwarunkowo śmierć komórki. Indukowane ciemnością starzenie liści (ang. dark-induced leaf senescence, DILS) jest do pewnego stadium procesem odwracalnym. W roślinach indukowane starzenie jest wysoce kontrolowanym i aktywnym procesem wymagającym globalnego przeprogramowania metabolicznego, mającego na celu zorganizowaną dezintegrację i ponowną remobilizację cennych zasobów. Sprawność regulacji indukowanego procesu starzenia jest oznaką żywotności starzejących się komórek, które na każdym etapie muszą zachować zdolność do utrzymania homeostazy, przejawiającej się m.in. kontrolowaniem homeostazy cyklu poliamin (PA). Homeostaza PA w komórce jest utrzymywana przez mechanizmy sprzężenia zwrotnego z poziomu biosyntezy, katabolizmu, importu i eksportu. Poliaminy są niskocząsteczkowymi organicznymi kationami należącymi do grupy biogennych amin, kluczowymi w wielu fizjologicznych i rozwojowych procesach u bakterii, zwierząt i roślin. Metabolizm PA może odgrywać istotną rolę w procesie starzenia się liścia. Zespół prof. Ewy Sobieszczuk-Nowickiej za cel postawił sobie poznanie wielokierunkowych powiązań metabolizmu poliamin z siecią metaboliczną organizującą proces starzenia liści jęczmienia oraz ocenę, czy zmiana kierunku starzeniowo-zależnego metabolizmu PA wpłynie na ten proces. Kierunek metabolizmu PA i transport może kontrolować efektywność zależnej od starzenia remobilizacji azotu. Do realizacji celu wybrano podejście oparte na genomice funkcjonalnej. Brak w literaturze informacji na temat sekwencji genów metabolizmu PA w jęczmieniu był dużym ograniczeniem tego podejścia. Stąd też potrzebna była identyfikacja genów metabolizmu PA w jęczmieniu, która stała się celem mojej rozprawy doktorskiej. Do badań włączyłam również analizę transporterów PA. Transportery PA są rozpoznane u roślin w niewielkim stopniu. Importery PA zostały opisane u rzodkiewnika, ryżu i pomarańczy. Eksportery PA zostały zasugerowane jako potencjalne eksportery PA u rzodkiewnika i ryżu. W wyniku badań w skali całego genomu jęczmienia wyodrębniłam rodziny genów warunkujące homeostazę PA w komórce, które obejmowały 23 geny metabolizmu PA i 13 genów transporterów. Przeprowadziłam również szczegółową charakterystykę zidentyfikowanych genów oraz ich białkowych produktów. Modelowanie homologiczne badanych transporterów pozwoliło z dużą dokładnością przewidzieć struktury trójwymiarowe białek, a analizy dokowania molekularnego potwierdziły możliwość interakcji pomiędzy białkami transportującymi a PA. Obecność w genomie zidentyfikowanych in silico genów potwierdziłam eksperymentalnie i zbadałam ich organospecyficzną ekspresję. Następnie w modelu starzenia liści jęczmienia indukowanego ciemnością zbadałam profile ekspresji genów homeostazy PA. Na podstawie tej analizy wytypowałam geny kandydujące do badań funkcjonalnych. Niniejsza rozprawa doktorska przedstawia wyniki pierwszej identyfikacji, izolacji i kompleksową charakterystykę genów jęczmienia warunkujących komórkową homeostazę PA oraz ocenę ich organospecyficznej i starzeniowo-zależnej ekspresji w metabolizmie liścia ekspresji. Wyniki moich badań stanowią punkt odniesienia badań funkcjonalnych wielu zespołów naukowców wyjaśniających mechanizmy molekularnej kontroli i regulacji przez PA procesów rozwojowych zbóż i ich reakcji na (a)biotyczne czynniki środowiska. Szczególnie badań funkcjonalnych nad mechanizmem działania PA w starzeniu liści. Developmental senescence is an irreversible process that is inevitably followed by cell death. Dark-induced leaf senescence (DILS) is a reversible process to a certain stage. In plants, induced senescence is a highly controlled and active process requiring global metabolic reprogramming aimed at the organized disintegration and remobilization of valuable resources. The efficiency of the regulation of the induced senescence process is a sign of the viability of senescent cells, which at each stage must maintain the ability to maintain homeostasis, manifested, among others, by controlling polyamine (PA) cycle homeostasis. PA homeostasis in the cell is maintained by feedback mechanisms from the levels of biosynthesis, catabolism, import and export. Polyamines are low molecular weight organic cations belonging to the group of biogenic amines, crucial in many physiological and developmental processes in bacteria, animals and plants. PA metabolism may play an important role in the leaf senescence process. Professor Ewa Sobieszczuk-Nowicka's team set themselves the goal to understand the multidirectional connections of polyamine metabolism with the metabolic network organizing the senescence process of barley leaves and to assess whether a change in the direction of senescence-dependent PA metabolism will affect this process. The direction of PA metabolism and transport may control the efficiency of senescence-dependent nitrogen remobilization. An approach based on functional genomics was chosen to achieve the goal. The lack of information in the literature on the sequence of PA metabolism genes in barley was a major limitation of this approach. Hence, there was a need to identify PA metabolism genes in barley, which became the goal of my doctoral thesis. I also included the analysis of PA transporters in my research. PA transporters are little known in plants. PA importers have been described in Arabidopsis, rice and orange. PA exporters have been suggested as potential PA exporters in Arabidopsis and rice. As a result of research on the entire barley genome, I identified gene families determining PA homeostasis in the cell, which included 23 PA metabolism genes and 13 transporter genes. I also carried out a detailed characterization of the identified genes and their protein products. Homology modeling of the studied transporters allowed to predict the three-dimensional structures of proteins with high accuracy, and molecular docking analyzes confirmed the possibility of interactions between transport proteins and PA. I experimentally confirmed the presence of the genes identified in silico in the genome and examined their organospecific expression. Then, in a dark-induced barley leaf senescence model, expression profiles of PA homeostasis genes. Based on this analysis, I selected candidate genes for functional research. This doctoral dissertation presents the results of the first identification, isolation and comprehensive characterization of barley genes determining cellular PA homeostasis, as well as the assessment of their organospecific and senescence-dependent expression in leaf metabolism. The results of my research constitute a reference point for functional studies of many teams of scientists explaining the mechanisms of molecular control and regulation by PA of crop development processes and their response to (a)biotic environmental factors. Especially functional studies on the mechanism of action of PA in leaf senescence.
  • Item
    Struktura zbiorowisk grzybów ektomykoryzowych w gradiencie środowiskowym
    (2024) Durska, Anna; Mucha, Joanna. Promotor; Kurek, Przemysław. Promotor
    Występowanie roślin w gradiencie środowiskowym jest ograniczone czynnikami abiotycznymi oraz biotycznymi i często zależy od kierunkowych zmian zachodzących w drobnych korzeniach (< 2 mm średnicy) a w szczególności od zmian w obrębie zbiorowisk grzybów mykoryzowych, umożliwiających wzrost roślin w różnych warunkach siedliskowych. Wśród korzeni drobnych możemy rozróżnić dwa funkcjonalne segmenty: 1) korzenie pełniące role strukturalne i transportowe oraz 2) drobne korzenie chłonne, które biorą udział głównie w pozyskiwaniu i wchłanianiu substancji pokarmowych z gleby. Ze względu na zdolność wchłaniania wody i składników odżywczych drobne korzenie chłonne są najbardziej dynamicznym i najważniejszym funkcjonalnie elementem systemu korzeniowego drzew. Natomiast grzyby mykoryzowe stanowią integralną ich część, istotną ze względu na funkcję pozyskiwania składników pokarmowych, w tym azotu i fosforu. Celem niniejszej pracy była analiza zmienności zbiorowisk grzybów ektomykoryzowych (ECM) zasiedlających drobne korzenie sosny zwyczajnej w gradiencie szerokości geograficznej oraz związanej z tym zmienności warunków klimatycznych i dostępności składników pokarmowych (transekt: Szwecja). Grzyby ECM zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania fragmentu ITS. W dalszej części pracy zbadano zmienność zawartości makroelementów (C, N, P, Mg, K, Ca) oraz mikroelementów (Fe, Na, Zn, Cu, B i Al) w drobnych korzeniach sosny zwyczajnej, pełniących odmienną funkcję: absorpcyjną – pierwszy rząd i transportową – siódmy rząd (transekt: Szwecja, Finlandia i Polska). Wykazano, że w gradiencie szerokości geograficznej, wraz ze wzrostem odległości od równika, obserwowane bogactwo gatunków ECM nie różniło się istotnie pomiędzy badanymi regionami Szwecji. Wyniki pozwalają na odrzucenie hipotezy o zmniejszeniu bogactwa gatunkowego grzybów ECM wraz z obniżeniem się średniej temperatury rocznej. Ponadto, w gradiencie malejącej średniej rocznej temperatury zaobserwowano zmianę głównego komponentu zbiorowisk grzybów ECM – od rodzaju Suillus na południu, do zbiorowisk zdominowanych przez obecność grzybów z rodzaju Piloderma na północy. Głównymi czynnikami abiotycznymi, które kształtują zbiorowiska grzybów ECM sosny zwyczajnej w Szwecji są: średnie roczne opady, pH gleby i stężenie żelaza (Fe) w glebie. Istotnym elementem pracy było określenie zmienności zbiorowisk grzybów ektomykoryzowych zasiedlających korzenie drobne buka zwyczajnego w gradiencie dostępności składników pokarmowych (transekt: Polska). W celu zminimalizowania wpływu warunków klimatycznych na badaną zmienność, do badań wytypowano drzewostan umieszczony na zboczu rynny polodowcowej o 30% nachyleniu. Ukształtowanie terenu na powierzchni badawczej wytworzyło naturalny gradient składników pokarmowych i mineralnych. Zaobserwowano istotną zmienność gatunkową grzybów mykoryzowych oraz zmianę ilości korzeni I rzędu skolonizowanych przez symbionty ECM w gradiencie dostępności składników pokarmowych. Wyniki pracy wskazują, że struktura taksonomiczna grzybów ECM związanych z bukiem jest determinowana przez właściwości fizyko-chemiczne gleby jak wartość pH oraz zasobność w tlenek fosforu (V). The distribution of plants along environmental gradients is constrained by abiotic and biotic factors and often depends on directional changes occurring in fine roots diameter (< 2 mm) in particular on changes within mycorrhizal fungal communities, enabling plant growth in diverse habitats. Fine roots consist of compartments that perform different functions: absorptive fine roots are mainly involved in acquiring and absorbing soil resources, while transporting fine roots play structural and transportation roles. Due to their capacity in the absorption of water and nutrients, they are the most dynamic and functionally most important element of the tree root system. Mycorrhizal fungi are an integral part of the fine roots due to their potential to foraging nutrients, including nitrogen and phosphorus. The aim of the doctoral dissertation was to determine the variability of diversity and composition of ectomycorrhizal (ECM) fungal communities inhabiting fine roots of Scots pine along the latitude gradient and the related variability of climatic conditions and nutrient availability in Sweden. ECM taxa were identified using internal transcribed spacer (ITS) sequencing from ECM root tips. Further in this study, it has been examined the variability of contents of important biogenic elements (such as macroelements (C, N, P, Mg, K, Ca) and microelements (Fe, Na, Zn, Cu, B, and Al)) in fine roots of Scots pine which perform a different function: absorption (first order) and transport (seventh order). For these purpose samples were collected in an extended transect covering Sweden, Finland and Poland. Results showed that along the latitude gradient, with increasing distance from the equator, the observed ECM species richness did not substantially change across the research regions. This allows us to reject the hypothesis that a decrease in the average annual temperature would result in a decline in the species richness of the ECM fungi. Additionally, across the MAT gradient, there was a noticeable shift from ECM fungal community dominated by the genus Suillus to community where fungi from the genus Piloderma predominated. The result indicated that the main abiotic factors that affect and shape the ECM fungal communities of Scots pine across Sweden are the mean annual precipitation, soil pH and soil Fe concentration. Moreover, the characterization of ECM fungal communities associated with European beech along local nutrient availability gradient was determined. Soil and roots samples were taken from beech forest located on 30% slope formed by glacial erosion in Poland. Slope location impact the spatial distribution of moisture and soil chemical properties, which give the opportunity to investigate the influencing factors of ECM fungi community in reduced impact of climate conditions. The research findings indicated the significant species variability and an alteration in the number of beech first-order roots colonized by ECM symbionts and revealed that soil pH and phosphorus content had the crucial impact on the diversity and composition of root fungal communities of European beech at the tested location.
  • Item
    Identyfikacja nowych modyfikatorów niekanonicznej biosyntezy toksycznego białka poliglicynowego ze zmutowanego mRNA FMR1
    (2024) Tutak, Katarzyna; Sobczak, Krzysztof. Promotor; Baud, Anna. Promotor pomocniczy
    Choroby związane z premutacją łamliwego chromosomu X (FXPAC) wynikają z mutacji w genie FMR1 na chromosomie X, który odpowiada za produkcję białka FMRP. Rejon regulatorowy genu FMR1 zawiera między 25–35 powtórzeń trójki nukleotydowej CGG, natomiast patologiczna ekspansja w zakresie od 55 do 200 powtórzeń leży u podstaw FXPAC, prowadząc do chorób takich jak zespół drżenia/ataksji związanej z łamliwym chromosomem X (FXTAS) i przedwczesne wygasanie funkcji jajników (FXPOI). Patomechanizmy zaangażowane w wywołanie i progresję FXPAC obejmują sekwestrację białek do toksycznego RNA tworzącego struktury drugorzędowe, kotranskrypcyjne powstawanie tzw. pętel R powodujących uszkodzenie DNA oraz związaną z powtórzeniami translację typu RAN, która prowadzi do produkcji toksycznych białek, zwłaszcza białek poliglicynowych FMRpolyG agregujących w mózgu pacjentów. Głównym celem pracy doktorskiej była identyfikacja nowych modyfikatorów translacji RAN. W badaniu zidentyfikowano ponad 60 białek wiążących się ze zmutowanym mRNA FMR1 i wśród nich scharakteryzowano czynniki regulujące translację RAN. W szczególności zubożenie niektórych białek, w tym RPS26, RPS25, DHX15, DDX21 i ALYREF, wpłynęło na poziom i agregację FMRpolyG, podkreślając ich rolę w patologii FXPAC. Praca to dostarcza wglądu w mechanizmy FXPAC i identyfikuje nowe modyfikatory translacji RAN, co sugeruje, że skład podjednostki 40S ma kluczowe znaczenie w regulacji tego procesu. Fragile X-premutation-associated conditions (FXPAC) stem from mutations in the FMR1 gene on the X chromosome, which affects the fragile X messenger ribonucleoprotein 1 protein (FMRP) production. Normal FMR1 genes have 25–35 CGG repeats, but expansions to 55–200 repeats cause FXPAC, leading to conditions like fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) and primary ovarian insufficiency (FXPOI). FXPAC pathology involves toxic RNA forming secondary structures, co-transcriptional R loops causing DNA damage, and repeat-associated non-ATG (RAN) translation producing harmful proteins, notably FMRpolyG, which aggregates in the brain. The main aim of PhD thesis was to identify novel RAN translation modifiers. The study identified over 60 proteins binding to mutant FMR1 mRNA, with some regulating RAN translation. Specifically, depletion of certain proteins, including RPS26, RPS25, DHX15, DDX21, and ALYREF, impacted FMRpolyG levels and aggregation, highlighting their role in FXPAC pathology. This research provides insights into FXPAC mechanisms and identifies novel RAN translation modifiers, suggesting the 40S subunit's composition is crucial in CGG-related RAN translation regulation.
  • Item
    Kodowanie informacji o gatunku i osobniku w śpiewie Afrykańskich turkaweczek z rodzaju (Turtur sp.)
    (2024) Niśkiewicz, Małgorzata; Osiejuk, Tomasz Stanisław. Promotor
    Śpiew i wokalizacje ptaków pełnią istotną rolę w ich codziennym życiu, ale szczególnie ważne są w kontekście znalezienia partnera i obrony terytorium. Żeby pełnić te funkcje, śpiew powinien zawierać informację o ich przynależności gatunkowej, a jednocześnie zawierać cechy umożliwiające rozpoznawanie osobników wewnątrz gatunku. W mojej rozprawie badałam afrykańskie turkaweczki, gołębie z rodzaju Turtur, opisując po raz pierwszy ich repertuar wokalny, głównie pod kątem rozpoznawania gatunkowego i osobniczego, a także przeprowadzając eksperymenty z playbackiem, testujące wybrane funkcje śpiewu. W tym celu brałam udział w badaniach terenowych w Nigerii, Mozambiku, Ghanie i Ugandzie w latach 2019-2023 zbierając dane dotyczące śpiewu i innych aspektów biologii. Ponieważ ten rodzaj nie był dobrze poznany, początkowo zbieraliśmy podstawowe dane biometrycznych, próbki krwi oraz piór, a także obserwowaliśmy zachowania i nagrywaliśmy wokalizacje. Dane te pozwoliły na poznanie powiązań filogenetycznych pomiędzy badanymi gatunkami, ich cech morfologicznych, preferencji środowiskowych a przede wszystkim na pełny opis zmienności śpiewu. Analizy genetyczne potwierdziły zakładane związki filogenetyczne między gołębiami, w których dwa większe gatunki preferujące leśne habitaty są ze sobą bliżej spokrewnione niż z pozostałymi trzema gatunkami z otwartych terenów, co pokazywały również dane morfologiczne. Analiza śpiewu wykazała dwuczęściową strukturę piosenek, gdzie u wszystkich gatunków początkowa część jest bardziej różnorodna, cichsza i zawiera duży potencjał do kodowania informacji specyficznej osobniczo. Z kolei końcowa część jest bardziej jednorodna, głośniejsza, przez co niesie się na dalsze odległości, mając większy potencjał do kodowania informacji o gatunku. W drugiej fazie badań przeprowadzaliśmy eksperymenty z playbackiem w celu sprawdzenia naszych założeń teoretycznych dotyczących rozpoznawania gatunkowego i osobniczego. W pierwszym eksperymencie testowaliśmy dwa leśne gatunki (T. brehmeri i T. tympanistria) żyjące w populacji sympatrycznej oraz jednego z nich (T. tympanistria) w populacji allopatrycznej. Ptakom zaprezentowano playbacki ze śpiewem ich własnego gatunku, gatunku blisko spokrewnionego oraz kontroli. W populacji sympatrycznej oba badane gatunki reagowały silnie tylko na śpiew własnego gatunku, a w allopatrycznej samce T. tympanistria reagowały na playback obu gatunków gołębi. Podobny eksperyment przeprowadziliśmy na dwóch gatunkach sawannowych (T. afer i T. chalcospilos) żyjących w populacji sympatrycznej z dodatkowym, mieszanym playbackiem zawierającym pierwszą część piosenki jednego gatunku z końcową drugiego i odwrotnie. Badane samce (T. chalcospilos) reagowały silnie tylko na własny gatunek, zupełnie jak w przypadku gołębi leśnych. Natomiast playback mieszanych śpiewów nie wywoływał mocnej reakcji, co świadczy o tym, że jedna część piosenki nie wystarcza by ptak rozpoznał ją jednoznacznie jako należącą do swojego gatunku. Ostatni eksperyment dotyka już problemu rozpoznawania osobniczego i został przeprowadzony T. brehmeri. Samcom zostały zaprezentowane playbacki sąsiadów oraz obcych ptaków z lokalnej populacji. Gołębie reagowały dużo silniej na playback obcego niż sąsiada, co pokazuje, że są w stanie rozpoznawać się indywidualnie i reagują zgodnie z hipotezą drogiego wroga. Podsumowując, turkaweczki tworzą grupę z podobną składnią śpiewu, jednak zawsze specyficzną gatunkowo i charakterystyką ukształtowaną zgodnie z preferencjami środowiskowymi i jego akustyką. Zbadane eksperymentalnie gatunki wykazują zachowania wskazujące, iż podczas interakcji terytorialnych są one zdolne do przetwarzania informacji związanych z kodowaniem tożsamości na różnych poziomach, co pomaga im w podejmowaniu optymalnych decyzji dotyczących obrony terytorium i wabienia partnerki. The song and other vocalisations of birds play an important role in many aspects of their daily lives but are particularly important in the context of mate attraction and territory defence. To fulfil these functions, song should enable birds to convey information about species identity and, at the same time, contain features that allow individual discrimination within a species. In my thesis, I have studied African doves of the Turtur genus, exploring their vocal repertoire, mainly in terms of species and individual recognition. To this purpose, I participated in field research in Nigeria, Mozambique, Ghana and Uganda between 2019 and 2023, collecting data on the vocalisations and other biological features of the Turtur doves. As this group of birds was not well studied, the first trips were mainly dedicated to collecting biometric data, blood and feather samples, as well as, observing the behaviour and recording the vocalisations of individuals from each species. These data allowed us to describe the phylogenetic relationships between the species, their morphological characteristics and habitat preferences, and – most of all - a complete description of within and- between species song variation. The analysis of the genetic material confirmed the assumed phylogenetic relationships between doves, in which two larger species preferring a forest habitat are more closely related to each other than to the remaining three species from more open areas, as also shown by the morphological data. Song analysis of all species showed shared two-part song structure, where in all species, the initial part is more diverse, quieter and has a high potential for encoding individual specific information. Conversely, the final part is more homogeneous in structure and louder across the genus, and carries over further distances, having more significant potential to encode information about the species. During the study's second phase, we conducted playback experiments to test some theoretical assumptions about species and individual recognition in the Turtur genus. In the first, we tested two forest species (T. brehmeri and T. tympanistria) living in sympatry and one of them (T. tympanistria) in an allopatric population. Both groups were introduced to playbacks with the song of a conspecific, a congeneric and a control. In the sympatric population, both tested species responded strongly only to the songs of their own species, whereas in the allopatric population, T. tympanistria males responded to the playback of both dove species. We conducted a similar experiment in two savannah species (T. afer and T. chalcospilos) living in sympatry with an additional playback containing the first part of the song from one species with the final part from the other, and vice versa. The tested males (T. chalcospilos) reacted strongly only to their own species, like forest doves. In contrast, the additional mixed playback did not elicit strong responses, indicating that one part of the song is insufficient for the bird to categorised the song as coming from its species. The last experiment addressed the problem of individual recognition and was conducted on the largest forest species (T. brehmeri). The males were presented with playbacks of songs from their neighbour and stranger birds of their species from the same population. Doves reacted stronger to the playback of strangers than neighbours, indicating – for the first time for doves - that also in this family, birds are able to discriminate between neighbours and strangers and behave according to the dear enemy hypothesis predictions. Summarising the results from the study presented in this thesis, wood doves of the genus Turtur share a song of a similar, two-part structure but with both species and individually specific phrases, and they are capable of processing this identity information during territorial interactions, which helps them to make optimal decisions regarding territory defence and mate attraction.
  • Item
    Charakterystyka działania wybranych glikoalkaloidów z rodziny Solanaceae na kluczowe procesy metaboliczne u chrząszcza Tenebrio molitor
    (2024) Winkiel, Magdalena Joanna; Słocińska, Małgorzata. Promotor; Chowański, Szymon. Promotor
    Środki ochrony roślin są stosowane w ogromnych ilościach do ograniczania populacji szkodników, co przyczynia się do zanieczyszczenia środowiska i stanowi zagrożenie dla innych organizmów. Związki pochodzenia roślinnego dają możliwość ograniczenia użycia pestycydów. Są to substancje biodegradowalne, bardziej bezpieczne w stosowaniu, a także stosunkowo łatwe i tanie w pozyskaniu. Glikoalkaloidy (GA) to wtórne metabolity roślinne, które wykazują znaczną aktywność biologiczną, także w organizmach owadów. Mechanizmy ich działania nie zostały jednak precyzyjnie poznane. Celem przedstawionej rozprawy doktorskiej było określenie wpływu wybranych GA na kluczowe procesy metaboliczne larw chrząszcza Tenebrio molitor. W tym celu przeprowadzono szereg badań, w których testowano wpływ solaniny, chakoniny i tomatyny oraz ekstraktu uzyskanego z liści pomidora. Analizowano efekty działania GA po ich aplikacji za pomocą iniekcji w dwóch stężeniach 10-8 i 10-5 M. Testowane tkanki izolowano po 2 i po 24 godzinach od aplikacji GA. Z racji funkcji troficznej, skupiono się na analizie zmian w obrębie jelita, ciała tłuszczowego i hemolimfy. Pozwoliło to również na określenie specyficzności tkankowej GA. Prace badawcze rozpoczęto od analizy zmian poziomu GA w poszczególnych tkankach w czasie, po ich wcześniejszej aplikacji na drodze iniekcji. Następnie określono wpływ testowanych związków na poziom substratów energetycznych (lipidów, węglowodanów i aminokwasów) w tkankach owada. Ponadto, dokonano pomiaru zmian poziomu ekspresji genów kodujących kluczowe enzymy szlaków metabolicznych: glikolizy (fosfofruktokinaza), cyklu Krebsa (syntaza cytrynianowa) i β-oksydacji kwasów tłuszczowych (dehydrogenaza hydroxyacylo-CoA), a także głównych białek antyoksydacyjnych (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza) i białek szoku cieplnego HSP70 po aplikacji GA. Dodatkowo, określono wpływ GA na aktywność wymienionych enzymów oraz proces peroksydacji lipidów. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że mechanizmy działania testowanych związków w tkankach mącznika różnią się w zależności od rodzaju i stężenia GA, czasu inkubacji oraz typu badanej tkanki. Związki te wpływają na poziom ekspresji genów i aktywność białek zaangażowanych w kluczowe ścieżki metaboliczne. Poza tym, GA zmieniają zawartość składników odżywczych w tkankach owadów, prawdopodobnie w wyniku zwiększonego zapotrzebowania energetycznego podczas wzmożonego procesu detoksykacji. Badane związki znacząco wpływają na metabolizm chrząszczy, co sugeruje możliwość ich potencjalnego zastosowania jako naturalnych bioinsektycydów. Plant protection products are used in huge quantities to reduce pest populations, which contributes to environmental pollution and poses a threat to other organisms. Plant-derived compounds offer an opportunity to reduce the use of pesticides. They are biodegradable, safer to use, easy and inexpensive to obtain. Glycoalkaloids (GA) are secondary plant metabolites that exhibit significant biological activity, also in insect organisms. However, their mechanisms of action have not been precisely studied. The aim of the presented PhD thesis was to determine the effects of selected GA on key metabolic processes in larvae of the beetle Tenebrio molitor. For this purpose, a series of experiments were carried out, in which solanine, chaconine, tomatine, and tomato leaf extract were tested at two concentrations, 10-8 and 10-5 M. The selected compounds were administered to larvae by injection. Tissues were isolated 2 and 24 hours after GA application. Tested samples were prepared separately from the gut, fat body and hemolymph to determine the tissue specificity of the observed effects, because of tropfic function of these tissues. The study began with quantitative analysis of GA over time after their injection. Subsequently, the effects of these compounds on nutrient levels (lipids, carbohydrates and amino acids) in the insect's tissues were determined. In addition, changes in the expression of genes encoding key enzymes of metabolic pathways: glycolysis (phosphofructokinase), Krebs cycle (citrate synthase) and fatty acid β-oxidation (hydroxyacyl-CoA dehydrogenase), as well as major antioxidant proteins (superoxide dismutase, catalase) and heat shock protein HSP70 after GA application were measured. In addition, the effect of GA on lipid peroxidation process and the catalytic activity of the mentioned enzymes was determined. Based on the results, it was found that the mechanisms of action of the tested compounds in mealworm tissues vary depending on the type and concentration of GA, incubation time and the type of tissue tested. These compounds regulate gene expression and activity of proteins involved in key metabolic pathways. Besides, GAs alter the nutrient content of insect tissues, probably as a result of increased energy requirements during detoxification. The tested compounds significantly affect beetle metabolism, suggesting their potential use as natural bioinsecticides.
  • Item
    Funkcje i mechanizmy wewnątrzgrupowej komunikacji i koordynacji śpiewu podczas obrony terytorialnej u kolektywnie rozmnażającego się gatunku ptaka, wąsala perełkowanego (Trachyphonus margaritatus)
    (2024) Issa, Mathieu Mahamoud; Osiejuk, Tomasz Stanisław. Promotor
    Zachowania kooperatywnesą istotną cechą gatunków zwierząt żyjących w grupach a ich zrozumienie nadal stanowii wyzwanie dla poznania ewolucji relacji społecznych i koordynacji zadań wykonywanych w obrębie grup społecznych. Osobniki, które chcą współpracować w celu wspólnego działania muszą komunikować się wzajemnie o swoich intencjach w efekcie dochodząc jakoś do porozumienia. W mojej pracy doktorskiej badałem rolę komunikacji wewnątrzgrupowej w inicjowaniu duetów ichórów, które są formą wspólnego popisu wokalnego, w którym dwa lub kilka osobników śpiewa razem w skoordynowany sposób, przekazując wspólny meta-sygnał. W latach 2019-2023 przeprowadziłem kilka sesji badań terenowych w Dżibuti, gdzie zbierałem dane o zachowaniach wokalnych i innych zachowaniach społecznych wąsala perełkowanego (Trachyphonus margaritatus), gatunku ptaka spoza tzw. ptaków śpiewających (Oscines), który żyje w parach bądź małych grupach społecznych i broniących całoroczne terytoria. Ponieważ zachowania społeczne i repertuar wokalny tego gatunku są słabo zbadane, pierwszym celem mojej pracy było zebranie podstawowych danych dotyczących zachowań społecznych i wokalnych. Do ich zbadania wykorzystałem pasywny monitoring akustyczny, który pozwolił mi na opis codziennej aktywności wokalnej oraz repertuaru wokalnego wąsali perełkowanych. Udało mi się zidentyfikować cztery różne wokalizacje używane podczas interakcji wewnątrz grupy. Odkryłem również, że różne grupy wąsali były aktywne wokalnie głównie rano a nawoływania spajające, służące podtrzymaniu spójności grypy, były często używane przed rozpoczęciem popisu wokalnego w postaci duetu lub chóru. W drugiej części mojego projektu badawczego zbadałem, w jaki sposób wąsale perełkowane inicjują swoje wspólne popisy wokalne. Wiadome już było, że wąsale perełkowane inicjują duety i chóry z pomocą tzw. „głosów przed-duetowych” (opisywanych również jako głosy „chewp”) podczas swego rodzaju „ceremonii powitania”. Jednak natura tych wokalizacji i ich funkcje nie były znane. Nagrywałem kamerą wideo pokazy wąsali w kilku grupach podczas eksperymentów z odtwarzaniem ich śpiewu. Dzięki temu udało mi się szczegółowo opisać, w jaki sposób używają one swoich wokalizacji. Zbadałem również możliwość istnienia sygnału o charakterze multimodalnym. Głosy przed-duetowe mogły być potencjalnie specyficznym sygnałem, który służy jako sygnał rekrutujący osobniki (do wspólnego działania), albo jako sygnał porozumienia osobników do wspólnego rozpoczęcia duetu lub chóru. Udało mi się odnaleźć dwa rodzaje takich wokalizacji, które nazwałem „high chewp” i „low chewp”. Osobnik będący liderem, a więc inicjujący duet lub chór, wydawał większą liczbę głosów high chewpniż osobniki, które za nim podążały i dołączały do zainicjowanego pokazu. Odkryłem również, że osobnik będący liderem, czasami łączył wydawanie dźwięków z chewp z przyjmowaniem postawy ze specyficzną pozycją ogona. Połączenie sygnału dźwiękowego i wizualnego, stanowiło wewnątrzgrupowy sygnał multimodalny, który był pokazywany w celu zainicjowania popisu w postaci duetu lub chóru. Trzecia część mojego projektu skupiała się na zagadnieniach związanych z kontekstem kolektywnych popisów wokalnych i mechanizmach koordynacji śpiewu duetujących osobników. W tym celu wykorzystałem pasywny monitoring akustyczny i eksperymenty z playbackiem, dzięki czemu uzyskałem dane o codziennej aktywności wokalnej poszczególnych grup w zależności od tego w jakim kontekście socjalnym wydają one głosy. Odkryłem, że większość kooperatywnych pokazówwokalnych wykonywanych przez 11 monitorowanych grup wąsali, była wykonana w kontekście interakcji wokalnej z innymi grupami. Wszystkie z 10 grup testowanych w eksperymentach z playbackiem, odpowiadało na niego w sposób wskazujący na jego znaczenie we wspólnej obronie terytorialnej. Wreszcie, badania nad mechanizmami koordynacji śpiewu w duetach u wąsali, nie przyniosły jednoznacznego dowodu wskazującego na interaktywne dopasowywanie śpiewu w czasie między osobnikami duetującymi. Takiedopasowywanie, pozwalałoby na zwalnianie bądź przyspieszanie tempa wspólnej wokalizacji, zgodnie z rytmem partnera. Ptaki jedynie reagowały na rozpoczynanie bądź kończenie śpiewu przez partnera. Podsumowując, wyniki moich badań jednoznacznie pokazują, że u badanego gatunku głosyspójności oraz głosychewpsłużą do inicjowania kolektywnego pokazu wokalnego. Cooperative behaviour is a prominent feature among group living species and continues to pose challenges to our understanding about the evolution of social relationships and task coordination between members of a same social group. Individuals who are willing to cooperate to achieve a joined action need to communicate their intentions and somehow make a common agreement. In my PhD work, I investigated the role of intra-group communication in the initiation of duet and chorus songs which are a form of collaborative acoustic display in which several individuals sing together in a coordinated manner to deliver one meta-signal. I conducted several fieldwork sessions in Djibouti between 2019-2023 to collect data about the vocal and other social behaviour of the Yellow-breasted barbet (Trachyphonus margaritatus), a non-oscine bird species that lives in pairs or small social group and defend a territory year-round. Since the social behaviour and the vocal repertoire of the species as poorly studied, the first aim of my work consisted of gathering data regarding the social and vocal behaviour. To do so, I used passive acoustic monitoring to study the daily calling activity of the barbets as well as the vocal repertoire. I could identify four distinct vocalisations used during within-group interactions. I also found that the different group of barbets were vocally active mainly in the morning, the cohesion calls which might serve to maintain group cohesiveness were often used before the start of a duet or chorus display. In the second part of my research project, I investigated how barbets initiate their communal vocal displays. It is known that the Yellow-breasted barbet initiates its duet and chorus songs with "pre-duet notes" (also described as "chewp" notes) during a kind of "greeting ceremony". However, the nature of these vocalisations and the functions were unknown. I recorded with a video camera several group displays of barbets during playback experiments, in order to describe in detail the way they use such chewp notes. I also investigated the possible existence of a multimodal signal. The pre-duet notes could be a specific signal that serves either as recruitment signal or as mutual agreement between individuals to start a duet or chorus song. I found two variations of such vocalisations: the high chewp and the low chewp. The leading individual who initiated a duet or chorus emitted a higher number of high chewp notes than the followers who joined the display initiated by the leader. I also found that the leading individual sometimes combined the emission of chewp notes with a specific tail posture. The combination of acoustic and visual signal constituted an intra-group multimodal signal that was displayed to initiate duet and chorus songs. The third part of the project focused more on the contexts of the emission of collective vocal displays and the mechanisms of song coordination between duetters. To do so, I used passive acoustic monitoring and playback experiments to monitor the daily vocal activity of different groups according to several social contexts. I found that most of the collective vocal displays given by the 11 groups monitored were emitted in the context of a between-group vocal interaction and that all the 10 groups tested with playback stimulations reacted which suggested a function in joint territorial defense. Finally, the investigation of the mechanisms of song coordination in duetting barbets revealed no clear evidence of interactive timing adjustments in a way that the duetters could accelerate or slow down their rhythm of singing according to their partner’s rhythmic variations. The birds simply reacted when the partner started and stopped singing. Overall, these results highlighted that in this group living bird species, group members actively communicate using cohesion calls and chewp notes to initiate a collective vocal display.
  • Item
    Rola tuneli przejściowych w funkcjonowaniu enzymów z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi
    (2024) Thirunavukarasu, Aravind Selvaram; Brezovsky, Jan. Promotor
    Enzymy z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi mają prowadzące do nich ścieżki, które nazywane są tunelami. Skupiając się na rodzinie enzymów hydrolaz i podkreślając znaczenie wody w tych tunelach, niniejsze badanie zapewnia cenny wgląd w ich funkcjonalne implikacje. Dzięki wykorzystaniu symulacji dynamiki molekularnej i adaptacyjnych technik próbkowania, stany konformacyjne systemów są dokładnie badane. W szczególności obliczenia tuneli prowadzących do miejsca aktywnego są przeprowadzane dla wszystkich ramek obszernej symulacji, co prowadzi do identyfikacji wcześniej nierozpoznanych tuneli. Śledząc ruch cząsteczek wody z objętości do określonego regionu (miejsca aktywnego) białka, określane są ścieżki transportu wykorzystywane przez enzym podczas symulacji. Aby ułatwić analizę ogromnych ilości danych związanych z tunelami i cząsteczkami wody, opracowano moduł Python o nazwie TransportTools. Moduł ten roku usprawnia analizę obszernych danych dotyczących tuneli i cząsteczek wody. Pomaga w ocenie wykorzystania cząsteczek wody, wydajności transportu i funkcjonalności w strukturach białkowych. Narzędzie to odkryło nowe tunele transportujące wodę w enzymach takich jak dehalogenaza haloalkanowa, zwiększając nasze zrozumienie dynamiki tuneli. Ponadto odkryto, że cząsteczki wody mogą skutecznie poruszać się w wąskich regionach tuneli poprzez interakcje wiązań wodorowych. Odkrycia te zostały potwierdzone poprzez porównanie hydrolazy epoksydowej typu dzikiego z jej mutantem E470G, w którym zaobserwowano wzrost wykorzystania alternatywnych tuneli w mutancie. Co więcej, wybór jawnych modeli wody, takich jak OPC, TIP3P i TIP4P-Ew, znacząco wpływa na wykorzystanie tuneli enzymatycznych przez cząsteczki wody. Zaobserwowane różnice między trzema modelami wody można przypisać różnicom w ich właściwościach dyfuzyjnych i rozkładach ładunku. W przypadku modelu TIP3P migracja wody była zauważalnie przyspieszona, transportując około 2,5- i 2,0-krotnie więcej cząsteczek wody niż w przypadku modeli OPC i TIP4P-Ew. Zjawisko to wynika przede wszystkim z zaobserwowanych krótszych czasów przejścia i większej liczby cząsteczek wody jednocześnie migrujących przez tunele przy zastosowaniu modelu TIP3P. Spójność tych wyników dla różnych enzymów, takich jak oksydaza alditolowa i cytochrom P450 2D6, wraz z geometrią tuneli, podkreśla ich szersze znaczenie. Podkreśla to znaczenie modelu wodnego dla dokładnych symulacji enzymów z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich cykli katalitycznych, projektowania enzymów i przewidywania czasów przebywania leków. The enzymes with buried active sites have pathways leading to them which are called tunnels. By focusing on the hydrolase family of enzymes and emphasizing the importance of water within these tunnels, this study provides valuable insights into their functional implications. Through the utilization of molecular dynamics simulations and adaptive sampling techniques, the conformational states of the systems are thoroughly investigated. Notably, the calculation of tunnels leading to the active site is conducted for all frames of the extensive simulation, leading to the identification of previously unrecognized tunnels. By tracking the movement of water molecules from the bulk to the defined region (active site) of the protein, the transport pathways employed by the enzyme during the simulation are determined. To facilitate the analysis of vast amounts of data related to tunnels and water molecules, a Python module called TransportTools is developed. The module streamlines the analysis of extensive tunnel and water molecule data. It aids in assessing water molecule utilization, transport efficiency, and functionality within protein structures. This tool has uncovered new water-transporting tunnels in enzymes like haloalkane dehalogenase, enhancing our understanding of tunnel dynamics. Additionally, it is discovered that water molecules can effectively navigate narrow regions within the tunnels through hydrogen bonding interactions. These findings are validated through a comparison between wild type epoxide hydrolase and its mutant E470G, where an increase in the utilization of alternate tunnels is observed in the mutant. Moreover, the choice of explicit water models such as OPC, TIP3P, and TIP4P-Ew significantly impacts the utilization of enzyme tunnels by water molecules. The observed differences between the three water models can be attributed to variations in their diffusion properties and charge distributions. With TIP3P model, water migration was noticeably accelerated, transporting about 2.5– and 2.0-times more water molecules than with OPC and TIP4P-Ew models, respectively. This phenomenon primarily arises from the observed quicker transit times and more water molecules concurrently migrating through tunnels when employing the TIP3P model. The consistency of these findings across various enzymes, such as alditol oxidase and cytochrome P450 2D6, along with tunnel geometries, highlights their broader relevance. This emphasizes water model importance for accurate simulations of enzymes with buried active sites which are critical for understanding their catalytic cycles, enzyme design, and predictions of drug residence times.
  • Item
    Różnice międzyosobnicze a pasożyty: wpływ zachowania, użytkowania przestrzeni i cech fizycznych żywiciela na liczebność ektopasożytów myszy leśnej (Apodemus flavicollis)
    (2024) Zduniak, Milena; Zwolak, Rafał. Promotor
    Dysertacja porusza temat różnic międzyosobniczych w dzikiej populacji myszy leśnych i ich wpływu na liczebność pasożytów zewnętrznych. Badania wykazały, że samce miały więcej kleszczy niż samice, lecz było to spowodowane różnicami w masie ciała, nie płci żywicieli. Ponadto, związek między eksploracją w otwartym polu, a wskaźnikami użytkowania przestrzeni uzyskanymi z danych z odłowów był bardziej złożony niż zakładały pierwotne przewidywania. Kuracja przeciwpasożytnicza skutecznie zmniejszyła liczebność ektopasożytów, lecz nie wpłynęła na eksplorację zwierząt w otwartym polu. Spośród wskaźników użytkowania przestrzeni tylko prawdopodobieństwo złowienia wzrosło w odpowiedzi na zastosowaną kurację sugerując działanie negatywnego sprzężenia zwrotnego. The dissertation explores the inter-individual traits of a wild population of yellow-necked mice and how they affect ectoparasite infestation. It found that male mice had more ticks than females, but this disparity was due to differences in host body mass rather than sex itself. Moreover, the relationship between exploration in the open field and trapping-derived indices of space use was more complex than initially predicted. The antiparasitic treatment effectively reduced ectoparasite abundance, but it did not affect open field exploration. Among space use indices, only trappability increased in response to the antiparasitic treatment, suggesting the existence of negative feedback.
  • Item
    Poszukiwanie markerów starzenia się niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis
    (2024) Nagwan, Amit Kumar; Kmita, Hanna. Promotor; Kaczmarek, Łukasz. Promotor
    Zakłada się, że starzenie się jest nieuniknione, nieodwracalne i postępujące, ale dostępne dane wskazują, że starzenie się niesporczaków może być opóźnione przez kryptobiozę. Możliwość tę uwzględnia hipoteza Śpiącej Królewny. Weryfikacja tej hipotezy wymaga zastosowania wielopoziomowych markerów starzenia się niesporczaków. Dlatego celem tej pracy doktorskiej było wskazanie potencjalnych markerów starzenia się niesporczaków. Aby osiągnąć ten cel, przeanalizowano dostępne publikacje pod względem możliwych markerów i opracowano odpowiedni model do ich eksperymentalnej walidacji, obejmujący samice i samce niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis w różnym wieku. Wyniki pozwoliły na wskazanie następujących markerów starzenia się niesporczaków: żywotność, średnia liczba złożonych jaj przez samicę, przeżywalność warunków ekstremalnych (tj. anhydrobioza i pole hipomagnetyczne), poziom potencjału błony wewnętrznej mitochondriów (Δψ ) i poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS). Weryfikacja przydatności wymienionych markerów może przyczynić się do wykorzystania niesporczaków także jako organizm modelowy w biologii starzenia. Wraz z weryfikacją hipotezy Śpiącej Królewny może to przyczynić się do opracowania strategii przeciwstarzeniowych i skutecznych rozwiązań dotyczących konserwacji materiałów biologicznych. Niemniej jednak uzyskane wyniki należy poddać dalszej weryfikacji w odniesieniu do innych dwupłciowych gatunków niesporczaków, co pozwoli na lepsze zrozumienie obserwowanych różnic międzypłciowych. It is assumed that aging is inevitable, irreversible, and progressive but available data indicate that tardigrade aging might be delayed by cryptobiosis. The possibility is addressed by the Sleeping Beauty hypothesis. However, the hypothesis verification requires multilevel markers of tardigrade aging. Therefore, the aim of the thesis was to indicate potential tardigrade aging markers. To implement the aim available relevant papers were searched for the putative markers and suitable tardigrade model comprising Paramacrobiotus experimentalis females and males of different age was developed for the markers validation. The results allowed for indication of the following tardigrade aging markers: the vitality rate, average number of laid eggs per female, survival of the extreme conditions (i.e., anhydrobiosis and hypomagnetic field), the level of the mitochondrial inner membrane potential (Δψ) and the level of intracellular reactive oxygen species (ROS). Verification of usability of the mentioned markers could open the opportunity for tardigrades to be also a model organism for aging biology. Together with verification of the Sleeping Beauty hypothesis, this might contribute to developing of anti-aging strategies and efficient approaches for preservation of biological materials. Nevertheless, the obtained results should be further verified for other dioecious tardigrade species which will allow for a better understanding of the observed differences between the sexes.
  • Item
    Symulacje procesów wiązania ligandów w białkach
    (2024) Sarkar, Dheeraj Kumar; Brezovsky, Jan. Promotor
    Procesy biologiczne są wewnętrznie regulowane przez małe cząsteczki i ich interakcje, szczególnie w postaci kompleksów białko-ligand. Transport ligandów w białkach odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w transdukcji sygnału, katalizie enzymów oraz transporcie składników odżywczych i metabolitów. Dlatego zrozumienie procesów wiązania ligandu ma ogromne znaczenie dla opartego na strukturze projektowania leków i inżynierii ulepszonych katalizatorów enzymatycznych. W szczególności znaczna część enzymów ma swoje aktywne miejsce zakopane w głębokich zagłębieniach, a wyzwania polegają na udanym uchwyceniu procesów wiązania i niewiążenia ligandu, ponieważ dostęp do tych wnęk przez małe cząsteczki jest ogólnie ograniczony przez tunele białkowe i bramy. Zmiany w tunelach białkowych często mogą prowadzić do zmiany aktywności, selektywności, rozwiązłości i stabilności. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, w moim doktoracie. w badaniach przyczyniłem się do zbadania właściwości termicznych i kinetycznych poprzez ocenę wykorzystania małych cząsteczek przez tunele transportowe w białkach z zakopanymi aktywnymi miejscami. Zastosowano metody zwiększonej dynamiki molekularnej (MD), aby skutecznie ocenić termodynamikę i kinetykę procesów wiązania ligandu, jednocześnie rozumiejąc leżące u podstaw mechanizmy molekularne. Teza składa się z trzech rękopisów. Pierwsza część pracy koncentruje się na opracowaniu metody poprzez zaprojektowanie opartych na wiedzy schematów siewu w celu skutecznego badania procesów interakcji ligandu w dehalogenazie haloalkanu. Metoda wykorzystuje adaptacyjne symulacje próbkowania do wysokoprzepustowego próbkowania zjawisk wiążących, kierowany przez modele stanu Markowa (MSM) w celu generowania znaczących modeli kinetycznych opisujących stany związane z białkami-ligandem i niezwiązane stany długowieczne oraz ich procesy konwersji. W drugiej części rozprawy masowe wykorzystanie tuneli molekularnych w celu ułatwienia transportu ligandu zostało ocenione i określone ilościowo, aby uzyskać bardziej szczegółowy wgląd w procesy transportu ligandu, pokazując zastosowanie opracowanego przez siebie narzędzia programowego. Wreszcie trzecia część pracy dotyczy dostępności aktywnego miejsca cytochromu c dla zatłoczonych hydrotropów oraz roli ich wiązania ze stabilnością termiczną tego enzymu. Proces badano w dwóch temperaturach obejmujących trzy różne kompozycje hydrotropów, stosując adaptacyjne symulacje próbkowania prowadzone przez modele Markowa. Ujawniono kilka spostrzeżeń na temat roli rozpuszczalników hydrotropowych w zapewnianiu stabilności funkcjonalnym częściom cytochromu c i regulacji dynamiki stanów otwartych i zamkniętych. Ogólnie rzecz biorąc, teza reprezentuje zastosowanie, ocenę, oraz opracowanie wysokoprzepustowego protokołu symulacje wykorzystującego kompleksy białko-ligand do badania procesów wiązania ligandu i jego roli w lepszym zrozumieniu sprzężenia między dynamiką a funkcją enzymów. Biological processes are intrinsically regulated by small molecules and their interactions, particularly in the form of protein-ligand complexes. The transport of ligands in proteins plays a crucial role in many biological processes, including signal transduction, enzyme catalysis and the transport of nutrients and metabolites. Therefore, understanding ligand binding processes is of great importance for the structure-based design of drugs and the engineering of improved enzyme catalysts. Notably, a significant fraction of enzymes have their active site buried in deep cavities, and the challenges lie in successfully capturing the ligand binding and unbinding processes, as access to those cavities by small molecules is generally restricted by protein tunnels and gates. Changes in protein tunnels can often lead to altered activity, selectivity, promiscuity, and stability. To address these shortcomings, in my Ph.D. research, I contributed to investigating thermal and kinetic properties by assessing the utilization of small molecules via transport tunnels in proteins with buried active sites. Enhanced molecular dynamics (MD) methods were applied to effectively assess the thermodynamics and kinetics of ligand binding processes while understanding the underlying molecular mechanisms. The thesis consists of three manuscripts. The first part of the thesis focuses on developing a method by designing knowledge-based seeding schemes to study ligand interaction processes in haloalkane dehalogenase effectively. The method employs adaptive sampling simulations for high-throughput sampling of binding phenomena, guided by Markov State Models (MSMs) to generate meaningful kinetic models describing protein-ligand bound and unbound long-lived states and their interconversion processes. In the second part of the thesis, the massive use of molecular tunnels to facilitate ligand transport was evaluated and quantified to gain more detailed insights into ligand transport processes, showcasing the applicability of the in-house developed software tool. Finally, the third part of the thesis deals with the accessibility of the Cytochrome c active site for crowded hydrotropes and the role of their binding on the thermal stability of this enzyme. The process was studied at two temperatures involving three different compositions of the hydrotropes using adaptive sampling simulations guided by Markov models. Several insights were revealed into the role of hydrotropic solvents in providing stability to functional parts of Cytochrome c and regulating the dynamics of the open and closed states. Overall, this thesis represents the application, evaluation, and development of a high-throughput simulations protocol using protein-ligand complexes to study ligand binding processes and its role in improving the understanding of the coupling between the dynamics and function of enzymes.
  • Item
    Poszukiwanie markerów starzenia się niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis
    (2024) Nagwani, Amit Kumar; Kmita, Hanna. Promotor; Kaczmarek, Łukasz. Promotor
    Zakłada się, że starzenie się jest nieuniknione, nieodwracalne i postępujące, ale dostępne dane wskazują, że starzenie się niesporczaków może być opóźnione przez kryptobiozę. Możliwość tę uwzględnia hipoteza Śpiącej Królewny. Weryfikacja tej hipotezy wymaga zastosowania wielopoziomowych markerów starzenia się niesporczaków. Dlatego celem tej pracy doktorskiej było wskazanie potencjalnych markerów starzenia się niesporczaków. Aby osiągnąć ten cel, przeanalizowano dostępne publikacje pod względem możliwych markerów i opracowano odpowiedni model do ich eksperymentalnej walidacji, obejmujący samice i samce niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis w różnym wieku. Wyniki pozwoliły na wskazanie następujących markerów starzenia się niesporczaków: żywotność, średnia liczba złożonych jaj przez samicę, przeżywalność warunków ekstremalnych (tj. anhydrobioza i pole hipomagnetyczne), poziom potencjału błony wewnętrznej mitochondriów (Δψ ) i poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS). Weryfikacja przydatności wymienionych markerów może przyczynić się do wykorzystania niesporczaków także jako organizm modelowy w biologii starzenia. Wraz z weryfikacją hipotezy Śpiącej Królewny może to przyczynić się do opracowania strategii przeciwstarzeniowych i skutecznych rozwiązań dotyczących konserwacji materiałów biologicznych. Niemniej jednak uzyskane wyniki należy poddać dalszej weryfikacji w odniesieniu do innych dwupłciowych gatunków niesporczaków, co pozwoli na lepsze zrozumienie obserwowanych różnic międzypłciowych. It is assumed that aging is inevitable, irreversible, and progressive but available data indicate that tardigrade aging might be delayed by cryptobiosis. The possibility is addressed by the Sleeping Beauty hypothesis. However, the hypothesis verification requires multilevel markers of tardigrade aging. Therefore, the aim of the thesis was to indicate potential tardigrade aging markers. To implement the aim available relevant papers were searched for the putative markers and suitable tardigrade model comprising Paramacrobiotus experimentalis females and males of different age was developed for the markers validation. The results allowed for indication of the following tardigrade aging markers: the vitality rate, average number of laid eggs per female, survival of the extreme conditions (i.e., anhydrobiosis and hypomagnetic field), the level of the mitochondrial inner membrane potential (Δψ) and the level of intracellular reactive oxygen species (ROS). Verification of usability of the mentioned markers could open the opportunity for tardigrades to be also a model organism for aging biology. Together with verification of the Sleeping Beauty hypothesis, this might contribute to developing of anti-aging strategies and efficient approaches for preservation of biological materials. Nevertheless, the obtained results should be further verified for other dioecious tardigrade species which will allow for a better understanding of the observed differences between the sexes.
  • Item
    Rodzaj Paramacrobiotus(Tardigrada): taksonomia integratywna, biogeografia i oraz wpływ czynników stresowych na wybrane gatunki
    (2023) Kayastha, Pushpalata; Kaczmarek, Łukasz. Promotor; Mioduchowska, Monika. Promotor pomocniczy
    Paramacrobiotus stanowi jeden z rodzajów należących do typu Tardigrada (grupy zwierząt potocznie nazywanej niesporczakami lub misiami wodnymi). Rodzaj ten został utworzony ponad dekadę temu. Poprzednio, przedstawiciele tego rodzaju byli zaliczani do kompleksu richtersi-areolatus wewnątrz rodzaju Macrobiotus, by w końcu, przy pomocy technik analizy molekularnej i filogenetycznej zostać wyodrębnionymi jako nowy rodzaj. Jak sugeruje tytuł, celem niniejszej rozprawy były badania rodzaju Paramacrobiotus, z uwzględnieniem zastosowania taksonomii integratywnej w opisie nowych dla wiedzy gatunków, ustalenie potencjalnych zasięgów występowania gatunków partenogenetycznych oraz sprawdzenie zasadności hipotezy „wszystko jest wszędzie” względem badanych gatunków, zbadanie wpływu czynników stresowych na gatunek Pam. experimentalis, badania nad rozmieszczeniem poszczególnych gatunków, badania mikrobiomu, a także przyjrzenie się historiom życiowym poszczególnych gatunków z uwzględnieniem zdolności do anhydrobiozy. Ponadto sporządzony został nowy klucz diagnostyczny dla rodzaju Paramacrobiotus wykorzystujący cechy morfologiczne i morfometryczne osobników dorosłych i jaj. Wykorzystując techniki taksonomii integratywnej (klasyczna morfologia i morfometria oraz badania genetyczne), nowy gatunek, Pam. gadabouti, został opisany na podstawie materiału pochodzącego z Ribeiro Frio na Maderze. Ponadto, eksperymentalnie zbadano sposób rozmnażania się tego gatunku, co potwierdziło wzajemne powiązania między szerokim rozprzestrzenieniem a partenogenezą. W kolejnej pracy przeanalizowano rozmieszczenie oraz zróżnicowanie genetyczne dwóch partenogenetycznych gatunków z rodzaju Paramacrobiotus, tj. Pam. gadabouti oraz Pam. fairbanksi potwierdzając prawdziwość hipotezy „wszystko jest wszędzie” przynajmniej dla niektórych gatunków niesporczaków. Modelowanie niszy środowiskowych wykonane przy użyciu narzędzia MaxEnt, potwierdza szeroki zasięg obydwu partenogenetycznych gatunków. W kolejnej publikacji zbadano przeżywalność niesporczaków z gatunku Pam. experimentalis, wystawianych na działanie różnych stężeń (0,25%; 0,50% oraz 1,00%) nadchloranu magnezu (uwzględniając stężenia zaobserwowane w marsjańskim regolicie) w dwóch różnych przedziałach czasowych (24h i 72h). W próbach, w których osobniki zostały poddane 24-godzinnej ekspozycji, kolejno 33,3%; 16,7% oraz 0% osobników pozostało aktywnych w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00%. Jednakże, ponad 75% z nich powróciło do stanu aktywnego po przeniesieniu ich do medium hodowlanego (93,3%; 76,7% oraz 86,7% osobników w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00%). W próbach, w których osobniki zostały poddane 72-godzinnej ekspozycji, kolejno 30,0%; 26,7% oraz 0% osobników pozostało aktywnych w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00%. Po przeniesieniu ich do medium hodowlanego kolejno 83,3%; 86,7% oraz 10,0% osobników w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00% powróciło do stanu aktywnego. W następnej pracy zbadano zmiany w ultrastrukturze komórek spichrzowych zarówno u aktywnych osobników, jak i u osobników w anhydrobiozie. Zbadano też poziom syntezy białek szoku cieplnego (Hsp27, Hsp60 oraz Hsp70) u aktywnych osobników Pam. experimentalis wystawionych na podwyższoną temperaturę (35 °C, 37 °C, 40 °C i 42 °C) przez pięć godzin, w porównaniu do optymalnej temperatury hodowlanej (20 °C). Pojedyncze komórki spichrzowe z grupy kontrolnej, znajdowały się w jamie ciała, pośród narządów wewnętrznych, przyjmując kuliste i ameboidalne kształty. Niewielkie, choć zauważalne zmiany w mitochondriach zostały zaobserwowane u osobników aktywnych wystawionych na temperaturę 35 °C. Znaczące zmiany w ultrastrukturze komórek spichrzowych zaobserwowane zostały u osobników poddanych temperaturze 37 °C. Zaobserwowano u nich liczne, uszkodzone mitochondria z zauważalnym zanikiem grzebieni oraz pojawieniem się struktur autofagicznych. Jeszcze więcej zmian zaobserwowano w temperaturze 40 °C, objawiających się nieregularnym kształtem komórek spichrzowych, uszkodzeniami organelli komórkowych oraz zwiększoną obecnością ciał autofagicznych i autolizosomów w mitochondriach. Jednakże najbardziej drastyczne zmiany zaobserwowano w 42 °C, gdzie nastąpiła pełna degradacja komórek i organelli, wskazująca na wystąpienie martwicy, do poziomu utrudniającego rozpoznanie komórek. Jednocześnie, osobniki w anhydrobiozie, poddane działaniu podwyższonej temperatury, nie wykazywały jakichkolwiek negatywnych zmian w komórkach spichrzowych na poziomie ultrastrukturalnym. Spośród pięciu zastosowanych w badaniu temperatur, trzy uznane za najważniejsze zostały wybrane (20 °C – optymalna temperatura do hodowli, 35 °C – najwyższa temperatura, po której nastąpił powrót osobników do aktywności oraz 42 °C – gdzie zaobserwowana została pełna martwica) i wykorzystane do określenia poziomów białek szoku cieplnego (Hsp27, Hsp60 oraz Hsp70) w aktywnych osobnikach. Wszystkie próbki wskazywały na wyraźny wzrost poziomu ekspresji białek wraz ze wzrostem temperatury. W ostatniej pracy składającej się na rozprawę doktorską zebrano całkowitą dostępną wiedzę na temat rodzaju Paramacrobiotus. Podsumowując więc, do rodzaju Paramacrobiotus należy obecnie 45 gatunków (wliczając w to Pam. gadabouti dodany w ramach niniejszej pracy), które można znaleźć na całym świecie, popierając tezę, że rodzaj ten jest kosmopolityczny. W rodzaju występują zarówno partenogenetyczne, jak i obupłciowe gatunki, wykazujące zarówno krótką jak i długą długość życia. Gatunki w tym rodzaju mogą być wszystkożerne (jednak z przewagą drapieżników), a odżywiają się między innymi, cyjanobakteriami, algami, grzybami, wrotkami, nicieniami oraz niesporczakami. Gatunki z tego rodzaju charakteryzują się dość dobrą zdolnością do kryptobiozy, dzięki czemu często stanowią obiekt badań w pracach nad anhydrobiozą. Paramacrobiotus is one of the genera of the phylum Tardigrada (commonly referred as water bears). This genus was erected more than a decade ago. Previously all representatives of this genus were included in the richtersi-areolatus complex within the genus Macrobiotus, but with the help of molecular and phylogenetic analysis, this new genus was identified and established. As the title of thesis suggests, the goal of this dissertation was the overall study of the genus Paramacrobiotus, including: incorporating integrative taxonomy in new species descriptions, working out the distribution patterns of parthenogenetic Pramacrobiotus species, testing if the ‘everything is everywhere’ hypothesis is true for them, testing the influence of different types of stressors on the species Pam. experimentalis, assessing biogeography, distribution, microbiome, reproduction, feeding behaviour, life history, Wolbachia endosymbiont identification and cryptobiotic abilities of the species from the genus Pramacrobiotus and providing a new diagnostic key for the genus using morphological and morphometric characters of adults and eggs. Using an integrative taxonomy approach (classical morphology and morphometry, as well as, genotypic using DNA barcodes and phylogenetic tree), a new species: Pam. gadabouti was described from a moss sample collected in Ribeiro Frio, Madeira. Furthermore, the mode of reproduction of this species was studied experimentally, which corroborates the interrelatedness between wide distribution and parthenogenesis. In the subsequent paper constituting the doctoral dissertation, two parthenogenetic species of the Paramacrobiotus, i.e., Pam. gadabouti and Pam. fairbanksi were analysed to study the distribution, as well as genetic variability which showed that the ‘everything is everywhere’ hypothesis is true for, at least, some tardigrade species. Environmental niche modelling performed using MaxEnt supports the wide distribution of these two parthenogenetic species. In the next publication, survivability of the Pam. experimentalis was tested at various concentrations (0.25%, 0.50% and 1.00%) of magnesium perchlorates (in range with the concentration present in Martian regolith) for two different time points (24h and 72h). In experiments where specimens were exposed to 24h time period, 33.3%, 16.7% and 0% were active in 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively. However, more than 75% returned to activity after transferring them to the culture medium (93.3%, 76.7% and 86.7% of specimens exposed to 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively). In experiments where specimens were exposed to 72h time period, 30.0%, 26.7% and 0% were active in 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively and after transferring them to the culture medium, 83.3%, 86.7% and 10.0% of specimens exposed to 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively, returned to activity. In the following paper constituting the doctoral dissertation, changes in ultrastructure for both active animals and desiccated tuns, as well as levels of heat shock proteins (Hsp27, Hsp60 and Hsp70) in active animals of Pam. experimentalis were studied when exposed at higher temperatures (35 °C, 37 °C, 40 °C, and 42 °C) for 5 hours, compared to optimal temperature (20 °C). Isolated storage cells from the control group persisted in the body cavity among internal organs in an amoeboid or spherical shape. Small, but visible changes were observed in specimens exposed to 35°C in the form of alterations in the mitochondria. Significant ultrastructural changes were observed in storage cells of specimens exposed to 37 °C. There were multiple deteriorating mitochondria with the loss of its cristae and there was a presence of autophagic structures. The level of changes increased at 40°C, with the irregular and shrunken shape of storage cells, deteriorated cell organelles and mitochondria with a higher number of autophagosomes and autolysosomes. Most drastic changes were observed at 42 °C, with full degeneration of cells and organelles showing signs of necrosis, making even cell identification difficult. However, when exposed to higher temperatures, tuns exhibited absolutely no differences from the control group. Out of five temperatures tested, the three deemed most important were selected (20 °C – optimum temperature, 35 °C – the highest temperature from which the return to activity was observed and 42 °C – where full necrosis was observed) and used for quantification of heat shock proteins (Hsp27, Hsp60 and Hsp70) in active specimens. All of them showed significant upregulation with the increase of the temperature. In the last paper, all available information on the genus Paramacrobiotus were summarized. Thus, in summary, the genus Paramacrobiotus currently includes 45 species (including Pam. gadabouti added as a part of the present thesis). The species of this genus can be found everywhere throughout the globe, supporting the statement that the genus is cosmopolitan. Both dioecious and unisexual species are present in the genus, with both long and short lifespan. The species in this genus are generally carnivorous with their food preference, including certain rotifers, nematodes and juvenile tardigrades. However, it was reported that they could also feed on cyanobacteria, algae, and fungi. The species generally have a good affinity for cryptobiosis, which is why multiple studies involving anhydrobiosis have been performed to date using specimens of various species of the Paramacrobiotus.
  • Item
    Alokacja zasobów rośliny wieloletniej Ophioglossum vulgatum L. (Psilotopsida) w zróżnicowanych warunkach środowiska
    (2023) Jędrzejczak, Natalia; Celka, Zbigniew. Promotor
    Teoria alokacji zasobów ukazuje jak osobniki pod wpływem ograniczeń i kompromisów dysponują ograniczoną ilością energii i czasu na procesy życiowe. Praca doktorska jest eksperymentalną próbą sprawdzenia, jak kształtuje się alokacja zasobów u paproci (Ophioglossum vulgatum) pod wpływem czynników abiotycznych (warunki glebowe i świetlne) oraz biotycznych (wpływ konkurentów i roślinożerców) i jak czynniki te wpływają na rozkład zasobów na dwa istotne procesy, tj. wzrost części asymilacyjnej i rozmnażanie za pomocą zarodników. W ramach eksperymentu założono powierzchnię badawczą w kompleksie łąk i torfowisk w okolicach Gniezna, na której wykonywano zabiegi z udziałem ramet nasięźrzała (ucinane ramet bez koszenia roślin towarzyszących, koszenie roślin towarzyszących bez ucinania ramet, brak koszenia i ucinania, koszenie i ucinanie wszystkich). Wykonano także badania glebowe, warunków świetlnych oraz 7 parametrów biometrycznych nasięźrzała. Stwierdzono liczne zależności, m.in. pomiędzy wilgotnością, światłem i presją roślinożerców (imitowaną zabiegami ucinania ramet), a wielkością blaszki liściowej i liczbą zarodni; występowaniem dominujących bylin (m.in. Carex acutiformis, Cirsium arvense i Phalaris arundinacea), a parametrami części trofofilowej lub sporofilowej nasięźrzała. Wykonane badania dostarczyły ważnych wyników do poznania ekologii ginącego gatunku ukazując kondycję jego populacji w zmieniających się warunkach środowiska. The resource allocation theory indicates how individuals allocate the limited energy and time resources into life processes under the influence of limitations and compromises. The PhD thesis is an experimental attempt to determine how the available resources are allocated in a fern (Ophioglossum vulgatum) under the influence of abiotic factors (soil and light conditions) as well as biotic ones (impact of plant competitors and herbivores) and how these factors affect resource allocation between 2 key processes, i.e. growth of the photosynthetic part and reproduction by means of spores. The experiment was conducted in 10 transects located in a complex of meadows and peatlands near Gniezno (NW Poland). Effects of 4 treatments were compared: (1) cutting the fern ramets without cutting the accompanying plants; (2) cutting the accompanying plants without cutting the ramets; (3) no cutting; and (4) cutting of all plants. The study included also measurements of soil parameters, light conditions, and 7 biometric parameters of the fern. Many correlations were detected, e.g. between soil moisture content, light intensity, or grazing by herbivores (simulated by cutting the ramets) and leaf blade size or number of sporangia; and between the presence of dominant perennials (e.g. Carex acutiformis, Cirsium arvense or Phalaris arundinacea) and parameters of the trophophore or sporophore. The research has provided important results, enriching our knowledge of ecology of a threatened species, showing its condition in varied environmental conditions.
  • Item
    Przystosowania metaboliczne Phytophthora infestans (Mont.) de Bary do stresu nitro-oksydacyjnego
    (2023) Gajewska, Joanna; Arasimowicz-Jelon, Magdalena. Promotor
    Celem badań była charakterystyka zmian metabolicznych u patogenicznego lęgniowca Phytophthora infestans w odpowiedzi na stres nitro-oksydacyjny indukowany podczas interakcji z mikrośrodowiskiem rośliny-gospodarza i niezależnie środowiskiem wzbogaconym w metal ciężki. Badania prowadzono na dwóch izolatach tj., awirulentnym i wirulentnym względem odmiany ziemniaka Sarpo Mira. W celu indukcji stresu nitro-oksydacyjnego patogen rósł w obecności jonów kadmu (Cd) a aby zaindukować stres nitrozacyjny patogen rósł w obecności donorów reaktywnych form azotu (RFA). Analizy w pierwszym etapie wykazały, że Cd hamował wzrost vr P. infestans, co było skorelowane ze wzmożonym generowaniem reaktywnych form tlenu (RFT) i RFA w strukturach patogena oraz zmianami w puli nitro-oksydacyjnych modyfikacji kwasów nukleinowych i białek. Ponadto dysmutaza ponadtlenkowa i katalaza były zaangażowane w unieczynnianie RFT, a indukowane Cd zmiany nitro-oksydacyjne skutkowały wzrostem patogeniczności vr P. infestans. W kolejnym etapie wykazano, że P. infestans ma wysoki próg tolerancji względem RFA oraz po raz pierwszy u lęgniowców wykazano, że RFA podlegają detoksykacji z udziałem systemu antynitrozacyjnego, obejmującego dioksygenazę tlenku azotu, peroksyredoksynę 2 i reduktazę S-nitrozoglutationu. Wyniki wskazują na wysoką plastyczność P. infestans i przystosowanie metaboliczne do bytowania w niesprzyjających warunkach nitro-oksydacyjnych. Indukcja systemów antyoksydacyjnych i antynitrozacyjnych, umożliwia patogenowi przetrwanie w otoczeniu wzbogaconym w Cd oraz w mikrośrodowisku rośliny-gospodarza. The aim of the study was to characterize metabolic changes in the pathogenic oomycete Phytophthora infestans in response to the nitro-oxidative stress induced during the interaction with the host plant microenvironment and independently with the heavy metal enriched environment. Experiments were conducted on two isolates i.e. avirulent and virulent in relation to the potato cv Sarpo Mira. To induce the nitro-oxidative stress the pathogen grew in the presence of cadmium (Cd), while to induce nitrosative stress the pathogen grew in the presence of reactive nitrogen species (RNS) donors. The first stage of the study showed that Cd inhibited P. infestans growth what was correlated with enhanced generation of RNS and reactive oxygen species (ROS) in the pathogen structures, as well as changes in the pool of nitro-oxidative modification of nucleic acids and proteins. Moreover, sodium dismutase and catalase were involved in ROS detoxification and Cd-dependent nitro-oxidative changes resulted in increased vr P. infestans pathogenicity. The next part of the study showed that P. infestans has high tolerance threshold to RNS and for the first time in oomycetes it was documented that RNS are deactivated by an anti-nitrosative system including nitric oxide dioxygenase, peroxiredoxin 2 and S-nitrosoglutathione reductase. The obtained results show high plasticity of P. infestans and metabolic adjustment to survive under adverse nitro-oxidative conditions. The induction of anti-oxidative and anti-nitrosative systems allows the pathogen to survive in an environment enriched with Cd and in the host plant microenvironment.
  • Item
    Filogenetyczne i funkcjonalne analizy genów kodujących czynniki transkrypcyjne SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE u wątrobowca Marchantia polymorpha
    (2023) Alisha, Alisha; Szweykowska-Kulińska, Zofia. Promotor
    Czynniki transkrypcyjne z rodziny SPL, SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE, stanowią zróżnicowaną funkcjonalnie grupę białek, które kontrolują szereg podstawowych aspektów wzrostu i rozwoju roślin. Ponieważ geny SPL są specyficzne dla roślin, stąd konieczne jest zrozumienie ich funkcji wśród przedstawicieli żyjących linii roślin lądowych, aby zrozumieć ich ewolucję. W pierwszej części mojej pracy doktorskiej zajęłam się analizą filogenetyczną w celu zbadania relacji między członkami rodziny SPL przedstawicieli wszystkich linii mszaków: dwóch gatunków glewików, Anthoceros agrestis i A. punctatus, wątrobowca Marchantia polymorpha i mchu Physcomitrium patens, oraz rośliny okrytozałążkowej Arabidopsis thaliana. Na podstawie analizy filogenetycznej, białka SPL sklasyfikowano w czterech grupach filogenetycznych. Zaobserwowałam ponadto, że członkowie rodziny SPL w tej samej grupie posiadają podobne struktury genów i podobny zestaw domen białkowych, co może potencjalnie wskazywać na pełnienie podobnych funkcji. Przeprowadzone badania wykazały, że podobnie jak M. polymorpha, przedstawiciele glewików również posiadają \ tylko czterech członków w rodzinie SPL, co stanowi najprostszy zestaw genów SPL wśród roślin lądowych. W drugiej części mojej pracy doktorskiej wykorzystałam szereg narzędzi molekularnych w celu określenia funkcji genów MpSPL3 i MpSPL4 z modelowego gatunku wątrobowca, M. polymorpha. Analiza aktywności transkrypcyjnej promotorów in planta badanych genów przy użyciu genu reporterowego β-glukuronidazy w połączeniu z analizą RT-qPCR wykazała, że oba geny ulegają ekspresji zarówno podczas wegetatywnej jak i reprodukcyjnej fazy cyklu życiowego M. polymorpha. Następnie, w celu uzyskania roślin z wyłączoną funkcją genu MpSPL3 lub MpSPL4 zastosowano podejście CRISPR/Cas9. Otrzymane mutanty ∆Mpspl3ge charakteryzowały się zredukowaną wielkością i kształtem plech oraz opóźnionym wzrostem w porównaniu do roślin typu dzikiego. Co ciekawe, mutanty ∆Mpspl4ge wykazały jeszcze silniejszy fenotyp niż rośliny ∆Mpspl3ge, gdyż rośliny te rosły jako masy komórkowe bez charakterystycznej dla Marchantia budowy plechy. Ponieważ w przypadku obu genów MpSPL utrata ich funkcji spowodowało bardzo silne zaburzenie rozwoju wątrobowca, w kolejnym podejściu zastosowałam sztuczne mikroRNA w celu otrzymania roślin z obniżoną ekspresją badanych genów. W przypadku obu genów, mutanty otrzymane za pomocą sztucznego mikroRNA wykazały opóźnienie wzrostu podczas wegetatywnej fazy cyklu. Co więcej, wytwarzanie gametangioforów zostało całkowicie zablokowane w przypadku silnie obniżonej ekspresji genu MpSPL3, podczas gdy obniżenie ekspresji MpSPL4 spowodował opóźnioną produkcję archegonioforów o zmienionej morfologii w porównaniu do roślin typu dzikiego. Dlatego właściwy poziom ekspresji genów MpSPL3 i MpSPL4 jest niezbędny dla rozwoju organów rozmnażania płciowego. W celu sprawdzenie efektu nadprodukcji białek MpSPL3 i MpSPL4 na rozwój M. polymorpha, przygotowałam rośliny transgeniczne z nadekspresją obu genów. Wstępna analiza roślin z nadekspresją genu MpSPL3 nie wykazała zmian w ich fenotypie podczas wegetatywnej fazy wzrostu w porównaniu do roślin typu dzikiego. Z kolei nadekspresja genu MpSPL4 spowodowała zmiany w morfologii plech, które były mniejsze i węższe w porównaniu do roślin typu dzikiego oraz wytwarzały powiększone miseczkowate zbiorniki produkujące wegetatywne rozmnóżki. Podsumowując, przedstawione wyniki dają znaczący wgląd w podstawowe funkcje genów MpSPL3 i MpSPL4 z rodziny czynników transkrypcyjnych SPL u wątrobowca M. polymorpha, które są kluczowymi faktorami kontrolującymi prawidłowy wzrost i rozwój wegetatywnych plech, jak i struktur rozmnażania płciowego u tego wątrobowca. The SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) family of transcription factors is functionally diverse in controlling a number of fundamental aspects of plant growth and development. Since the SPL genes exist amongst plants only, hence, it is imperative to understand their functions amongst basal lineages of land plants, to gain understanding of their evolution. The first part of my thesis presents the phylogenetic relationships between SPL family members from representatives of all lineages of bryophytes: two hornworts, Anthoceros agrestis and A. punctatus, liverwort Marchantia polymorpha, and moss Physcomitrium patens, and angiosperms representatives, Arabidopsis thaliana. The phylogenetic analysis classified SPL proteins in four phylogenetic groups. We found that the SPL family members within the same group share similar gene structures and protein domains which might hint towards the possible overlap in their putative functions. Moreover, there were no SPL genes identified in the hornwort lineage when we started our analysis and our results established that a minimal set of SPL genes is present in hornworts of Anthoceros lineage, which is similar to liverwort, M. polymorpha. In the second part of presented thesis several molecular genetic tools were applied to characterize the function of MpSPL3 and MpSPL4 genes from model liverwort species, M polymorpha. First, combining in planta promoter activity using GUS reporter gene together with RT-qPCR analysis we have shown that both MpSPL3 and MpSPL4 genes are ubiquitously expressed during the vegetative as well as reproductive phases of Marchantia’s life cycle. Next, to obtain knockout plants for each gene, CRISPR/Cas9 approach was used. The obtained two loss-of-function MpSPL3 plants displayed reduced thalli with delayed growth in comparison to wild-type plants. On the other hand, MpSPL4 loss-of-function plants displayed more severe phenotype resembling a prothallus-like stage with no production of gemma cups. As in the case of both genes’ loss-of-function mutations caused very strong effect on Marchantia development, we applied artificial miRNA approach to knockdown the expression of MpSPL3 and MpSPL4 genes. The obtained knockdown plants for both genes displayed growth retardation during their vegetative growth. Moreover, gametangiophores production was completely abolished in Mpspl3-kd lines, while Mpspl4-kd plants exhibited delayed archegoniophores production which additionally showed morphological distortions. Therefore, proper level of MpSPL3 and MpSPL4 genes expression is also indispensable for Marchantia sexual organs development. In third approach, we have prepared overexpression lines of both genes to study how the MpSPL3 and MpSPL4 protein excess will influence Marchantia development. The preliminary phenotypic analysis for gain-of-function MpSPL3 transgenic plants displayed no significant changes in phenotype during vegetative stage of growth as compared to wild-type plants. On the other hand, the plants overexpressing MpSPL4 protein displayed smaller and narrower thalli with bigger gemma cups in comparison to wild-type plants. Taken together, the presented results provide significant insights into the basic functions of MpSPL3 and MpSPL4 genes from the SPL TF family from liverwort M. polymorpha, which are crucial players in controlling proper growth and development of both vegetative thallus and reproductive organs.
  • Item
    Zależna od FUS obróbka snoRNA do sdRNA i regulacja modyfikacji potranskrypcyjnych rybosomowego RNA - powiązania ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS)
    (2023) Gawade, Kishor; Raczyńska, Katarzyna Dorota. Promotor
    FUS jest białkiem wiążącym DNA/RNA, zaangażowanym w wiele etapów metabolizmu RNA. Mutacje w obrębie sygnału lokalizacji jądrowej (NLS, ang. nuclear localization signal) białka powodują błędną lokalizację FUS w cytoplazmie i w konsekwencji tworzenie agregatów cytoplazmatycznych, co jest powiązane z chorobą neurodegeneracyjną stwardnienie zanikowe boczne, ALS (ang. amyotrophic lateral sclerosis). Małe jąderkowe RNA (snoRNA) to rodzina małych niekodujących RNA, które są zaangażowane w 2'-O-metylację (2'-O-Me) i pseudourydylację rybosomowego RNA (rRNA) i małych jądrowych RNA (snRNA). Te modyfikacje epitranskryptomiczne zapewniają stabilność i zachowanie wiernej struktury rybosomów. Co ciekawe, wbrew wcześniejszemu przekonaniu, około dwie trzecie miejsc w rRNA jest zmodyfikowanych częściowo; zapewnia to dodatkowy poziom generowania heterogeniczności rybosomów.Oprócz funkcji w nadawaniu modyfikacji rRNA i U snRNA, snoRNA klasy C/D i H/ACA mogą być procesowane do mniejszych, stabilnych fragmentów, zwanych sdRNA (ang. snoRNA-derived RNAs, RNA pochodzące ze snoRNA). Cząsteczki sdRNA mogą działać jako mikroRNA i regulować ekspresję genów na poziomie transkrypcji i translacji. Co istotne, rola FUS w biogenezie mikroRNA jest znana i dobrze udokumentowana, nie ma natomiast danych na temat udziału białka FUS w regulacji ekspresji snoRNA i ich dalszej obróbce do sdRNA. W niniejszej pracy, z zastosowaniem technik wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA, wykazano, że FUS reguluje poziom snoRNA w komórkach linii ludzkiej neuroblastomy SH-SY5Y. Następnie, ponieważ snoRNA biorą udział w potranskrypcyjnych modyfikacjach rRNA i snRNA, wykorzystano ilościowe techniki oparte na sekwencjonowaniu nowej generacji (NGS, ang. next generation sequencing) typu RiboMeth-seq i HydraPsiSeq, do mapowania zmian w poziomach 2'-O-Me i pseudourydyny, w komórkach typu dzikiego i komórkach pozbawionych białka FUS. W wielu miejscach 2’-O-Me w rybosomowych RNA, które były zmodyfikowane częściowo, obserwowano wzrost poziomu modyfikacji w komórkach pozbawionych FUS. Równocześnie podwyższonej ekspresji ulegała też grupa snoRNA klasy C/D, biorąca udział we wprowadzaniu tych modyfikacji. Ponadto, zaobserwowano drobne zmiany w poziomie pseudourydylacji w komórkach pozbawionych FUS, które również wykazywały tendencję wzrostową, podobnie jak zmiany w ekspresji odpowiedzialnych za te modyfikacje snoRNA klasy H/ACA. W kolejnych analizach, w których wykorzystano komórki SH-SY5Y niosące mutację FUS R495X związaną z ALS, prowadzącą do syntezy białka pozbawionego sygnału NLS, również obserwowano znaczące zmiany w poziomach snoRNA oraz 2’-O-Me i pseudourydyny, w porównaniu z kontrolą typu dzikiego. W badaniach wykorzystano również fibroblasty pochodzące od pacjentów z ALS z mutacjami FUS oraz, jako kontrole, fibroblasty pochodzące od dopasowanych wiekiem i płcią osób zdrowych. Zgodnie z oczekiwaniami, w fibroblastach pochodzących od osób z „silną” mutacją FUS P525L, zaobserwowano największą liczbę znacząco zmienionych miejsc 2’-O-Me, podczas gdy w fibroblastach pochodzących od osób z „łagodnymi” mutacjami FUS R521C i R521L, zmienionych miejsc było mniej. Wyniki te uzupełniono danymi dotyczącymi 2’-O-Me z izogenicznej pary indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z mutacją FUS P525L, różnicowanych następnie do neuronalnych komórek progenitorowych i neuronów ruchowych. Co ciekawe, większość miejsc ze zmienionym profilem 2’-O-Me i pseudourydylacji położona jest w zewnętrznych partiach rybosomu 80S, sugerując, że te częściowo zmodyfikowane miejsca, w zależności od poziomu ich modyfikacji, mogą wpływać na oddziaływania z białkami rybosomalnymi i z innymi czynnikami. Jak wspomniano wyżej, analiza danych pochodzących z sekwencjonowania małych cząsteczek RNA wykazała, że wiele cząsteczek snoRNA ulega zróżnicowanej ekspresji w komórkach SH-SY5Y z wyciszeniem białka FUS. Ponadto, zidentyfikowano liczną grupę sdRNA powstających ze snoRNA klasy C/D i H/ACA. Wiele sdRNA pochodzących ze snoRNA klasy C/D zawierało zakonserwowane motywy „C” lub „D”. Co więcej, z jednego snoRNA mogły powstawać różne sdRNA, wykazujące różne poziomy ekspresji. Profil sdRNA był inny w przypadku proliferujących i zróżnicowanych komórek SH-SY5Y, co sugeruje, że zewnętrzne sygnały, takie jak traktowanie kwasem retinowym, mogą również wpływać na produkcję sdRNA ze snoRNA. Wyniki te wskazują, że białko FUS wpływa na ekspresję snoRNA i modyfikację rybosomalnego RNA. Co więcej, snoRNA są procesowane do sdRNA w sposób zależny od FUS. Jednakże, funkcja tych sdRNA pozostaje wciąż niezbadana. Konieczne są dalsze badania funkcjonalne, aby określić wpływ poszczególnych miejsc modyfikacji rRNA na translację i wpływ mutacji FUS związanej z ALS na ten proces. FUS is a DNA/RNA binding protein involved in many aspects of RNA metabolism. Moreover, mutations within the nuclear localization signal (NLS) of FUS result in the mislocalization of this protein into the cytoplasm, resulting in the formation of cytoplasmic aggregates, and it is associated with amyotrophic lateral sclerosis, a neurodegenerative disease. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) are a family of small non-coding RNAs that guide site-specific 2’-O-methylation (2'-O-Me) and pseudouridylation of ribosomal RNAs (rRNAs) and small nuclear RNAs (snRNAs). These epitranscriptomic modifications provide stability and maintain the structural fidelity of the ribosomes. Additionally, contrary to the previous belief, about two-thirds of these sites on the rRNA are fractionally modified; this provides another layer of generating ribosomal heterogeneity. Not limited to only guiding rRNA and snRNA modifications, both C/D and H/ACA box types of snoRNAs can be processed into smaller, stable fragments called sdRNAs (snoRNA-derived RNAs). These sdRNAs may function as microRNAs and regulate gene expression at transcriptional and translational levels. Moreover, the role of FUS in the biogenesis of microRNAs is known and well documented, but its role in regulating snoRNA expression and processing into sdRNAs is not explored. In this work, using high-throughput sequencing, it was identified that FUS regulates snoRNAs in SH-SY5Y (neuroblastoma) cells. Since snoRNAs are involved in guiding rRNA and snRNA modifications, quantitative, next-generation sequencing (NGS)-based techniques, RiboMeth-seq and HydraPsiSeq were used to map changes in 2’-O-Me and pseudouridine levels in wild-type and FUS-depleted cells (FUS KO). Many fractionally modified 2’-O-Me sites on ribosomal RNAs showed a higher proportion of modification in FUS-depleted cells, and a subset of guide C/D box snoRNAs were also upregulated. Furthermore, pseudouridine changes in the FUS-depleted cells were subtle, but an overall increase in the modification of rRNAs was noticeable, along with changes in guide H/ACA box snoRNAs. Next, SH-SY5Y cells carrying ALS-associated FUS R495X mutation that lack an NLS also displayed significant changes in snoRNAs and 2’-O-Me and pseudouridine levels compared to wild-type control. In addition, ALS-patient-derived fibroblasts with FUS mutations and age-sex-matched controls were used to explore if 2’-O-Me changes are also observed in ALS patients with FUS mutations. As expected, fibroblasts carrying ‘strong’ FUS P525L mutation displayed the highest number of significantly changed 2’-O-Me sites, whereas ‘mild’ FUS mutations R521C and R521L displayed fewer sites. These results were complemented by 2’-O-Me data from an isogenic pair of induced pluripotent stem cells, neural progenitor cells and motor neurons carrying FUS P525L mutation. Interestingly, most of the 2’-O-Me and pseudouridine sites mapped to the outer periphery of the 80S ribosome, suggesting that depending on their modification levels, these fractionally modified sites may regulate the binding of ribosomal proteins or other factors. As mentioned above, small RNA sequencing data showed that some snoRNAs were differentially expressed in SH-SY5Y FUS KO cells and, that many sdRNAs are generated from C/D and H/ACA box snoRNAs. In the case of the C/D box snoRNAs, these sdRNAs showed conserved box C or box D motifs. Moreover, a single snoRNA produced multiple sdRNAs with varying levels of expression. The sdRNA profile was different for proliferating and differentiated SH-SY5Y cells, suggesting that external cues such as retinoic acid treatment can also influence the processing of snoRNAs into sdRNAs. These results indicate that FUS influences snoRNA expression and ribosomal RNA modification. Secondly, some snoRNAs are processed into sdRNAs in a FUS-dependent manner. However, the function of these sdRNAs remains to be explored. Functional studies are necessary to explore the effects of individual rRNA modification sites on translation and how ALS-associated FUS mutation influences this process.
  • Item
    Elementy sekwencji i struktury RNA rozpoznawane przez białka z domeną FinO
    (2023) Basczok, Maciej; Olejniczak, Mikołaj. Promotor
    O bakteryjnych białkach opiekuńczych z domeną FinO wiadomo, że często wiążą RNA za pośrednictwem Rho-niezależnego terminatora transkrypcji. Co ciekawe, ten strukturalny motyw jest również wiązany przez inne białko opiekuńcze, Hfq, jednak z danych profilowania transkryptomu wiadomo, że pule wiązanych cząsteczek RNA przez oba białka pozostają zasadniczo odrębne. W pierwszej części pracy przeanalizowano dostępne dane ligandów RNA białek ProQ i Hfq z E. coli, S. enterica i N. meningitidis. Wykazano, iż region po stronie 5' terminatora w przypadku ligandów RNA białek ProQ z enterobakterii jest wzbogacony w adenozynę, a Hfq w urydynę. Kompozycja tego regionu stanowi element mechanizmu konkurencji o ligandy RNA między białkami ProQ i Hfq u enterobakterii. Natomiast u N. meningitidis zaobserwowano, że ligandy RNA obu białek są wzbogacone w adenozynę oraz że wzbogacenie to jest cechą całego tranksryptomu. Sugeruje to, iż białka ProQ i Hfq z N. meningitidis mogą wykorzystywać inne motywy podczas konkurencji o ligandy RNA. W drugiej części pracy wykazano, że w wiązaniu do białka ProQ z N. meningitidis bierze udział dolna część spinki terminatorowej wraz sekwencjami przylegającymi do niej zarówno po stronie 5' jak i 3', których minimalna długość może się różnić w zależności od cząsteczki RNA, jednak dla silnego wiązania zawsze musi mieć co najmniej kilka nukleotydów. Bacterial RNA chaperones with a FinO domain are known to bind RNA via a Rho-independent transcription terminator. Interestingly, this structural motif is also bound by another chaperone, Hfq, but from transcriptome profiling data it is known that the pools of RNA molecules bound by the two proteins remain essentially distinct. In the first part of the work, available data on RNA ligands of ProQ and Hfq proteins from E. coli, S. enterica and N. meningitidis were analysed. It was shown that the region on the 5' side of the terminator in the case of RNA ligands of ProQ proteins from enterobacteria is enriched in adenosine, while Hfq in uridine. The composition of this region is part of the mechanism of competition for RNA ligands between ProQ and Hfq proteins in enterobacteria. However, in N. meningitidis it was observed that the RNA ligands of both proteins are enriched in adenosine in this region and that this enrichment is a feature of the entire transcriptome. This suggests that the ProQ and Hfq proteins from N. meningitidis may use different motifs when competing for RNA ligands. In the second part of the work, it was shown that the lower part of the terminator hairpin and the sequences adjacent to it both on the 5' and 3' side are involved in binding to the ProQ protein from N. meningitidis, and that the minimum length of which may vary depending on the RNA molecule.
  • Item
    Analiza dynamiki oddziaływań pomiędzy drzewami i konsumentami ich nasion: od globalnych wzorców do zmienności w obrębie gatunku
    (2023) Celebias, Paulina; Zwolak, Rafał. Promotor; Bogdziewicz, Michał. Promotor
    Interakcje między roślinami a zwierzętami zjadającymi nasiona różnią się w swoim natężeniu, od słabych do silnych, oraz we wpływie jaki mają oddziałujące na siebie organizmy, od negatywnego do pozytywnego. Aby w pełni zrozumieć te zależności, potrzebujemy zarówno globalnej syntezy licznych istniejących już wyników badań, jak i nowych eksperymentów, które pozwolą na opisanie pomijanych dotąd aspektów oddziaływań między roślinami a konsumentami nasion. Moja rozprawa doktorska ma na celu sprostanie obu tym wyzwaniom. Składa się ona z trzech części: (i) meta- analizy hipotezy wysycenia konsumentów nasion, (ii) eksperymentu badającego wpływ wielkości nasion na sposób żerowania gryzoni, (iii) eksperymentu badającego wpływ zmienności wewnątrzgatunkowej gryzoni na roznoszenie nasion. W pierwszej części mojej rozprawy przeprowadziłam meta-analizę 48 opublikowanych badań, które spełniały kryterium zawierania co najmniej 4 lat danych dotyczących produkcji nasion oraz wielkości ich konsumpcji przez zwierzęta. Hipoteza wysycenia konsumentów nasion jest jednym z powszechnie przyjętych wyjaśnień ewolucyjnych korzyści lat nasiennych. Według niej, okresowe występowanie masowego opadu nasion powstało, aby zmniejszyć proporcję nasion niszczonych przez konsumentów. W latach niskiego opadu nasion, populacja konsumentów nasion zmniejsza się w związku z niewystarczającą ilością pożywienia, natomiast w latach nasiennych konsumenci nasion zasypywani są większą ilością nasion, niż są w stanie zjeść, co sprawia, że więcej nasion przeżywa. W swoich badaniach potwierdziłam zarówno efekt zagłodzenia, jak i wysycenia drapieżników, jednak efekt wysycenia był widoczny tylko dla zwierząt bezkręgowych. Co więcej, efekt wysycenia drapieżników w ostatnich latach staje się coraz słabszy, co może mieć związek z globalnymi zmianami antropogenicznymi. W drugiej części mojej rozprawy zbadałam wpływ wielkości nasion dębu szypułkowego (Quercus robur) na ich roznoszenie przez gryzonie. Znaczna zmienność wielkości nasion w obrębie jednego osobnika związana jest z modułową budową drzew. Każdy osobnik posiada wiele kopii tego samego organu, np. nasion, które mogą wykazywać znaczącą zmienność. Wielu konsumentów nasion przejawia preferencje względem nasion o konkretnym rozmiarze, dlatego przewidywałam, że między dużymi i małymi nasionami powstają interakcje pośrednie, które mogą wpływać na przeżywalność nasion. Odkryłam, że interakcje między żołędziami o różnych rozmiarach zmieniały się z roku na rok: w pierwszym, ale nie w drugim roku badania, obecność małych żołędzi chroniła duże przed usunięciem. W trzeciej części mojej rozprawy doktorskiej zbadałam wpływ zmienności wewnątrzgatunkowej myszarki leśnej (Apodemus flavicollis) na roznoszenie nasion dębu szypułkowego (Quercus robur). Wykazałam, że zwierzęta o większej skłonności do eksplorowania nowego środowiska mają tendencję do wynoszenia nasion dalej od drzew. Jednak inne efekty indywidualnych cech myszarki leśnej znacznie różniły się między latami, co wskazuje, że ich wpływ na interakcje z roślinami zmienia się, gdy warunki ekologiczne ulegają wahaniom. Podsumowując, wyniki moich badań podkreślają znaczenie prowadzenia wieloletnich badań w celu wykrycia zależnych od kontekstu interakcji między gatunkami i długoterminowych trendów w zjawiskach ekologicznych. The relationship between plants and granivores varies in magnitude - from weak to strong – and in sign – from negative to positive. To make sense of this variation, we need global syntheses of numerous existing studies, and field studies that focus on overlooked sources of complexity in plant-granivore interactions. My thesis aimed to address both of these goals. The thesis consists of three parts: (i) a meta-analysis of the predator-satiation hypothesis, (ii) a study on the impact of variation in seed size on foraging decisions of rodents, (iii) a study on the effects of intraspecific variation in granivore traits on the patterns of seed dispersal. In the first part of my thesis, I revisited predator-satiation hypothesis in a meta-analysis based on 48 studies that gathered at least 4 years of data on seed production and seed predation. The predator-satiation hypothesis is one of the most widely known hypothesis explaining evolutionary advantages of mast seeding. It states that intermittent, abundant crops evolved to reduce seed losses by starving granivores between mast events and overwhelming them with seeds during mast years. I found evidence of both starvation between mast years and satiation during mast years. However, the effectiveness of predator satiation varied between predator types; there was evidence for satiation of invertebrates, but not vertebrates. Moreover, satiation became less effective over recent decades, probably due to global anthropogenic changes. In the second part of my thesis, I investigated the impact of acorn size on their removal and dispersal by granivores. Because trees have modular construction, copies of the same organ, such as seeds, may exhibit considerable variation. Since most granivores display preferences towards seeds of particular size, indirect interactions can arise between larger and smaller seed, which further impacts seed survival and seedling establishment. I found that interactions among different sized acorns varied from year to year: in the first, but not the second year of the study, the presence of small acorns protected large ones from removal. In the third part of my thesis, I investigated the impact of individual traits of yellow-necked mice on the dispersal of common oak acorns. I found that more explorative individuals tend to disperse seeds further from other trees. However, other effects of individual traits varied substantially among years, indicating that their impact on interactions with plants changes when ecological conditions fluctuate. Overall, my results underscore the importance of conducting multi-year studies to detect context-dependent interactions between species and long-term trends in ecological phenomena.
  • Item
    Nowe funkcje białka hnRNP UL1 w komórkach ludzkich
    (2023) Cichocka, Marlena; Raczyńska, Katarzyna Dorota. Promotor
    Białko hnRNP UL1 jest zaangażowane w proces transkrypcji, działając głównie jako negatywny regulator hamujący ekspresję określonych genów. Ponadto, białko hnRNP UL1 uczestniczy w procesie splicingu oraz w odpowiedzi komórki na uszkodzenia DNA. Dodatkowo, wyniki naszej grupy badawczej pokazały po raz pierwszy, że hnRNP UL1 przemieszcza się również do jąderek komórek ludzkich. Poznanie funkcji, jakie białko to pełni w jąderkach komórkowych, stanowiło główny temat niniejszej rozprawy doktorskiej. Ponadto, podjęłam również próbę opisania wzajemnych interakcji pomiędzy hnRNP UL1, FUS i U7 snRNP, oraz określenia roli białka hnRNP UL1 w inhibicji genów histonowych poza fazą S cyklu komórkowego, którą pełni wraz z białkiem FUS i cząstką U7 snRNP. Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów wykazałam, że białko hnRNP UL1 w jąderku komórek ludzkich stymuluje transkrypcję genów rRNA, ale nie jest zaangażowane w kolejne etapy biogenezy rybosomów. Dalsze eksperymenty z wykorzystaniem odczynników genotoksycznych CPT i ETO wskazały, że komórki z wyciszeniem białka hnRNP UL1 są wrażliwsze na uszkodzenia DNA. Ponadto, pokazałam, że hnRNP UL1 oddziałuje z białkami szlaków naprawy uszkodzeń rDNA, takimi jak γH2A.X, RPA32, XRCC1 i Chk1, potwierdzając jego udział w tych procesach. Wyniki kolejnych eksperymentów pokazały, że białko hnRNP UL1 oddziałuje z białkiem FUS najsilniej poza fazą S cyklu komórkowego. Co ciekawe, zarówno FUS jak i hnRNP UL1 silniej wiążą U7 snRNA przy braku drugiego białka, wskazując, że oba białka mogą konkurować o dostępność do U7 snRNA. Zauważyłam również, że poziom fosforylacji białka hnRNP UL1 zmienia się w fazach cyklu komórkowego, co sugeruje, że to właśnie ta modyfikacja może regulować zmiennym oddziaływaniem hnRNP UL1 z białkiem FUS; takiej roli nie ogrywają natomiast metylacje argininy. Wykazałam ponadto, że hnRNP UL1 nie pełni roli inhibitora ekspresji genów histonowych w fazie G1 i G2 cyklu komórkowego, wydaje się jednak być inhibitorem ekspresji tych genów w fazie S. The hnRNP UL1 protein is involved in transcription, acting mainly as a negative regulator that inhibits the expression of specific genes. Furthermore, hnRNP UL1 is involved in splicing and the cell response to DNA damage. In addition, the results of our research group showed for the first time that hnRNP UL1 also moves into the nucleoli of human cells. Learning more about the functions of hnRNPUL1 in cell nucleoli was the main topic of this dissertation. In addition, I also attempted to describe the interactions between hnRNP UL1, FUS, and U7 snRNP, and to determine the role of the hnRNP UL1 protein in the inhibition of histone genes outside the S phase of the cell cycle, which it performs together with the FUS protein and U7 snRNP. Based on my experiments, I showed that the hnRNP UL1 protein stimulates the transcription of rRNA genes in the nucleolus of human cells, however, it is not involved in the subsequent steps of ribosome biogenesis. Further experiments using genotoxic reagents CPT and ETO indicated that cells with silencing of the hnRNP UL1 protein are more sensitive to DNA damage. In addition, I showed that hnRNP UL1 interacts with proteins of the rDNA damage repair pathways such as γH2A.X, RPA32, XRCC1, and Chk1, confirming its involvement in these processes. The results of subsequent experiments showed that the hnRNP UL1 protein interacts with the FUS protein the highest outside the S phase of the cell cycle. Interestingly, both FUS and hnRNP UL1 bind U7 snRNA more strongly in the absence of the other protein, indicating that the two proteins can compete for accessibility to U7 snRNA. I also observed that the phosphorylation level of the hnRNP UL1 protein changes during phases of the cell cycle, suggesting that this modification may regulate the variable interaction of hnRNP UL1 with the FUS protein; such a role is not played by arginine methylations. I further demonstrated that hnRNP UL1 does not play a role as an inhibitor of histone gene expression in the G1 and G2 phases of the cell cycle but appears to be an inhibitor of the expression of these genes in the S phase.
  • Item
    Określenie wpływu nieprawidłowości splicingu mRNA czynnika transkrypcyjnego NFIX na patomechanizm dystrofii miotonicznej oraz opracowanie narzędzia terapii genowej dla tej choroby
    (2023) Rogalska, Zuzanna; Sobczak, Krzysztof. Promotor
    Dystrofia miotoniczna typu 1 (DM1) jest dziedziczną, dominującą chorobą genetyczną, spowodowaną ekspansją trójnukleotydowych powtórzeń CTG w genie DMPK. Nadmiernie wydłużone powtórzenia CUG (CUGexp) w zmutowanym mRNA są toksycznym produktem zmutowanego genu. Zmutowany mRNA sekwestruje czynniki splicingowe takie jak MBNL, a następnie w wyniku funkcjonalnego niedoboru tych białek wywołuje globalne zmiany w alternatywnym splicingu w mięśniach szkieletowych, sercu i mózgu, czego efektem są objawy charakterystyczne dla DM1. Nieprawidłowości w alternatywnym splicingu są kluczową molekularną przyczyną rozwoju DM1. Profil alternatywny splicingu wielu genów zaangażowanych w homeostazę mięśni i ich prawidłowe funkcjonowanie jest istotnie zaburzony. Niemniej jednak, molekularne konsekwencje zaburzeń alternatywnego splicingu większości genów są nadal nieznane. Jednym z eksonów zależnych od MBNL, którego efektywność włączenia do mRNA w procesie splicingu jest istotnie podwyższona w mięśniach szkieletowych DM, jest ekson 7 NFIX, genu kodującego czynnik transkrypcyjny niezbędny do prawidłowego rozwoju mięśni. Pierwszym celem niniejszej pracy było lepsze zrozumienie patomechanizmu DM w kontekście zaburzeń splicingowych NFIX poprzez zrozumienie wpływu włączenia eksonu 7 na aktywność transkrypcyjną NFIX. Aby odpowiedzieć na to pytanie, zastosowano dwa alternatywne podejścia. Pierwszym z nich było stworzenie dwóch stabilnych linii komórkowych z indukowalną nadekspresją izoform NFIX z eksonem 7 i bez eksonu 7 (NFIX+7 lub NFIX-7) w oparciu o komórki HEK z funkcjonalnym nokautem endogennego NFIX (NFIX-KO). Nieoczekiwanie wyniki RNA-seq nie wykazały znaczących różnic w aktywności transkrypcyjnej tych dwóch izoform w stworzonych modelach komórkowych, być może z powodu niewłaściwego dopasowania poziomu ekspresji egzogenów (zbyt wysoki). Drugie podejście opierało się na manipulacji włączania egsonu 7 do endogennie eksprymowanego mRNA NFIX przy użyciu antysensownego oligonukleotydu (AON) nakierowanego na połączenie eksonu 7 z intronem 7. W ludzkich komórkach mięśni szkieletowych, w których dominuje izoforma NFIX+7, zastosowany AON indukował efektywne pomijanie eksonu 7 i produkcję głównie izoformy NFIX-7. Takie podejście umożliwiło wygenerowanie modelu komórkowego w kontekście środowiska, w którym NFIX jest naturalnie zaangażowany w proces prawidłowego rozwoju mięśni, ale także w patogenezę DM1. W tych komórkach ekspresja NFIX jest stosunkowo wysoka i jest regulowana przez natywny promotor. Wyniki eksperymentów RNA-seq ujawniły setki genów, których ekspresja uległa istotnym zmianom po traktowaniu AON, co sugeruje, że obie izoformy splicingowe - NFIX+7 i NFIX-7 - różnią się znacząco aktywnością transkrypcyjną. Analiza ontologii genów (GO) wykazała znaczne wzbogacenie klas genów, które są wrażliwe na te dwie izoformy NFIX, ale także zaobserwowano istotną zmianę ich ekspresji w mięśniach pacjentów z DM1. Wśród 5641 genów, których ekspresja jest znacząco zmieniona w tkankach DM1 (P<0,05) zidentyfikowano 2070 genów, których ekspresja była znacząco zmieniona w komórkach mięśniowych poddanych działaniu AON zmieniającemu splicing NFIX. Głównymi terminami GO wzbogaconymi w obu porównaniach (w pierwszym – geny wrażliwe na poziom NFIX oraz na obecność jego izoform splicingowych, w drugim – geny wrażliwe na izoformy splicingowe NFIX oraz zmienione w tkankach pacjentów DM1) były geny składników strukturalnych macierzy zewnątrzkomórkowej i geny białek wiążących się z kolagenami. Są to geny niezmiernie istotne dla prawidłowej budowy i aktywności mięśni szkieletowych, a zatem zaburzenie splicingu NFIX może stanowić istotny element patogenezy DM1. Podsumowując tę część pracy można stwierdzić, że nieprawidłowa dystrybucja eksonu 7 NFIX spowodowana sekwestracją białek MBNL na RNA ze zmutowanym CUGexp wywołuje liczne zmiany ekspresji genów zachodzących w mięśniach szkieletowych, które to mogą być odpowiedzialne za kształtowanie fenotypu chorobowego obserwowanego u pacjentów z DM1. DM jest chorobą nieuleczalną. Kiedy liczba powtórzeń osiąga wysoki poziom (od setek do tysięcy), występujące objawy kliniczne są cięższe oraz wzrasta wydajność sekwestracji zależnej od długości powtórzeń. Proponowane wcześniej strategie terapeutyczne prowadzące do podwyższenia poziomu MBNL1 za pomocą narzędzi terapii genowej wiążą się z występowaniem wielu niepożądanych konsekwencji. Długotrwała, niekontrolowana nadekspresja MBNL1 u myszy prowadzi bowiem do zmniejszenia masy ciała, zwiększonej śmiertelności i uszkodzenia mięśni, w tym mięśnia sercowego. Terapia genowa prowadząca do podwyższenia poziomu MBNL1 u pacjentów z DM1 wiąże się również z wieloma innymi ograniczeniami. Jednym z nich jest niejednorodność sekwestracji MBNL spowodowana mozaicyzmem somatycznym długości powtórzeń CTG w komórkach tego samego pacjenta oraz pomiędzy różnymi osobami ze zdiagnozowanym DM1. Aby sprostać tym ograniczeniom, zaprojektowałam i wygenerowałam autoregulowany konstrukt do nadekspresji MBNL1, który umożliwia produkcję białka MBNL1 dostosowaną do poziomu aktywnej puli endogennych białek MBNL w komórce. Ta strategia terapeutyczna daje więc możliwość przezwyciężenia ograniczeń wynikających z niejednorodności ekspansji powtórzeń CTG i w konsekwencji różnego stopnia niedoboru MBNL w różnych komórkach czy włóknach mięśniowych. Konstrukt ten zawiera sekwencję kodującą MBNL1 przedzieloną fragmentem pre-mRNA ATP2A1 z alternatywnym eksonem wrażliwym na poziom MBNL, który zawiera kodon stop w ramce odczytu dla MBNL1. Włączenie tego eksonu prowadzi więc do tworzenia nieaktywnej, skróconej formy białka, natomiast jego wyłączenie, następujące przy niedoborze MBNL, powoduje wzrost produkcji w pełni aktywnej formy MBNL1. Takie podejście umożliwia ograniczoną i ściśle kontrolowaną nadekspresję MBNL1, w zależności od stopnia niedoboru białka, a zarazem może odpowiadać na niejednorodność długości powtórzeń CUG. Podsumowując tę część pracy można powiedzieć, że przeprowadzone badania wykazały, że nadekspresja MBNL1 ze stworzonego konstruktu genetycznego podlega autoregulacji i ma potencjał terapeutyczny prowadzący do korygowania nieprawidłowości alternatywnego splicingu, co wykazano dla komórek pochodzących od pacjentów z DM1. Myotonic dystrophy type 1 is a hereditary, autosomal disease caused by expansion of trinucleotide CTG repeats in DMPK gene. Expanded CUG repeats in mutant mRNA is a major toxic product of mutant gene. It sequester MBNL splicing factors and due to functional insufficiency of these proteins trigger global changes in alternative splicing in skeletal muscles, heart and brain, which result in symptoms characteristic for DM1. The abnormalities in alternative splicing are crucial molecular feature of DM1. The alternative splicing of many genes engaged in muscle homeostasis and proper functioning is impaired. Although, the molecular consequence of majority of genes with altered splicing pattern is still unknown. One of the MBNL-dependent exons, which inclusion is significantly higher in skeletal muscles of DM, is exon 7 of NFIX, a gene encoding for transcription factor essential for muscle development. First aim of this study was to better understand the pathomechanism of DM in case of abnormalities in the splicing of NFIX. The examination of whether the contribution of exon 7 has an impact on NFIX transcriptional activity gave a deeper understanding of DM1 pathomechanism which is studied for a long time. To answer this question two alternative approaches were used. First of them was generation of two stable cell lines with inducible overexpression of NFIX isoforms with and without exon 7 (NFIX+7 or NFIX-7) based on a HEK cell with functional knockout of endogenous NFIX (NFIX-KO). Unexpectedly, RNA- seq results did not show significant differences in transcriptional activity of these two isoforms in developed cellular models, perhaps due to not well adjusted level of overexpression of exogenes (too high). The second approach based on manipulation of exon 7 inclusion of endogenous NFIX mRNA using the antisense oligonucleotide (AON) targeting (AON) targeting exon 7/intron 7 boundary. In human skeletal muscle cells, in which NFIX+7 isoform predominates, this AON induces efficient exon 7 skipping and production of NFIX-7 isoform. This approach gave the possibility to generate a model with an cellular environment where NFIX is engaged in the developmental process, but also in DM1 pathogenesis. The expression level of NFIX is relatively high in these cells and is driven by the native promoter. The results of RNA-seq revealed hundreds of genes which expression was significantly changed after AON treatment, suggesting that both splicing isoforms, NFIX+7 and NFIX-7, differ significantly in transcriptional activity. Gene ontology (GO) analysis showed significant enrichment of groups of genes that are sensitive to NFIX isoforms and abnormally expressed in DM1 patients. Among 5641 genes which expression is affected in DM1 (P<0.05), 2070 genes were identified which are also sensitive to treatment with AON modulating splicing pattern of NFIX. The major GO molecular function terms enriched in both comparisons (first: genes sensitive to the level of NFIX and its splicing isoforms; second: genes sensitive to the NFIX splicing isoforms and changed in DM1 tissues) were extracellular matrix structural constituent, and collagen binding. These functions are incredibly important for the proper structure and activity of skeletal muscle, therefore NFIX splicing abnormality may be essential trigger of DM1 pathogenesis. Taken together, these results showed that abnormal distribution of NFIX exon 7 caused by sequestration of MBNL proteins on CUGexp affects a subset of gene expression changes occurring in DM1 skeletal muscles, which may be responsible for the development of disease phenotype observed in DM1 patients. DM is an incurable disease. When the number of repeats reach a higher level clinical symptoms are more severe and the sequestration efficiency, which depends on the size expansion, increase. Previously proposed therapeutic strategies leading to increase of the MBNL1 level via gene therapy tools are associated with many undesirable consequences. Uncontrolled MBNL1 overexpression in mice leads to reduced body weight, increased mortality, or muscle damage, including heart muscle. The gene therapy leading to the increase of MBNL1 level is also associated with many limitations. One of them is heterogeneity in sequestration of MBNLs caused by somatic mosaicism of CTG repeat length in cells of the same patient and between individuals with DM1. To deal with these limitations I designed and generated the autoregulated MBNL1 overexpression construct which enables the production of MBNL1 adjusted to the level of active pool of endogenous MBNLs. It was assumed that this therapeutic strategy gave the possibility to overcome the limitations caused by heterogeneity of CTG repeat expansions and as a consequence different levels of MBNL insufficiency in different cells/myofibers. This construct contains MBNL1-coding sequence separated by the fragment of ATP2A1 pre-mRNA with MBNL-sensitive alternative exon containing in frame stop codon. The inclusion of this exon leads to the arrangement of the inactive form of the protein but its exclusion, occurring during MBNL insufficiency, gives rise in production of fully active MBNL1. This approach enables the restricted expression of MBNL1 protein only if its level in cell is too low and potentially can be controlled by heterogeneity of CUGexp load. It was shown that expression of MBNL1 assembled from this construct is tunable and has therapeutic potential to correct the alternative splicing abnormalities in DM1 patients-derived cells.
Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu
Biblioteka Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu
Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego