Doktoraty (WB)

Permanent URI for this collection

https://repozytorium.amu.edu.pl/handle/10593/763

Browse

Now showing 1 - 20 of 265

Genomika doboru płciowego rozkruszka hiacyntowego, Rhizoglyphus robini
(2024) Chmielewski, Sebastian; Radwan, Jacek. Promotor; Konczal, Mateusz. Promotor pomocniczy
Dobór płciowy działający na cechy związane z konkurencją rozrodczą wpływa na zmienność genetyczną kluczową dla procesów takich jak adaptacja i specjacja. Chociaż może poprawiać dostosowanie populacji poprzez przewagę osobników o wysokiej kondycji, może również zmniejszać zmienność genetyczną i efektywną wielkość populacji. Jednakże, nowe modele sugerują, że dobór płciowy może utrzymywać zmienność genetyczną, ale dowody empiryczne na to są ograniczone. Niniejsza praca wykorzystuje narzędzia genomowe do badania, jak dobór płciowy wpływa na polimorfizm genetyczny u rozkruszka hiacyntowego , Rhizoglyphus rabini, gatunku o dymorfizmie płciowym samców. Stworzyliśmy mapę genetyczną złożyć genom do poziomu chromosomów i zbadać różnice między płciami w rozkładzie rekombinacji wzdłuż chromosomów. W celu zbadania wpływu doboru płciowego na ilość zmienności genetycznej przeprowadziliśmy ewolucję eksperymentalną w której manipulowaliśmy stosunkiem płci. Po 28 pokoleniach nie zaobserwowaliśmy wyraźnej odpowiedzi Qenomowei, ale linie z przewagą samców wykazywały wolniejszą utratę różnorodności nukleotydowej w miejscach synonimowych . Dodatkowo zbadaliśmy architekturę genetyczną determinacji morf samców za pomocą analiz Pool-GWAS i linii wsobnych. Zidentyfikowaliśmy region 3,5 Mb na końcu chromosomu 7, związany z ekspresją morfu, będący prawdopodobnie supergenem. Ekspresja morf była również związana z setkami SNP, co wskazuje , że ta morf samca zależy od kondycji. Niniejsza praca pogłębia naszą wiedzę na temat roli doboru płciowego w kształtowaniu różnorodności genetycznej, co ma duże znaczenie dla zarządzania zagrożonymi populacjami. Sexual selection drives the evolution of reproductive traits and shapes the genetic variance critical for processes like adaptation and speciation . While it can enhance population fitness by promoting high-condition individuals, it may also reduce genetic variance and population size. However , recent models suggest that sexual selection can maintain genetic variation , but empirical evidence is limited. This thesis uses genomie tools to explore how sexual selection influences genetic polymorphism in the bulb mite, Rhizog/yphus rabini, a species with małe dimorphism. We created a high-density linkage map to anchored the genome to the chromosome scale and investigate sex-specific recombination landscapes in holocentric chromosomes. To investigate the effect of sexual selection on the amount of segregating genetic variation, we performed experimental evolution manipulating sex ratio. We found no elear genomie response after 28 generations, but male-biased lines exhibited a slower loss of nucleotide diversity in synonymous sites. Additionally, we investigated genetic architecture of małe morph determination using Pool-GWAS and inbred lines analyses. We identified a 3.5 Mb region near chromosome seven's end associated with morph expression, resembling a supergene. Morph expression was additionally linked to hundreds of SNPs, indicating that this sexually selected trait is condition- dependent. This thesis advances our understanding of sexual selection's role in shaping genetic diversity, relevant for managing wild populations.
Rola genu AMOTL2 w pluripotencji i różnicowaniu ludzkich komórek macierzystych
(2024) Jędrzejak, Anna Paulina; Borowiak, Małgorzata. Promotor
W ostatnich latach prowadzone były szerokie badania nad regulacją transkrypcji w procesach rozwojowych, jednakże nadal istnieje znaczna luka w wiedzy o mechanistycznych i metabolicznych sygnałach, oraz zdarzeniach morfologicznych towarzyszących różnicowaniu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (ang. human pluripotent stem cells, hPSCs). W poszukiwaniu takich sygnałów po raz pierwszy zidentyfikowałem gen Amotl2 w danych z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (ang. single cel RNA-sequencing, scRNA-seq) z rozwijającej się mysiej trzustki z dni embrionalnych 14.5 (e14.5) i 16.5 (e16.5). Co ciekawe, pomimo zachowanych kanonicznych markerów, populacje progenitorów endokrynnych (ang. endocrine progenitors, EP) z tych punktów czasowych różniły się znacząco pod względem transkryptomu, przy czym EP z dnia 16.5 preferencyjnie tworzyły komórki β trzustki, a e14.5 EP preferencyjnie tworzyły komórki α. Amotl2 ulegał specyficznej ekspresji w podtypie e16.5 EP, który odzwierciedlał wychodzenie EP ze struktury sznurów nabłonkowych, słabo poznane zdarzenie, które z kolei może wpływać na los komórek endokrynnych. AMOTL2 należy do rodziny angiomotyn. Jest to białko cytoplazmatyczne, które znajduje się w cytozolu lub na połączeniach komórkowych, ułatwiając przekazywanie sygnału, organizację cytoszkieletu, i modulację szlaków sygnalizacyjnych. AMOTL2 jest znanym regulatorem szlaku Hippo i jego efektora – białka YAP. Jednym z celów niniejszej pracy była identyfikacja wzorców ekspresji genu AMOTL2 w rozwoju ludzkiej trzustki in vivo i różnicowaniu trzustki in vitro przy użyciu publicznie dostępnych zbiorów danych scRNA-seq. AMOTL2 ulegał ekspresji na różnych etapach różnicowania trzustki, w tym w endodermie właściwej, komórkach prekursorowych trzustki i EP in vitro, ale także w EP, mezenchymie i komórkach pęcherzykowych in vivo. Ekspresja genu AMOTL2 nie utrzymywała się w dojrzałych komórkach endokrynnych. Co ważne, tutaj po raz pierwszy wykazano istnienie populacji NGN3(+) / AMOTL2(+) PE u człowieka, zarówno in vitro, jak i in vivo, którą wcześniej zidentyfikowano jedynie u myszy. Ekspresję AMOTL2 zidentyfikowano także w zarodku przedimplantacyjnym i hPSCs, co sugeruje, że może on wpływać również na wcześniejsze decyzje dotyczące losu komórki. W niniejszej pracy wyprowadziłam linię hPSC z wyłączoną ekspresją genu AMOTL2 (ang. knockout, KO) przy użyciu metody CRISPR/Cas9. Podczas wstępnej charakterystyki wyłonił się silny fenotyp dotyczący morfologii kolonii, przy czym kolonie AMOTL2 KO hPSC były bardziej nieregularne i mniej ciasno upakowane niż u typu dzikiego (ang. wild type, WT). Dodatkowo hPSC AMOTL2 KO wykazywały zwiększoną konfluencję w porównaniu z hPSC WT, co było wynikiem ich zwiększonej proliferacji i zmniejszonych szybkości apoptozy. Sekwencjonowanie RNA ujawniło istotne zmiany w zakresie cytoszkieletu, adhezji oraz migracji, rozwoju, metabolizmu komórkowego i szlaków sygnałowych. Wykazano również potencjalne tendencje rozwojowe komórek AMOTL2 KO w kierunku ektodermy kosztem endodermy i mezodermy, co zostało potwierdzone spontanicznym i ukierunkowanym różnicowaniem. W poszukiwaniu mechanizmu odpowiedzialnego za takie tendencje w różnicowaniu jako możliwych winowajców zidentyfikowano depolimeryzację F-aktyny i zwiększoną aktywność YAP. Co zaskakujące, spontaniczne różnicowanie z dodatkiem substancji depolimeryzującej F-aktynę, Y-27632 lub inhibitora YAP, werteporfiny, nie powtórzyło ani nie uratowało fenotypu rozwojowego AMOTL2 KO. Oznacza to, że w grze biorą udział inni, silniejsi gracze, za pomocą których AMOTL2 kontroluje los komórek, a którzy w oparciu o sekwencjonowanie RNA i wstępne dane funkcjonalne mogą obejmować mechanizm wytwarzania energii lub metabolizm komórkowy. The transcriptional regulation of developmental processes was extensively studied over the last years, yet there is still a considerable gap of knowledge concerning the mechanistic and metabolic cues, and underlying morphological events that accompany human pluripotent stem cell (hPSC) differentiation. In search of such signals, I first identified the Amotl2 gene in the single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data of the developing murine pancreata from embryonic days 14.5 (e14.5) and 16.5 (e16.5). Interestingly, despite conserved canonical markers, the endocrine progenitor (EP) populations from these timepoints differed significantly in their transcriptomes, with e16.5 EPs being more prone to form pancreatic β-cells, and e14.5 EPs preferentially forming α-cells. Amotl2 was specifically expressed in the subtype of e16.5 EPs, which reflected EPs delamination from epithelial cords, a poorly understood event that might influence endocrine cell fate. AMOTL2 is a member of the angiomotin family. It is a cytoplasmic protein that resides either in cytosol or at the cellular junctions, facilitating signal transduction, cytoskeleton organization, and modulation of signaling pathways. AMOTL2 in a known regulator of Hippo pathway and its downstream effector YAP. One of the aims of this thesis was identification of AMOTL2 expression patterns in developing human pancreas in vivo and pancreatic differentiation in vitro using publicly available scRNA-seq datasets. AMOTL2 was expressed at the different stages of pancreatic differentiation, including definitive endoderm, pancreatic progenitors, and EPs, in vitro, and in EPs, mesenchyme, and acinar cells in vivo. AMOTL2 expression did not persist into mature endocrine cell. Importantly, here, for the first time, is shown the existence of the NGN3(+) / AMOTL2(+) EP population in human, in both in vitro and in vivo, which was previously identified only in mice. AMOTL2 expression was also identified in the preimplantation embryo and hPSCs, suggesting that it might influence also earlier cell fate decisions. In this thesis, I developed an AMOTL2 knockout (KO) hPSC line using CRISPR/Cas9 approach. During initial characterization, a strong phenotype concerning colony morphology emerged, with AMOTL2 KO hPSC colonies being more irregular and less tightly packed than in wild type (WT). Additionally, AMOTL2 KO hPSCs showed increased confluency compared to WT hPSCs, which was a result of increased proliferation and decreased apoptosis rates. RNA-sequencing revealed substantial changes in terms connected with cytoskeleton, adhesion, and migration, development, cell metabolism, and signaling pathways. It also shown a potential developmental bias of AMOTL2 KO cells towards ectoderm, at the expense of endoderm and mesoderm, which was confirmed with spontaneous and directed differentiation. In search of the mechanism behind the differentiation bias, the F-actin depolymerization and increased YAP activity were identified as possible culprits. Surprisingly, spontaneous differentiation with F-actin depolymerizing agent, Y-27632, or YAP inhibitor, verteporfin, failed to repeat or rescue AMOTL2 KO developmental phenotype. This indicates that there are other, more potent players in the game, by which AMOTL2 controls cell fate, which, based on RNA-sequencing and preliminary functional data, might include energy production mechanism or cellular metabolism.
Identyfikacja i charakterystyka rho-niezależnych terminatorów transkrypcji u bakterii oraz ich udziału w odpowiedzi na stres antybiotykowy
(2024) Kosiński, Jan; Żywicki, Marek. Promotor
Zmiany w strukturach drugorzędowych RNA mogą wpływać na proces ekspresji genów, a jednym z efektów może być przedwczesna terminacja transkrypcji. Warunkowa terminacja transkrypcji odgrywa istotną rolę w odpowiedzi bakterii na różnorodne bodźce środowiskowe, w tym działanie antybiotyków. Identyfikacja mechanizmów regulatorowych opartych na warunkowej terminacji transkrypcji, które mają znaczenie kliniczne, wymaga kompleksowej adnotacji terminatorów transkrypcji oraz analizy ich roli w odpowiedzi na stres antybiotykowy. W niniejszej pracy przedstawiono narzędzia bioinformatyczne do wykrywania i adnotacji rho niezależnych terminatorów transkrypcji u bakterii. Wykorzystują one dane z sekwencjonowania 3’ końców RNA oraz całkowitego sekwencjonowania RNA. Analiza szerokiego zestawu publicznie dostępnych danych pozwoliła na utworzenie obszernego atlasu terminatorów bakteryjnych, w tym dla Staphylococcus aureus. Rozprawa kompleksowo porównuje terminatory, ujawniając ich znaczną zmienność w strukturze drugorzędowej, kompozycji nukleotydowej oraz lokalizacji genomowej między analizowanymi taksonami. Praca przedstawia również miejsca warunkowej terminacji transkrypcji u Staphylococcus aureus, zaangażowane w regulację ekspresji genów w odpowiedzi na stres antybiotykowy. Changes in RNA secondary structures can influence gene expression processes, and one effect can be premature transcription termination. Conditional transcription termination plays a significant role in bacterial responses to various environmental stimuli, including the action of antibiotics. Identifying regulatory mechanisms based on conditional transcription termination, which are clinically significant, requires comprehensive annotation of transcription terminators and analysis of their role in response to antibiotic stress. In this thesis, bioinformatic tools for detecting and annotating rho-independent transcription terminators in bacteria are presented. These tools utilize data from 3’-end RNA sequencing and total RNA sequencing. Analysis of a wide range of publicly available data allowed for the creation of an extensive atlas of bacterial terminators, including those for Staphylococcus aureus. The dissertation comprehensively compares terminators, revealing their significant variability in secondary structure, nucleotide composition, and genomic location among the analyzed taxa. It also identifies sites of conditional transcription termination in Staphylococcus aureus involved in regulating gene expression in response to antibiotic stress.
Efekty działania nikotyny i acetamiprydu na Drosophila melanogaster i Drosophila suzukii
(2024) Lewandowska-Wosik, Anetta; Chudzińska, Ewa. Promotor
Neonikotynoidy to klasa insektycydów - pochodnych nikotyny - które są szeroko stosowane w ochronie roślin. Są rozpuszczalne w wodzie, więc ich obecność nie ogranicza się do miejsc aplikacji i niezamierzenie stają się częścią pożywienia, co czyni je niebezpiecznymi dla innych organizmów. Obecnie jedynym preparatem z grupy neonikotynoidów zatwierdzonym do zwalczania Drosophila suzukii jest acetamipryd. Celem rozprawy doktorskiej było zbadanie skutków długotrwałego stresu wywołanego kontaktem z subletalnymi dawkami neurotoksycznych insektycydów na przykładzie D. melanogaster i D. suzukii. Otrzymane wyniki umożliwiły stwierdzenie, że subletalne stężenie testowanych pestycydów obniża kondycję owadów i ma działanie neurotoksyczne. Przeprowadzenie wielopokoleniowych hodowli pokazało, że w kolejnych generacjach nasilenie negatywnych objawów jest zróżnicowane w zależności od zastosowanej substancji toksycznej oraz od badanego gatunku. Większą wrażliwością cechowała się D. suzukii, ale w pokoleniu F10 zaobserwowano, że rozwinęła się odporność na niskie stężenia acetamiprydu. Przeprowadzone badania pozwalają na lepsze zrozumienie działania testowanych insektycydów, a analiza ich skuteczności obserwowana przez kilka pokoleń owadów przynosi nowe informacje i pozwala szerzej spojrzeć na kształtowanie się adaptacji poprzez nabywanie oporności. Może to być wskazówką przy określeniu „złotego środka” między koniecznością ochrony zbiorów przed D. suzukii a koniecznością ochrony organizmów niebędących celem działania insektycydów, w tym także ludzi. Neonicotinoids are a class of insecticides - nicotine derivatives - that are widely used in plant protection. They are water-soluble, so their presence is not limited to the application sites, and they unintentionally become part of food, which makes them dangerous to other organisms. Currently, the only neonicotinoid preparation approved for the control of Drosophila suzukii is acetamiprid. The aim of the doctoral dissertation was to investigate the effects of long-term stress caused by contact with sublethal doses of neurotoxic insecticides on the example of D. melanogaster and D. suzukii. The obtained results allowed us to state that sublethal concentrations of the tested pesticides reduce the condition of insects and have a neurotoxic effect. Conducting multi-generational breeding showed that in subsequent generations the intensity of negative symptoms varies depending on the toxic substance used and the species tested. D. suzukii was more sensitive, but in the F10 generation it was observed that resistance to low concentrations of acetamiprid had developed. The conducted studies allow for a better understanding of the action of the tested insecticides, and the analysis of their effectiveness observed over several generations of insects provides new information and allows for a broader look at the formation of adaptation through the acquisition of resistance. This may be an indication in determining the "golden mean" between the need to protect crops from D. suzukii and the need to protect organisms that are not the target of insecticides, including humans.
Zachowanie flory wschodnioafrykańskiej: znaczenie obszarów chronionych
(2024) Gereau, Roy Emile; Wiland-Szymańska, Justyna. Promotor
Inwentaryzacje bioróżnorodności pokazują, że tropikalna Afryka wschodnia jest ważnym obszarem docelowym dla skutecznej ochrony przyrody w skali światowej, z dużą ilością informacji na temat zagrożeń dla przetrwania gatunków i ich siedlisk, w formie ocen Czerwonej Listy. Strefa ta jest również miejscem rozwiniętej sieci obszarów chronionych (PA). System leśnych rezerwatów przyrody (NFR) Tanzanii zapewnia skuteczną ochronę dużej części flory roślin naczyniowych tego kraju. Decyzje dotyczące priorytetów ochrony in situ i ex situ są kluczowe dla planowania ich zabezpieczenia i mogą być oparte na znanych rozmieszczeniach gatunków i możliwych zagrożeniach oraz informacjach o obszarach chronionych, w których występują. W Tanzanii dane te są dostępne ze znanych i sprawdzonych źródeł, co umożliwia podejmowanie tych decyzji w celu promowania skutecznej i zrównoważonej ochrony przyrody. Znaczenie obszarów chronionych w zachowaniu roślin tropikalnej Afryki wschodniej potwierdzają przykłady gatunków o przetrwaniu zależnym od ochrony i zrównoważonym zarządzaniu populacjami i siedliskami, które są w nich zapewnione. Badanie wskazuje również, że utrzymanie zmienności genetycznej rzadkich gatunków roślin i ochrona populacji taksonów opornych na długoterminowe przechowywanie nasion są możliwe wyłącznie in situ. Existing biodiversity inventories show tropical eastern Africa to be a globally important target area for effective nature conservation, with a high level of knowledge of threats to the survival of species and their habitats in the form of Red List assessments and a robust network of protected areas (PAs), with Tanzania’s system of Nature Forest Reserves (NFRs) providing effective protection to a large proportion of the country’s vascular plant flora. Global Biodiversity Hotspots and Key Biodiversity Areas provide valuable means of organizing conservation priorities and planning, but depend on the regulatory stability of PAs to provide tangible conservation benefits. Decisions about in-situ and ex-situ conservation priorities are central to conservation planning and can be based on species’ known distribution and threats and information about the PAs in which they occur. In Tanzania, these data are available from known and tested sources, enabling these decisions to be made in the furtherance of effective and sustainable nature conservation.
Obliczeniowa analiza struktur drugorzędowych RNA w genomach wirusowych w oparciu o dane z metod wysokoprzepustowego próbkowania strukturalnego
(2024) Plucinska-Jankowska, Marianna; Żywicki, Marek. Promotor
Struktura RNA jest kluczowym czynnikiem determinującym jego funkcję, ponieważ dynamiczne zmiany konformacyjne cząsteczek RNA są kluczowe dla ich roli, np. w regulacji ekspresji genów i syntezie białek. Dokładne określenie struktury RNA za pomocą metod takich jak NMR lub krystalografia rentgenowska jest trudne ze względu na dynamiczną naturę cząsteczek RNA, a także jest pracochłonne i kosztowne. Techniki sondowania struktury RNA oferują alternatywę, umożliwiając obserwację RNA w rożnych warunkach, w tym in vivo i in vitro. Szybki rozwój protokołów sondowania o dużej przepustowości umożliwił analizę tysięcy cząsteczek RNA jednocześnie, dostarczając kompleksowych zbiorów danych, które można zintegrować z modelami komputerowymi w celu poprawy dokładności przewidywań struktury RNA. W tej pracy przedstawiłam dwie nowe metody obliczeniowe: probNORM i rnaCARD. probNORM to uniwersalna metoda analizy danych z eksperymentów sondowania struktury drugorzędowej RNA o dużej przepustowości, obliczająca reaktywność poszczególnych nukleotydów na podstawie skorygowanego rozkładu sygnału w próbce kontrolnej. Ta metoda umożliwia uzyskanie silnego sygnału z dobrą rozdzielczością między nukleotydami jedno- i dwuniciowymi w strukturze RNA. rnaCARD została opracowana do porównywania dwóch alternatywnych struktur drugorzędowych RNA, pozwalając na odkrycie podobieństw i różnic między strukturami na podstawie ich reprezentacji w notacji abstrakcyjnych kształtow RNA. Obie metody zostały opracowane w języku Python, wraz z aplikacjami internetowymi napisanymi w języku R Shiny. Stworzone metody zastosowałam do przeprowadzenia kompleksowej analizy struktur drugorzędowych RNA regionów UTR wirusa Zika. Na podstawie reaktywności obliczonych za pomocą probNORM, przeprowadziłam modelowanie struktury RNA czterech izolatow wirusa Zika a następnie zidentyfikowałam nowe cechy strukturalne za pomocą rnaCARD. The structure of RNA is a key determinant of its function, as the conformational dynamics of RNA molecules is essential for their roles in, e.g., gene expression regulation and protein synthesis. Accurate determination of RNA structure using methods like NMR or X-ray crystallography is challenging due to the dynamic nature of RNA molecules, as well as being labor-intensive and costly. RNA structure probing techniques offer an alternative, allowing to observe RNA under various conditions, including in vivo and in vitro. The rapid development of high-throughput probing protocols allowed the analysis of thousands of RNA molecules simultaneously, providing comprehensive data sets that can be integrated with computational models to improve the accuracy of RNA structure predictions. In this work, I presented two novel computational methods: probNORM and rnaCARD. probNORM is a universal method for analyzing data from high-throughput RNA secondary structure probing experiments, calculating the reactivity of individual nucleotides based on a corrected distribution of the signal in the control sample. This method enables the recovery of a strong probing signal with good resolution between single- and double-stranded nucleotides within the RNA structure. rnaCARD was developed to compare two alternative RNA secondary structures, allowing for the discovery of similarities and differences between structures based on their representation in the RNA abstract shapes notation. Both methods were developed in Python, along with web services written in R Shiny. Next, I employed both methods to perform a comprehensive analysis of the secondary RNA structures of the Zika virus UTRs. Based on the reactivity signals calculated with probNORM, I modeled the RNA structures of four Zika virus isolates and identified novel structural features using rnaCARD.
Charakterystyka mechanizmów różnicowania elementów przewodzących floemu u roślin
(2024) Michalak, Kornel; Bagniewska-Zadworna, Agnieszka. Promotor; Wojciechowska, Natalia. Promotor pomocniczy
W toku ewolucji rośliny wykształciły tkanki przystosowane do efektywnego transportu substancji. Drewno (ksylem) przewodzi wodę i sole mineralne przez elementy trachealne, natomiast komórki przewodzące łyka (floemu) to elementy sitowe rozprowadzające produkty fotosyntezy. Różnicowanie tych komórek polega na ich dostosowaniu do niezakłóconego przepływu roztworów przez redukcję cytoplazmy i modyfikację ściany komórkowej. W rozwój komórek przewodzących ksylemu zaangażowane są mechanizmy programowanej śmierci komórki (PCD – ang. Programmed Cell Death), prowadzącej do powstania martwych elementów trachealnych o silnie zgrubiałych ścianach. Co ciekawe, analogicznie komórki ze zubożałym protoplastem wykształcane są także podczas floemogenezy. Na drodze różnicowania elementy sitowe pozbawiane są większości organelli, w tym jądra komórkowego, jednak pozostają żywe, zachowując część cytoplazmy skupionej blisko ściany komórkowej. Dotychczas niewiele było wiadomo na temat procesów odpowiedzialnych za częściową i wysoce selektywną redukcję protoplastu podczas floemogenezy. Głównym procesem odpowiedzialnym za usuwanie struktur cytoplazmatycznych jest autofagia, a jej występowanie podczas ksylogenezy potwierdziły liczne prace naukowe. Niewiele wiadomo jednak o roli autofagii selektywnej w rozwoju łyka. Celem pracy była weryfikacja hipotezy badawczej zakładającej, że w różnicowanie komórek przewodzących łyka zaangażowane są procesy degradacyjne, ale ich działanie jest selektywne i nie prowadzi do lizy całego protoplastu, tak jak w przypadku PCD podczas rozwoju komórek przewodzących drewna. Materiałem badawczym były korzenie roślin modelowych. W oparciu o analizy anatomiczne, cytologiczne i molekularne scharakteryzowano mechanizmy odpowiedzialne za redukcję cytoplazmy w elementach sitowych korzeni topoli kalifornijskiej (Populus trichocarpa Torr. et A. Gray ex Hook.). Zidentyfikowano także cytologiczne i molekularne markery autofagii występujące podczas floemogenezy. Ponadto, analizując korzenie innych gatunków oddalonych ewolucyjnie, od paproci do dwuliściennych, udowodniono, że autofagia to proces specyficzny dla różnicowania zarówno drewna i łyka roślin naczyniowych. Nie stwierdzono natomiast specyficznego wzorca ewolucji dla składu ściany komórkowej tkanek przewodzących. W porównaniu do konserwatywnego charakteru autofagii, formowanie ściany komórkowej tkanek przewodzących jest bardzo zmienne. Dla każdego z badanych gatunków udokumentowano różny skład ściany komórkowej dla ksylemu bądź floemu. W pracy zaproponowano także wzory mechanizmów degradacyjnych u roślin w warunkach ich prawidłowego rozwoju oraz w reakcji na stres abiotyczny i biotyczny. Różnicowanie ksylemu i floemu zachodzące w wyniku śmierci komórki lub tylko częściowego zaniku organelli stanowi bardzo dobry model badawczy dla mechanizmów odpowiedzialnych za intensywne zmiany w składzie cytoplazmy i ściany komórkowej. Uzyskane wyniki znacząco poszerzyły dotychczasową wiedzę na temat różnych ścieżek selektywnej degradacji cytoplazmy oraz metod ich badania. In the course of evolution, plants have developed tissues adapted to the efficient transport of substances. Xylem conducts water and mineral salts through tracheal elements, while phloem conducting cells known as sieve elements, distributing products of photosynthesis. The differentiation of these cells involves the adaptation to ensure the uninterrupted flow of solutions by reducing the cytoplasm and modifying the cell wall. Programmed Cell Death (PCD) mechanisms are involved in the development of xylem conducting cells. In the case of xylogenesis, tracheary elements become dead, therefore empty, and their walls become extensively thickened. Interestingly, analogically cells with reduced protoplast are formed during phloemogenesis as well. In the course of differentiation, sieve elements are deprived of most organelles, including the nucleus, but they remain alive, retaining part of the cytoplasm concentrated close to the cell wall. So far, little has been known about the processes responsible for the partial and highly selective reduction of the protoplast during phloemogenesis. The main process responsible for the removal of cytoplasmic structures is autophagy, and its occurrence during xylogenesis has already been confirmed. However, little is known about the role of selective autophagy in the development of phloem. The aim of the work was to verify the research hypothesis, assuming that degradative processes are involved in the differentiation of phloem conductive cells, but their operation is selective and does not lead to the lysis of the entire protoplast, as is the case of PCD during the development of xylem conducting cells. The research material consisted of the roots of model plants. Using the black cottonwood (Populus trichocarpa Torr. et A. Gray ex Hook.) as well as anatomical, cytological and molecular analyses, the mechanisms responsible for the reduction of cytoplasm in sieveelements were characterized. Cytological and molecular markers of autophagy occurring during phloemogenesis were also identified. Moreover, by analyzing the roots of other evolutionarily distant species, ranging from ferns to dicotyledons, it was proven that autophagy is a process specific to the differentiation of both the xylem and phloem in vascular plants. However, no specific evolutionary pattern was found for the composition of the cell walls of conducting tissues. Compared to the conserved nature of autophagy, cell wall formation is very variable. For each examined species, different cell wall composition for xylem or phloem were documented. The thesis also proposes patterns of degradation mechanisms in plants under conditions of their normal development and in response to abiotic and biotic stresses. The differentiation of xylem and phloem, undergoing in the result of cell death or just partial reduction of organelles, is a very good research model for the mechanisms responsible for intensive changes in the composition of the cytoplasm and cell wall. The obtained results significantly extended the current knowledge on different pathways of cytoplasmic selective degradation and methods of their study.
Akumulacja, mobilność i biodostępność radioizotopów oraz ich wpływ na wybrane elementy ekosystemu supraglacjalnego
(2024) Buda, Jakub; Zawierucha, Krzysztof. Promotor; Łokas, Edyta. Promotor
Antropogeniczny wpływ na ekosystemy znacznie wzrósł od II wojny światowej. Nawet odległe regiony górskie i polarne nie są już wolne od zanieczyszczeń. Szczególnym zagrożeniem powstałym w wyniku działań wojskowych i energetycznych są radioizotopy. Biogeniczny osad na powierzchni lodowców (kriokonit) gromadzi atmosferyczne zanieczyszczenia, w tym radioizotopy. Kriokonit jest istotnym komponentem funkcjonowania lodowców, natomiast stężenie radioizotopów w kriokonicie są wyższe niż w otaczających siedliskach. Głównym celem jest zrozumienie, czy podwyższone stężenia radioizotopów mogą zagrażać organizmom zamieszkującym lodowce i otaczające ekosystemy. Uzyskane wyniki zapewniają kompleksowy przegląd rozmieszczenia przestrzennego, bioakumulacji, mobilności i zagrożeń promieniowania jonizującego na organizmy lodowcowe w Alpach. Badania te są jednymi z niewielu, które odpowiadają na pytanie, czy antropogeniczna radioaktywność wpływa na organizmy poza miejscami katastrof i miejscami testowania broni jądrowej. Ponadto, teza zawiera pierwsze dowody na to, że wysokie stężenia radioizotopów na lodowcach są efektem bioakumulacji co może zagrażać bioróżnorodności i funkcjonowaniu tego ekosystemu. Jest to ważne, ponieważ małe alpejskie lodowce znikną w ciągu 50 lat, uwalniając radioizotopy stanowiąc intensywną presję abiotyczną na ekosystemy związane z lodowcami. Anthropogenic pressure on ecosystems have increased significantly since World War II. Even remote mountain and polar regions are no longer free from pollution. Radioisotopes pose a particular threat resulting from military and energy activities. Biogenic sediment on the surface of glaciers (cryoconite) accumulates atmospheric pollutants, including radioisotopes. Cryoconite is an essential component of glacier functioning, and the concentrations of radioisotopes in cryoconite are higher than in the surrounding habitats. The main goal is understanding whether elevated radioisotope concentrations may threaten organisms inhabiting glaciers and surrounding ecosystems. The results provide a comprehensive overview of the spatial distribution, bioaccumulation, mobility and risks of ionising radiation to glacial organisms in the Alps. This research is one of the few that answers the question of whether anthropogenic radioactivity affects organisms outside disaster sites and nuclear weapons testing sites. Moreover, the thesis contains the first evidence that high radioisotope concentrations on glaciers result from bioaccumulation, which may threaten biodiversity and the functioning of this ecosystem. This is important because small alpine glaciers will disappear within 50 years, releasing radioisotopes and intensifying abiotic pressure on glacier-related ecosystems.
Identyfikacja i charakterystyka genów warunkujących komórkową homeostazę poliamin w starzeniu liści jęczmienia
(2024) Stolarska, Ewelina; Sobieszczuk-Nowicka, Ewa. Promotor; Tanwar, Umesh Kumar. Promotor pomocniczy
Starzenie rozwojowe jest procesem nieodwracalnym, po którym następuje bezwarunkowo śmierć komórki. Indukowane ciemnością starzenie liści (ang. dark-induced leaf senescence, DILS) jest do pewnego stadium procesem odwracalnym. W roślinach indukowane starzenie jest wysoce kontrolowanym i aktywnym procesem wymagającym globalnego przeprogramowania metabolicznego, mającego na celu zorganizowaną dezintegrację i ponowną remobilizację cennych zasobów. Sprawność regulacji indukowanego procesu starzenia jest oznaką żywotności starzejących się komórek, które na każdym etapie muszą zachować zdolność do utrzymania homeostazy, przejawiającej się m.in. kontrolowaniem homeostazy cyklu poliamin (PA). Homeostaza PA w komórce jest utrzymywana przez mechanizmy sprzężenia zwrotnego z poziomu biosyntezy, katabolizmu, importu i eksportu. Poliaminy są niskocząsteczkowymi organicznymi kationami należącymi do grupy biogennych amin, kluczowymi w wielu fizjologicznych i rozwojowych procesach u bakterii, zwierząt i roślin. Metabolizm PA może odgrywać istotną rolę w procesie starzenia się liścia. Zespół prof. Ewy Sobieszczuk-Nowickiej za cel postawił sobie poznanie wielokierunkowych powiązań metabolizmu poliamin z siecią metaboliczną organizującą proces starzenia liści jęczmienia oraz ocenę, czy zmiana kierunku starzeniowo-zależnego metabolizmu PA wpłynie na ten proces. Kierunek metabolizmu PA i transport może kontrolować efektywność zależnej od starzenia remobilizacji azotu. Do realizacji celu wybrano podejście oparte na genomice funkcjonalnej. Brak w literaturze informacji na temat sekwencji genów metabolizmu PA w jęczmieniu był dużym ograniczeniem tego podejścia. Stąd też potrzebna była identyfikacja genów metabolizmu PA w jęczmieniu, która stała się celem mojej rozprawy doktorskiej. Do badań włączyłam również analizę transporterów PA. Transportery PA są rozpoznane u roślin w niewielkim stopniu. Importery PA zostały opisane u rzodkiewnika, ryżu i pomarańczy. Eksportery PA zostały zasugerowane jako potencjalne eksportery PA u rzodkiewnika i ryżu. W wyniku badań w skali całego genomu jęczmienia wyodrębniłam rodziny genów warunkujące homeostazę PA w komórce, które obejmowały 23 geny metabolizmu PA i 13 genów transporterów. Przeprowadziłam również szczegółową charakterystykę zidentyfikowanych genów oraz ich białkowych produktów. Modelowanie homologiczne badanych transporterów pozwoliło z dużą dokładnością przewidzieć struktury trójwymiarowe białek, a analizy dokowania molekularnego potwierdziły możliwość interakcji pomiędzy białkami transportującymi a PA. Obecność w genomie zidentyfikowanych in silico genów potwierdziłam eksperymentalnie i zbadałam ich organospecyficzną ekspresję. Następnie w modelu starzenia liści jęczmienia indukowanego ciemnością zbadałam profile ekspresji genów homeostazy PA. Na podstawie tej analizy wytypowałam geny kandydujące do badań funkcjonalnych. Niniejsza rozprawa doktorska przedstawia wyniki pierwszej identyfikacji, izolacji i kompleksową charakterystykę genów jęczmienia warunkujących komórkową homeostazę PA oraz ocenę ich organospecyficznej i starzeniowo-zależnej ekspresji w metabolizmie liścia ekspresji. Wyniki moich badań stanowią punkt odniesienia badań funkcjonalnych wielu zespołów naukowców wyjaśniających mechanizmy molekularnej kontroli i regulacji przez PA procesów rozwojowych zbóż i ich reakcji na (a)biotyczne czynniki środowiska. Szczególnie badań funkcjonalnych nad mechanizmem działania PA w starzeniu liści. Developmental senescence is an irreversible process that is inevitably followed by cell death. Dark-induced leaf senescence (DILS) is a reversible process to a certain stage. In plants, induced senescence is a highly controlled and active process requiring global metabolic reprogramming aimed at the organized disintegration and remobilization of valuable resources. The efficiency of the regulation of the induced senescence process is a sign of the viability of senescent cells, which at each stage must maintain the ability to maintain homeostasis, manifested, among others, by controlling polyamine (PA) cycle homeostasis. PA homeostasis in the cell is maintained by feedback mechanisms from the levels of biosynthesis, catabolism, import and export. Polyamines are low molecular weight organic cations belonging to the group of biogenic amines, crucial in many physiological and developmental processes in bacteria, animals and plants. PA metabolism may play an important role in the leaf senescence process. Professor Ewa Sobieszczuk-Nowicka's team set themselves the goal to understand the multidirectional connections of polyamine metabolism with the metabolic network organizing the senescence process of barley leaves and to assess whether a change in the direction of senescence-dependent PA metabolism will affect this process. The direction of PA metabolism and transport may control the efficiency of senescence-dependent nitrogen remobilization. An approach based on functional genomics was chosen to achieve the goal. The lack of information in the literature on the sequence of PA metabolism genes in barley was a major limitation of this approach. Hence, there was a need to identify PA metabolism genes in barley, which became the goal of my doctoral thesis. I also included the analysis of PA transporters in my research. PA transporters are little known in plants. PA importers have been described in Arabidopsis, rice and orange. PA exporters have been suggested as potential PA exporters in Arabidopsis and rice. As a result of research on the entire barley genome, I identified gene families determining PA homeostasis in the cell, which included 23 PA metabolism genes and 13 transporter genes. I also carried out a detailed characterization of the identified genes and their protein products. Homology modeling of the studied transporters allowed to predict the three-dimensional structures of proteins with high accuracy, and molecular docking analyzes confirmed the possibility of interactions between transport proteins and PA. I experimentally confirmed the presence of the genes identified in silico in the genome and examined their organospecific expression. Then, in a dark-induced barley leaf senescence model, expression profiles of PA homeostasis genes. Based on this analysis, I selected candidate genes for functional research. This doctoral dissertation presents the results of the first identification, isolation and comprehensive characterization of barley genes determining cellular PA homeostasis, as well as the assessment of their organospecific and senescence-dependent expression in leaf metabolism. The results of my research constitute a reference point for functional studies of many teams of scientists explaining the mechanisms of molecular control and regulation by PA of crop development processes and their response to (a)biotic environmental factors. Especially functional studies on the mechanism of action of PA in leaf senescence.
Struktura zbiorowisk grzybów ektomykoryzowych w gradiencie środowiskowym
(2024) Durska, Anna; Mucha, Joanna. Promotor; Kurek, Przemysław. Promotor
Występowanie roślin w gradiencie środowiskowym jest ograniczone czynnikami abiotycznymi oraz biotycznymi i często zależy od kierunkowych zmian zachodzących w drobnych korzeniach (< 2 mm średnicy) a w szczególności od zmian w obrębie zbiorowisk grzybów mykoryzowych, umożliwiających wzrost roślin w różnych warunkach siedliskowych. Wśród korzeni drobnych możemy rozróżnić dwa funkcjonalne segmenty: 1) korzenie pełniące role strukturalne i transportowe oraz 2) drobne korzenie chłonne, które biorą udział głównie w pozyskiwaniu i wchłanianiu substancji pokarmowych z gleby. Ze względu na zdolność wchłaniania wody i składników odżywczych drobne korzenie chłonne są najbardziej dynamicznym i najważniejszym funkcjonalnie elementem systemu korzeniowego drzew. Natomiast grzyby mykoryzowe stanowią integralną ich część, istotną ze względu na funkcję pozyskiwania składników pokarmowych, w tym azotu i fosforu. Celem niniejszej pracy była analiza zmienności zbiorowisk grzybów ektomykoryzowych (ECM) zasiedlających drobne korzenie sosny zwyczajnej w gradiencie szerokości geograficznej oraz związanej z tym zmienności warunków klimatycznych i dostępności składników pokarmowych (transekt: Szwecja). Grzyby ECM zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania fragmentu ITS. W dalszej części pracy zbadano zmienność zawartości makroelementów (C, N, P, Mg, K, Ca) oraz mikroelementów (Fe, Na, Zn, Cu, B i Al) w drobnych korzeniach sosny zwyczajnej, pełniących odmienną funkcję: absorpcyjną – pierwszy rząd i transportową – siódmy rząd (transekt: Szwecja, Finlandia i Polska). Wykazano, że w gradiencie szerokości geograficznej, wraz ze wzrostem odległości od równika, obserwowane bogactwo gatunków ECM nie różniło się istotnie pomiędzy badanymi regionami Szwecji. Wyniki pozwalają na odrzucenie hipotezy o zmniejszeniu bogactwa gatunkowego grzybów ECM wraz z obniżeniem się średniej temperatury rocznej. Ponadto, w gradiencie malejącej średniej rocznej temperatury zaobserwowano zmianę głównego komponentu zbiorowisk grzybów ECM – od rodzaju Suillus na południu, do zbiorowisk zdominowanych przez obecność grzybów z rodzaju Piloderma na północy. Głównymi czynnikami abiotycznymi, które kształtują zbiorowiska grzybów ECM sosny zwyczajnej w Szwecji są: średnie roczne opady, pH gleby i stężenie żelaza (Fe) w glebie. Istotnym elementem pracy było określenie zmienności zbiorowisk grzybów ektomykoryzowych zasiedlających korzenie drobne buka zwyczajnego w gradiencie dostępności składników pokarmowych (transekt: Polska). W celu zminimalizowania wpływu warunków klimatycznych na badaną zmienność, do badań wytypowano drzewostan umieszczony na zboczu rynny polodowcowej o 30% nachyleniu. Ukształtowanie terenu na powierzchni badawczej wytworzyło naturalny gradient składników pokarmowych i mineralnych. Zaobserwowano istotną zmienność gatunkową grzybów mykoryzowych oraz zmianę ilości korzeni I rzędu skolonizowanych przez symbionty ECM w gradiencie dostępności składników pokarmowych. Wyniki pracy wskazują, że struktura taksonomiczna grzybów ECM związanych z bukiem jest determinowana przez właściwości fizyko-chemiczne gleby jak wartość pH oraz zasobność w tlenek fosforu (V). The distribution of plants along environmental gradients is constrained by abiotic and biotic factors and often depends on directional changes occurring in fine roots diameter (< 2 mm) in particular on changes within mycorrhizal fungal communities, enabling plant growth in diverse habitats. Fine roots consist of compartments that perform different functions: absorptive fine roots are mainly involved in acquiring and absorbing soil resources, while transporting fine roots play structural and transportation roles. Due to their capacity in the absorption of water and nutrients, they are the most dynamic and functionally most important element of the tree root system. Mycorrhizal fungi are an integral part of the fine roots due to their potential to foraging nutrients, including nitrogen and phosphorus. The aim of the doctoral dissertation was to determine the variability of diversity and composition of ectomycorrhizal (ECM) fungal communities inhabiting fine roots of Scots pine along the latitude gradient and the related variability of climatic conditions and nutrient availability in Sweden. ECM taxa were identified using internal transcribed spacer (ITS) sequencing from ECM root tips. Further in this study, it has been examined the variability of contents of important biogenic elements (such as macroelements (C, N, P, Mg, K, Ca) and microelements (Fe, Na, Zn, Cu, B, and Al)) in fine roots of Scots pine which perform a different function: absorption (first order) and transport (seventh order). For these purpose samples were collected in an extended transect covering Sweden, Finland and Poland. Results showed that along the latitude gradient, with increasing distance from the equator, the observed ECM species richness did not substantially change across the research regions. This allows us to reject the hypothesis that a decrease in the average annual temperature would result in a decline in the species richness of the ECM fungi. Additionally, across the MAT gradient, there was a noticeable shift from ECM fungal community dominated by the genus Suillus to community where fungi from the genus Piloderma predominated. The result indicated that the main abiotic factors that affect and shape the ECM fungal communities of Scots pine across Sweden are the mean annual precipitation, soil pH and soil Fe concentration. Moreover, the characterization of ECM fungal communities associated with European beech along local nutrient availability gradient was determined. Soil and roots samples were taken from beech forest located on 30% slope formed by glacial erosion in Poland. Slope location impact the spatial distribution of moisture and soil chemical properties, which give the opportunity to investigate the influencing factors of ECM fungi community in reduced impact of climate conditions. The research findings indicated the significant species variability and an alteration in the number of beech first-order roots colonized by ECM symbionts and revealed that soil pH and phosphorus content had the crucial impact on the diversity and composition of root fungal communities of European beech at the tested location.
Identyfikacja nowych modyfikatorów niekanonicznej biosyntezy toksycznego białka poliglicynowego ze zmutowanego mRNA FMR1
(2024) Tutak, Katarzyna; Sobczak, Krzysztof. Promotor; Baud, Anna. Promotor pomocniczy
Choroby związane z premutacją łamliwego chromosomu X (FXPAC) wynikają z mutacji w genie FMR1 na chromosomie X, który odpowiada za produkcję białka FMRP. Rejon regulatorowy genu FMR1 zawiera między 25–35 powtórzeń trójki nukleotydowej CGG, natomiast patologiczna ekspansja w zakresie od 55 do 200 powtórzeń leży u podstaw FXPAC, prowadząc do chorób takich jak zespół drżenia/ataksji związanej z łamliwym chromosomem X (FXTAS) i przedwczesne wygasanie funkcji jajników (FXPOI). Patomechanizmy zaangażowane w wywołanie i progresję FXPAC obejmują sekwestrację białek do toksycznego RNA tworzącego struktury drugorzędowe, kotranskrypcyjne powstawanie tzw. pętel R powodujących uszkodzenie DNA oraz związaną z powtórzeniami translację typu RAN, która prowadzi do produkcji toksycznych białek, zwłaszcza białek poliglicynowych FMRpolyG agregujących w mózgu pacjentów. Głównym celem pracy doktorskiej była identyfikacja nowych modyfikatorów translacji RAN. W badaniu zidentyfikowano ponad 60 białek wiążących się ze zmutowanym mRNA FMR1 i wśród nich scharakteryzowano czynniki regulujące translację RAN. W szczególności zubożenie niektórych białek, w tym RPS26, RPS25, DHX15, DDX21 i ALYREF, wpłynęło na poziom i agregację FMRpolyG, podkreślając ich rolę w patologii FXPAC. Praca to dostarcza wglądu w mechanizmy FXPAC i identyfikuje nowe modyfikatory translacji RAN, co sugeruje, że skład podjednostki 40S ma kluczowe znaczenie w regulacji tego procesu. Fragile X-premutation-associated conditions (FXPAC) stem from mutations in the FMR1 gene on the X chromosome, which affects the fragile X messenger ribonucleoprotein 1 protein (FMRP) production. Normal FMR1 genes have 25–35 CGG repeats, but expansions to 55–200 repeats cause FXPAC, leading to conditions like fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS) and primary ovarian insufficiency (FXPOI). FXPAC pathology involves toxic RNA forming secondary structures, co-transcriptional R loops causing DNA damage, and repeat-associated non-ATG (RAN) translation producing harmful proteins, notably FMRpolyG, which aggregates in the brain. The main aim of PhD thesis was to identify novel RAN translation modifiers. The study identified over 60 proteins binding to mutant FMR1 mRNA, with some regulating RAN translation. Specifically, depletion of certain proteins, including RPS26, RPS25, DHX15, DDX21, and ALYREF, impacted FMRpolyG levels and aggregation, highlighting their role in FXPAC pathology. This research provides insights into FXPAC mechanisms and identifies novel RAN translation modifiers, suggesting the 40S subunit's composition is crucial in CGG-related RAN translation regulation.
Kodowanie informacji o gatunku i osobniku w śpiewie Afrykańskich turkaweczek z rodzaju (Turtur sp.)
(2024) Niśkiewicz, Małgorzata; Osiejuk, Tomasz Stanisław. Promotor
Śpiew i wokalizacje ptaków pełnią istotną rolę w ich codziennym życiu, ale szczególnie ważne są w kontekście znalezienia partnera i obrony terytorium. Żeby pełnić te funkcje, śpiew powinien zawierać informację o ich przynależności gatunkowej, a jednocześnie zawierać cechy umożliwiające rozpoznawanie osobników wewnątrz gatunku. W mojej rozprawie badałam afrykańskie turkaweczki, gołębie z rodzaju Turtur, opisując po raz pierwszy ich repertuar wokalny, głównie pod kątem rozpoznawania gatunkowego i osobniczego, a także przeprowadzając eksperymenty z playbackiem, testujące wybrane funkcje śpiewu. W tym celu brałam udział w badaniach terenowych w Nigerii, Mozambiku, Ghanie i Ugandzie w latach 2019-2023 zbierając dane dotyczące śpiewu i innych aspektów biologii. Ponieważ ten rodzaj nie był dobrze poznany, początkowo zbieraliśmy podstawowe dane biometrycznych, próbki krwi oraz piór, a także obserwowaliśmy zachowania i nagrywaliśmy wokalizacje. Dane te pozwoliły na poznanie powiązań filogenetycznych pomiędzy badanymi gatunkami, ich cech morfologicznych, preferencji środowiskowych a przede wszystkim na pełny opis zmienności śpiewu. Analizy genetyczne potwierdziły zakładane związki filogenetyczne między gołębiami, w których dwa większe gatunki preferujące leśne habitaty są ze sobą bliżej spokrewnione niż z pozostałymi trzema gatunkami z otwartych terenów, co pokazywały również dane morfologiczne. Analiza śpiewu wykazała dwuczęściową strukturę piosenek, gdzie u wszystkich gatunków początkowa część jest bardziej różnorodna, cichsza i zawiera duży potencjał do kodowania informacji specyficznej osobniczo. Z kolei końcowa część jest bardziej jednorodna, głośniejsza, przez co niesie się na dalsze odległości, mając większy potencjał do kodowania informacji o gatunku. W drugiej fazie badań przeprowadzaliśmy eksperymenty z playbackiem w celu sprawdzenia naszych założeń teoretycznych dotyczących rozpoznawania gatunkowego i osobniczego. W pierwszym eksperymencie testowaliśmy dwa leśne gatunki (T. brehmeri i T. tympanistria) żyjące w populacji sympatrycznej oraz jednego z nich (T. tympanistria) w populacji allopatrycznej. Ptakom zaprezentowano playbacki ze śpiewem ich własnego gatunku, gatunku blisko spokrewnionego oraz kontroli. W populacji sympatrycznej oba badane gatunki reagowały silnie tylko na śpiew własnego gatunku, a w allopatrycznej samce T. tympanistria reagowały na playback obu gatunków gołębi. Podobny eksperyment przeprowadziliśmy na dwóch gatunkach sawannowych (T. afer i T. chalcospilos) żyjących w populacji sympatrycznej z dodatkowym, mieszanym playbackiem zawierającym pierwszą część piosenki jednego gatunku z końcową drugiego i odwrotnie. Badane samce (T. chalcospilos) reagowały silnie tylko na własny gatunek, zupełnie jak w przypadku gołębi leśnych. Natomiast playback mieszanych śpiewów nie wywoływał mocnej reakcji, co świadczy o tym, że jedna część piosenki nie wystarcza by ptak rozpoznał ją jednoznacznie jako należącą do swojego gatunku. Ostatni eksperyment dotyka już problemu rozpoznawania osobniczego i został przeprowadzony T. brehmeri. Samcom zostały zaprezentowane playbacki sąsiadów oraz obcych ptaków z lokalnej populacji. Gołębie reagowały dużo silniej na playback obcego niż sąsiada, co pokazuje, że są w stanie rozpoznawać się indywidualnie i reagują zgodnie z hipotezą drogiego wroga. Podsumowując, turkaweczki tworzą grupę z podobną składnią śpiewu, jednak zawsze specyficzną gatunkowo i charakterystyką ukształtowaną zgodnie z preferencjami środowiskowymi i jego akustyką. Zbadane eksperymentalnie gatunki wykazują zachowania wskazujące, iż podczas interakcji terytorialnych są one zdolne do przetwarzania informacji związanych z kodowaniem tożsamości na różnych poziomach, co pomaga im w podejmowaniu optymalnych decyzji dotyczących obrony terytorium i wabienia partnerki. The song and other vocalisations of birds play an important role in many aspects of their daily lives but are particularly important in the context of mate attraction and territory defence. To fulfil these functions, song should enable birds to convey information about species identity and, at the same time, contain features that allow individual discrimination within a species. In my thesis, I have studied African doves of the Turtur genus, exploring their vocal repertoire, mainly in terms of species and individual recognition. To this purpose, I participated in field research in Nigeria, Mozambique, Ghana and Uganda between 2019 and 2023, collecting data on the vocalisations and other biological features of the Turtur doves. As this group of birds was not well studied, the first trips were mainly dedicated to collecting biometric data, blood and feather samples, as well as, observing the behaviour and recording the vocalisations of individuals from each species. These data allowed us to describe the phylogenetic relationships between the species, their morphological characteristics and habitat preferences, and – most of all - a complete description of within and- between species song variation. The analysis of the genetic material confirmed the assumed phylogenetic relationships between doves, in which two larger species preferring a forest habitat are more closely related to each other than to the remaining three species from more open areas, as also shown by the morphological data. Song analysis of all species showed shared two-part song structure, where in all species, the initial part is more diverse, quieter and has a high potential for encoding individual specific information. Conversely, the final part is more homogeneous in structure and louder across the genus, and carries over further distances, having more significant potential to encode information about the species. During the study's second phase, we conducted playback experiments to test some theoretical assumptions about species and individual recognition in the Turtur genus. In the first, we tested two forest species (T. brehmeri and T. tympanistria) living in sympatry and one of them (T. tympanistria) in an allopatric population. Both groups were introduced to playbacks with the song of a conspecific, a congeneric and a control. In the sympatric population, both tested species responded strongly only to the songs of their own species, whereas in the allopatric population, T. tympanistria males responded to the playback of both dove species. We conducted a similar experiment in two savannah species (T. afer and T. chalcospilos) living in sympatry with an additional playback containing the first part of the song from one species with the final part from the other, and vice versa. The tested males (T. chalcospilos) reacted strongly only to their own species, like forest doves. In contrast, the additional mixed playback did not elicit strong responses, indicating that one part of the song is insufficient for the bird to categorised the song as coming from its species. The last experiment addressed the problem of individual recognition and was conducted on the largest forest species (T. brehmeri). The males were presented with playbacks of songs from their neighbour and stranger birds of their species from the same population. Doves reacted stronger to the playback of strangers than neighbours, indicating – for the first time for doves - that also in this family, birds are able to discriminate between neighbours and strangers and behave according to the dear enemy hypothesis predictions. Summarising the results from the study presented in this thesis, wood doves of the genus Turtur share a song of a similar, two-part structure but with both species and individually specific phrases, and they are capable of processing this identity information during territorial interactions, which helps them to make optimal decisions regarding territory defence and mate attraction.
Charakterystyka działania wybranych glikoalkaloidów z rodziny Solanaceae na kluczowe procesy metaboliczne u chrząszcza Tenebrio molitor
(2024) Winkiel, Magdalena Joanna; Słocińska, Małgorzata. Promotor; Chowański, Szymon. Promotor
Środki ochrony roślin są stosowane w ogromnych ilościach do ograniczania populacji szkodników, co przyczynia się do zanieczyszczenia środowiska i stanowi zagrożenie dla innych organizmów. Związki pochodzenia roślinnego dają możliwość ograniczenia użycia pestycydów. Są to substancje biodegradowalne, bardziej bezpieczne w stosowaniu, a także stosunkowo łatwe i tanie w pozyskaniu. Glikoalkaloidy (GA) to wtórne metabolity roślinne, które wykazują znaczną aktywność biologiczną, także w organizmach owadów. Mechanizmy ich działania nie zostały jednak precyzyjnie poznane. Celem przedstawionej rozprawy doktorskiej było określenie wpływu wybranych GA na kluczowe procesy metaboliczne larw chrząszcza Tenebrio molitor. W tym celu przeprowadzono szereg badań, w których testowano wpływ solaniny, chakoniny i tomatyny oraz ekstraktu uzyskanego z liści pomidora. Analizowano efekty działania GA po ich aplikacji za pomocą iniekcji w dwóch stężeniach 10-8 i 10-5 M. Testowane tkanki izolowano po 2 i po 24 godzinach od aplikacji GA. Z racji funkcji troficznej, skupiono się na analizie zmian w obrębie jelita, ciała tłuszczowego i hemolimfy. Pozwoliło to również na określenie specyficzności tkankowej GA. Prace badawcze rozpoczęto od analizy zmian poziomu GA w poszczególnych tkankach w czasie, po ich wcześniejszej aplikacji na drodze iniekcji. Następnie określono wpływ testowanych związków na poziom substratów energetycznych (lipidów, węglowodanów i aminokwasów) w tkankach owada. Ponadto, dokonano pomiaru zmian poziomu ekspresji genów kodujących kluczowe enzymy szlaków metabolicznych: glikolizy (fosfofruktokinaza), cyklu Krebsa (syntaza cytrynianowa) i β-oksydacji kwasów tłuszczowych (dehydrogenaza hydroxyacylo-CoA), a także głównych białek antyoksydacyjnych (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza) i białek szoku cieplnego HSP70 po aplikacji GA. Dodatkowo, określono wpływ GA na aktywność wymienionych enzymów oraz proces peroksydacji lipidów. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że mechanizmy działania testowanych związków w tkankach mącznika różnią się w zależności od rodzaju i stężenia GA, czasu inkubacji oraz typu badanej tkanki. Związki te wpływają na poziom ekspresji genów i aktywność białek zaangażowanych w kluczowe ścieżki metaboliczne. Poza tym, GA zmieniają zawartość składników odżywczych w tkankach owadów, prawdopodobnie w wyniku zwiększonego zapotrzebowania energetycznego podczas wzmożonego procesu detoksykacji. Badane związki znacząco wpływają na metabolizm chrząszczy, co sugeruje możliwość ich potencjalnego zastosowania jako naturalnych bioinsektycydów. Plant protection products are used in huge quantities to reduce pest populations, which contributes to environmental pollution and poses a threat to other organisms. Plant-derived compounds offer an opportunity to reduce the use of pesticides. They are biodegradable, safer to use, easy and inexpensive to obtain. Glycoalkaloids (GA) are secondary plant metabolites that exhibit significant biological activity, also in insect organisms. However, their mechanisms of action have not been precisely studied. The aim of the presented PhD thesis was to determine the effects of selected GA on key metabolic processes in larvae of the beetle Tenebrio molitor. For this purpose, a series of experiments were carried out, in which solanine, chaconine, tomatine, and tomato leaf extract were tested at two concentrations, 10-8 and 10-5 M. The selected compounds were administered to larvae by injection. Tissues were isolated 2 and 24 hours after GA application. Tested samples were prepared separately from the gut, fat body and hemolymph to determine the tissue specificity of the observed effects, because of tropfic function of these tissues. The study began with quantitative analysis of GA over time after their injection. Subsequently, the effects of these compounds on nutrient levels (lipids, carbohydrates and amino acids) in the insect's tissues were determined. In addition, changes in the expression of genes encoding key enzymes of metabolic pathways: glycolysis (phosphofructokinase), Krebs cycle (citrate synthase) and fatty acid β-oxidation (hydroxyacyl-CoA dehydrogenase), as well as major antioxidant proteins (superoxide dismutase, catalase) and heat shock protein HSP70 after GA application were measured. In addition, the effect of GA on lipid peroxidation process and the catalytic activity of the mentioned enzymes was determined. Based on the results, it was found that the mechanisms of action of the tested compounds in mealworm tissues vary depending on the type and concentration of GA, incubation time and the type of tissue tested. These compounds regulate gene expression and activity of proteins involved in key metabolic pathways. Besides, GAs alter the nutrient content of insect tissues, probably as a result of increased energy requirements during detoxification. The tested compounds significantly affect beetle metabolism, suggesting their potential use as natural bioinsecticides.
Funkcje i mechanizmy wewnątrzgrupowej komunikacji i koordynacji śpiewu podczas obrony terytorialnej u kolektywnie rozmnażającego się gatunku ptaka, wąsala perełkowanego (Trachyphonus margaritatus)
(2024) Issa, Mathieu Mahamoud; Osiejuk, Tomasz Stanisław. Promotor
Zachowania kooperatywnesą istotną cechą gatunków zwierząt żyjących w grupach a ich zrozumienie nadal stanowii wyzwanie dla poznania ewolucji relacji społecznych i koordynacji zadań wykonywanych w obrębie grup społecznych. Osobniki, które chcą współpracować w celu wspólnego działania muszą komunikować się wzajemnie o swoich intencjach w efekcie dochodząc jakoś do porozumienia. W mojej pracy doktorskiej badałem rolę komunikacji wewnątrzgrupowej w inicjowaniu duetów ichórów, które są formą wspólnego popisu wokalnego, w którym dwa lub kilka osobników śpiewa razem w skoordynowany sposób, przekazując wspólny meta-sygnał. W latach 2019-2023 przeprowadziłem kilka sesji badań terenowych w Dżibuti, gdzie zbierałem dane o zachowaniach wokalnych i innych zachowaniach społecznych wąsala perełkowanego (Trachyphonus margaritatus), gatunku ptaka spoza tzw. ptaków śpiewających (Oscines), który żyje w parach bądź małych grupach społecznych i broniących całoroczne terytoria. Ponieważ zachowania społeczne i repertuar wokalny tego gatunku są słabo zbadane, pierwszym celem mojej pracy było zebranie podstawowych danych dotyczących zachowań społecznych i wokalnych. Do ich zbadania wykorzystałem pasywny monitoring akustyczny, który pozwolił mi na opis codziennej aktywności wokalnej oraz repertuaru wokalnego wąsali perełkowanych. Udało mi się zidentyfikować cztery różne wokalizacje używane podczas interakcji wewnątrz grupy. Odkryłem również, że różne grupy wąsali były aktywne wokalnie głównie rano a nawoływania spajające, służące podtrzymaniu spójności grypy, były często używane przed rozpoczęciem popisu wokalnego w postaci duetu lub chóru. W drugiej części mojego projektu badawczego zbadałem, w jaki sposób wąsale perełkowane inicjują swoje wspólne popisy wokalne. Wiadome już było, że wąsale perełkowane inicjują duety i chóry z pomocą tzw. „głosów przed-duetowych” (opisywanych również jako głosy „chewp”) podczas swego rodzaju „ceremonii powitania”. Jednak natura tych wokalizacji i ich funkcje nie były znane. Nagrywałem kamerą wideo pokazy wąsali w kilku grupach podczas eksperymentów z odtwarzaniem ich śpiewu. Dzięki temu udało mi się szczegółowo opisać, w jaki sposób używają one swoich wokalizacji. Zbadałem również możliwość istnienia sygnału o charakterze multimodalnym. Głosy przed-duetowe mogły być potencjalnie specyficznym sygnałem, który służy jako sygnał rekrutujący osobniki (do wspólnego działania), albo jako sygnał porozumienia osobników do wspólnego rozpoczęcia duetu lub chóru. Udało mi się odnaleźć dwa rodzaje takich wokalizacji, które nazwałem „high chewp” i „low chewp”. Osobnik będący liderem, a więc inicjujący duet lub chór, wydawał większą liczbę głosów high chewpniż osobniki, które za nim podążały i dołączały do zainicjowanego pokazu. Odkryłem również, że osobnik będący liderem, czasami łączył wydawanie dźwięków z chewp z przyjmowaniem postawy ze specyficzną pozycją ogona. Połączenie sygnału dźwiękowego i wizualnego, stanowiło wewnątrzgrupowy sygnał multimodalny, który był pokazywany w celu zainicjowania popisu w postaci duetu lub chóru. Trzecia część mojego projektu skupiała się na zagadnieniach związanych z kontekstem kolektywnych popisów wokalnych i mechanizmach koordynacji śpiewu duetujących osobników. W tym celu wykorzystałem pasywny monitoring akustyczny i eksperymenty z playbackiem, dzięki czemu uzyskałem dane o codziennej aktywności wokalnej poszczególnych grup w zależności od tego w jakim kontekście socjalnym wydają one głosy. Odkryłem, że większość kooperatywnych pokazówwokalnych wykonywanych przez 11 monitorowanych grup wąsali, była wykonana w kontekście interakcji wokalnej z innymi grupami. Wszystkie z 10 grup testowanych w eksperymentach z playbackiem, odpowiadało na niego w sposób wskazujący na jego znaczenie we wspólnej obronie terytorialnej. Wreszcie, badania nad mechanizmami koordynacji śpiewu w duetach u wąsali, nie przyniosły jednoznacznego dowodu wskazującego na interaktywne dopasowywanie śpiewu w czasie między osobnikami duetującymi. Takiedopasowywanie, pozwalałoby na zwalnianie bądź przyspieszanie tempa wspólnej wokalizacji, zgodnie z rytmem partnera. Ptaki jedynie reagowały na rozpoczynanie bądź kończenie śpiewu przez partnera. Podsumowując, wyniki moich badań jednoznacznie pokazują, że u badanego gatunku głosyspójności oraz głosychewpsłużą do inicjowania kolektywnego pokazu wokalnego. Cooperative behaviour is a prominent feature among group living species and continues to pose challenges to our understanding about the evolution of social relationships and task coordination between members of a same social group. Individuals who are willing to cooperate to achieve a joined action need to communicate their intentions and somehow make a common agreement. In my PhD work, I investigated the role of intra-group communication in the initiation of duet and chorus songs which are a form of collaborative acoustic display in which several individuals sing together in a coordinated manner to deliver one meta-signal. I conducted several fieldwork sessions in Djibouti between 2019-2023 to collect data about the vocal and other social behaviour of the Yellow-breasted barbet (Trachyphonus margaritatus), a non-oscine bird species that lives in pairs or small social group and defend a territory year-round. Since the social behaviour and the vocal repertoire of the species as poorly studied, the first aim of my work consisted of gathering data regarding the social and vocal behaviour. To do so, I used passive acoustic monitoring to study the daily calling activity of the barbets as well as the vocal repertoire. I could identify four distinct vocalisations used during within-group interactions. I also found that the different group of barbets were vocally active mainly in the morning, the cohesion calls which might serve to maintain group cohesiveness were often used before the start of a duet or chorus display. In the second part of my research project, I investigated how barbets initiate their communal vocal displays. It is known that the Yellow-breasted barbet initiates its duet and chorus songs with "pre-duet notes" (also described as "chewp" notes) during a kind of "greeting ceremony". However, the nature of these vocalisations and the functions were unknown. I recorded with a video camera several group displays of barbets during playback experiments, in order to describe in detail the way they use such chewp notes. I also investigated the possible existence of a multimodal signal. The pre-duet notes could be a specific signal that serves either as recruitment signal or as mutual agreement between individuals to start a duet or chorus song. I found two variations of such vocalisations: the high chewp and the low chewp. The leading individual who initiated a duet or chorus emitted a higher number of high chewp notes than the followers who joined the display initiated by the leader. I also found that the leading individual sometimes combined the emission of chewp notes with a specific tail posture. The combination of acoustic and visual signal constituted an intra-group multimodal signal that was displayed to initiate duet and chorus songs. The third part of the project focused more on the contexts of the emission of collective vocal displays and the mechanisms of song coordination between duetters. To do so, I used passive acoustic monitoring and playback experiments to monitor the daily vocal activity of different groups according to several social contexts. I found that most of the collective vocal displays given by the 11 groups monitored were emitted in the context of a between-group vocal interaction and that all the 10 groups tested with playback stimulations reacted which suggested a function in joint territorial defense. Finally, the investigation of the mechanisms of song coordination in duetting barbets revealed no clear evidence of interactive timing adjustments in a way that the duetters could accelerate or slow down their rhythm of singing according to their partner’s rhythmic variations. The birds simply reacted when the partner started and stopped singing. Overall, these results highlighted that in this group living bird species, group members actively communicate using cohesion calls and chewp notes to initiate a collective vocal display.
Rola tuneli przejściowych w funkcjonowaniu enzymów z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi
(2024) Thirunavukarasu, Aravind Selvaram; Brezovsky, Jan. Promotor
Enzymy z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi mają prowadzące do nich ścieżki, które nazywane są tunelami. Skupiając się na rodzinie enzymów hydrolaz i podkreślając znaczenie wody w tych tunelach, niniejsze badanie zapewnia cenny wgląd w ich funkcjonalne implikacje. Dzięki wykorzystaniu symulacji dynamiki molekularnej i adaptacyjnych technik próbkowania, stany konformacyjne systemów są dokładnie badane. W szczególności obliczenia tuneli prowadzących do miejsca aktywnego są przeprowadzane dla wszystkich ramek obszernej symulacji, co prowadzi do identyfikacji wcześniej nierozpoznanych tuneli. Śledząc ruch cząsteczek wody z objętości do określonego regionu (miejsca aktywnego) białka, określane są ścieżki transportu wykorzystywane przez enzym podczas symulacji. Aby ułatwić analizę ogromnych ilości danych związanych z tunelami i cząsteczkami wody, opracowano moduł Python o nazwie TransportTools. Moduł ten roku usprawnia analizę obszernych danych dotyczących tuneli i cząsteczek wody. Pomaga w ocenie wykorzystania cząsteczek wody, wydajności transportu i funkcjonalności w strukturach białkowych. Narzędzie to odkryło nowe tunele transportujące wodę w enzymach takich jak dehalogenaza haloalkanowa, zwiększając nasze zrozumienie dynamiki tuneli. Ponadto odkryto, że cząsteczki wody mogą skutecznie poruszać się w wąskich regionach tuneli poprzez interakcje wiązań wodorowych. Odkrycia te zostały potwierdzone poprzez porównanie hydrolazy epoksydowej typu dzikiego z jej mutantem E470G, w którym zaobserwowano wzrost wykorzystania alternatywnych tuneli w mutancie. Co więcej, wybór jawnych modeli wody, takich jak OPC, TIP3P i TIP4P-Ew, znacząco wpływa na wykorzystanie tuneli enzymatycznych przez cząsteczki wody. Zaobserwowane różnice między trzema modelami wody można przypisać różnicom w ich właściwościach dyfuzyjnych i rozkładach ładunku. W przypadku modelu TIP3P migracja wody była zauważalnie przyspieszona, transportując około 2,5- i 2,0-krotnie więcej cząsteczek wody niż w przypadku modeli OPC i TIP4P-Ew. Zjawisko to wynika przede wszystkim z zaobserwowanych krótszych czasów przejścia i większej liczby cząsteczek wody jednocześnie migrujących przez tunele przy zastosowaniu modelu TIP3P. Spójność tych wyników dla różnych enzymów, takich jak oksydaza alditolowa i cytochrom P450 2D6, wraz z geometrią tuneli, podkreśla ich szersze znaczenie. Podkreśla to znaczenie modelu wodnego dla dokładnych symulacji enzymów z głęboko osadzonymi miejscami aktywnymi, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich cykli katalitycznych, projektowania enzymów i przewidywania czasów przebywania leków. The enzymes with buried active sites have pathways leading to them which are called tunnels. By focusing on the hydrolase family of enzymes and emphasizing the importance of water within these tunnels, this study provides valuable insights into their functional implications. Through the utilization of molecular dynamics simulations and adaptive sampling techniques, the conformational states of the systems are thoroughly investigated. Notably, the calculation of tunnels leading to the active site is conducted for all frames of the extensive simulation, leading to the identification of previously unrecognized tunnels. By tracking the movement of water molecules from the bulk to the defined region (active site) of the protein, the transport pathways employed by the enzyme during the simulation are determined. To facilitate the analysis of vast amounts of data related to tunnels and water molecules, a Python module called TransportTools is developed. The module streamlines the analysis of extensive tunnel and water molecule data. It aids in assessing water molecule utilization, transport efficiency, and functionality within protein structures. This tool has uncovered new water-transporting tunnels in enzymes like haloalkane dehalogenase, enhancing our understanding of tunnel dynamics. Additionally, it is discovered that water molecules can effectively navigate narrow regions within the tunnels through hydrogen bonding interactions. These findings are validated through a comparison between wild type epoxide hydrolase and its mutant E470G, where an increase in the utilization of alternate tunnels is observed in the mutant. Moreover, the choice of explicit water models such as OPC, TIP3P, and TIP4P-Ew significantly impacts the utilization of enzyme tunnels by water molecules. The observed differences between the three water models can be attributed to variations in their diffusion properties and charge distributions. With TIP3P model, water migration was noticeably accelerated, transporting about 2.5– and 2.0-times more water molecules than with OPC and TIP4P-Ew models, respectively. This phenomenon primarily arises from the observed quicker transit times and more water molecules concurrently migrating through tunnels when employing the TIP3P model. The consistency of these findings across various enzymes, such as alditol oxidase and cytochrome P450 2D6, along with tunnel geometries, highlights their broader relevance. This emphasizes water model importance for accurate simulations of enzymes with buried active sites which are critical for understanding their catalytic cycles, enzyme design, and predictions of drug residence times.
Różnice międzyosobnicze a pasożyty: wpływ zachowania, użytkowania przestrzeni i cech fizycznych żywiciela na liczebność ektopasożytów myszy leśnej (Apodemus flavicollis)
(2024) Zduniak, Milena; Zwolak, Rafał. Promotor
Dysertacja porusza temat różnic międzyosobniczych w dzikiej populacji myszy leśnych i ich wpływu na liczebność pasożytów zewnętrznych. Badania wykazały, że samce miały więcej kleszczy niż samice, lecz było to spowodowane różnicami w masie ciała, nie płci żywicieli. Ponadto, związek między eksploracją w otwartym polu, a wskaźnikami użytkowania przestrzeni uzyskanymi z danych z odłowów był bardziej złożony niż zakładały pierwotne przewidywania. Kuracja przeciwpasożytnicza skutecznie zmniejszyła liczebność ektopasożytów, lecz nie wpłynęła na eksplorację zwierząt w otwartym polu. Spośród wskaźników użytkowania przestrzeni tylko prawdopodobieństwo złowienia wzrosło w odpowiedzi na zastosowaną kurację sugerując działanie negatywnego sprzężenia zwrotnego. The dissertation explores the inter-individual traits of a wild population of yellow-necked mice and how they affect ectoparasite infestation. It found that male mice had more ticks than females, but this disparity was due to differences in host body mass rather than sex itself. Moreover, the relationship between exploration in the open field and trapping-derived indices of space use was more complex than initially predicted. The antiparasitic treatment effectively reduced ectoparasite abundance, but it did not affect open field exploration. Among space use indices, only trappability increased in response to the antiparasitic treatment, suggesting the existence of negative feedback.
Poszukiwanie markerów starzenia się niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis
(2024) Nagwan, Amit Kumar; Kmita, Hanna. Promotor; Kaczmarek, Łukasz. Promotor
Zakłada się, że starzenie się jest nieuniknione, nieodwracalne i postępujące, ale dostępne dane wskazują, że starzenie się niesporczaków może być opóźnione przez kryptobiozę. Możliwość tę uwzględnia hipoteza Śpiącej Królewny. Weryfikacja tej hipotezy wymaga zastosowania wielopoziomowych markerów starzenia się niesporczaków. Dlatego celem tej pracy doktorskiej było wskazanie potencjalnych markerów starzenia się niesporczaków. Aby osiągnąć ten cel, przeanalizowano dostępne publikacje pod względem możliwych markerów i opracowano odpowiedni model do ich eksperymentalnej walidacji, obejmujący samice i samce niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis w różnym wieku. Wyniki pozwoliły na wskazanie następujących markerów starzenia się niesporczaków: żywotność, średnia liczba złożonych jaj przez samicę, przeżywalność warunków ekstremalnych (tj. anhydrobioza i pole hipomagnetyczne), poziom potencjału błony wewnętrznej mitochondriów (Δψ ) i poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS). Weryfikacja przydatności wymienionych markerów może przyczynić się do wykorzystania niesporczaków także jako organizm modelowy w biologii starzenia. Wraz z weryfikacją hipotezy Śpiącej Królewny może to przyczynić się do opracowania strategii przeciwstarzeniowych i skutecznych rozwiązań dotyczących konserwacji materiałów biologicznych. Niemniej jednak uzyskane wyniki należy poddać dalszej weryfikacji w odniesieniu do innych dwupłciowych gatunków niesporczaków, co pozwoli na lepsze zrozumienie obserwowanych różnic międzypłciowych. It is assumed that aging is inevitable, irreversible, and progressive but available data indicate that tardigrade aging might be delayed by cryptobiosis. The possibility is addressed by the Sleeping Beauty hypothesis. However, the hypothesis verification requires multilevel markers of tardigrade aging. Therefore, the aim of the thesis was to indicate potential tardigrade aging markers. To implement the aim available relevant papers were searched for the putative markers and suitable tardigrade model comprising Paramacrobiotus experimentalis females and males of different age was developed for the markers validation. The results allowed for indication of the following tardigrade aging markers: the vitality rate, average number of laid eggs per female, survival of the extreme conditions (i.e., anhydrobiosis and hypomagnetic field), the level of the mitochondrial inner membrane potential (Δψ) and the level of intracellular reactive oxygen species (ROS). Verification of usability of the mentioned markers could open the opportunity for tardigrades to be also a model organism for aging biology. Together with verification of the Sleeping Beauty hypothesis, this might contribute to developing of anti-aging strategies and efficient approaches for preservation of biological materials. Nevertheless, the obtained results should be further verified for other dioecious tardigrade species which will allow for a better understanding of the observed differences between the sexes.
Symulacje procesów wiązania ligandów w białkach
(2024) Sarkar, Dheeraj Kumar; Brezovsky, Jan. Promotor
Procesy biologiczne są wewnętrznie regulowane przez małe cząsteczki i ich interakcje, szczególnie w postaci kompleksów białko-ligand. Transport ligandów w białkach odgrywa kluczową rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w transdukcji sygnału, katalizie enzymów oraz transporcie składników odżywczych i metabolitów. Dlatego zrozumienie procesów wiązania ligandu ma ogromne znaczenie dla opartego na strukturze projektowania leków i inżynierii ulepszonych katalizatorów enzymatycznych. W szczególności znaczna część enzymów ma swoje aktywne miejsce zakopane w głębokich zagłębieniach, a wyzwania polegają na udanym uchwyceniu procesów wiązania i niewiążenia ligandu, ponieważ dostęp do tych wnęk przez małe cząsteczki jest ogólnie ograniczony przez tunele białkowe i bramy. Zmiany w tunelach białkowych często mogą prowadzić do zmiany aktywności, selektywności, rozwiązłości i stabilności. Aby zaradzić tym niedociągnięciom, w moim doktoracie. w badaniach przyczyniłem się do zbadania właściwości termicznych i kinetycznych poprzez ocenę wykorzystania małych cząsteczek przez tunele transportowe w białkach z zakopanymi aktywnymi miejscami. Zastosowano metody zwiększonej dynamiki molekularnej (MD), aby skutecznie ocenić termodynamikę i kinetykę procesów wiązania ligandu, jednocześnie rozumiejąc leżące u podstaw mechanizmy molekularne. Teza składa się z trzech rękopisów. Pierwsza część pracy koncentruje się na opracowaniu metody poprzez zaprojektowanie opartych na wiedzy schematów siewu w celu skutecznego badania procesów interakcji ligandu w dehalogenazie haloalkanu. Metoda wykorzystuje adaptacyjne symulacje próbkowania do wysokoprzepustowego próbkowania zjawisk wiążących, kierowany przez modele stanu Markowa (MSM) w celu generowania znaczących modeli kinetycznych opisujących stany związane z białkami-ligandem i niezwiązane stany długowieczne oraz ich procesy konwersji. W drugiej części rozprawy masowe wykorzystanie tuneli molekularnych w celu ułatwienia transportu ligandu zostało ocenione i określone ilościowo, aby uzyskać bardziej szczegółowy wgląd w procesy transportu ligandu, pokazując zastosowanie opracowanego przez siebie narzędzia programowego. Wreszcie trzecia część pracy dotyczy dostępności aktywnego miejsca cytochromu c dla zatłoczonych hydrotropów oraz roli ich wiązania ze stabilnością termiczną tego enzymu. Proces badano w dwóch temperaturach obejmujących trzy różne kompozycje hydrotropów, stosując adaptacyjne symulacje próbkowania prowadzone przez modele Markowa. Ujawniono kilka spostrzeżeń na temat roli rozpuszczalników hydrotropowych w zapewnianiu stabilności funkcjonalnym częściom cytochromu c i regulacji dynamiki stanów otwartych i zamkniętych. Ogólnie rzecz biorąc, teza reprezentuje zastosowanie, ocenę, oraz opracowanie wysokoprzepustowego protokołu symulacje wykorzystującego kompleksy białko-ligand do badania procesów wiązania ligandu i jego roli w lepszym zrozumieniu sprzężenia między dynamiką a funkcją enzymów. Biological processes are intrinsically regulated by small molecules and their interactions, particularly in the form of protein-ligand complexes. The transport of ligands in proteins plays a crucial role in many biological processes, including signal transduction, enzyme catalysis and the transport of nutrients and metabolites. Therefore, understanding ligand binding processes is of great importance for the structure-based design of drugs and the engineering of improved enzyme catalysts. Notably, a significant fraction of enzymes have their active site buried in deep cavities, and the challenges lie in successfully capturing the ligand binding and unbinding processes, as access to those cavities by small molecules is generally restricted by protein tunnels and gates. Changes in protein tunnels can often lead to altered activity, selectivity, promiscuity, and stability. To address these shortcomings, in my Ph.D. research, I contributed to investigating thermal and kinetic properties by assessing the utilization of small molecules via transport tunnels in proteins with buried active sites. Enhanced molecular dynamics (MD) methods were applied to effectively assess the thermodynamics and kinetics of ligand binding processes while understanding the underlying molecular mechanisms. The thesis consists of three manuscripts. The first part of the thesis focuses on developing a method by designing knowledge-based seeding schemes to study ligand interaction processes in haloalkane dehalogenase effectively. The method employs adaptive sampling simulations for high-throughput sampling of binding phenomena, guided by Markov State Models (MSMs) to generate meaningful kinetic models describing protein-ligand bound and unbound long-lived states and their interconversion processes. In the second part of the thesis, the massive use of molecular tunnels to facilitate ligand transport was evaluated and quantified to gain more detailed insights into ligand transport processes, showcasing the applicability of the in-house developed software tool. Finally, the third part of the thesis deals with the accessibility of the Cytochrome c active site for crowded hydrotropes and the role of their binding on the thermal stability of this enzyme. The process was studied at two temperatures involving three different compositions of the hydrotropes using adaptive sampling simulations guided by Markov models. Several insights were revealed into the role of hydrotropic solvents in providing stability to functional parts of Cytochrome c and regulating the dynamics of the open and closed states. Overall, this thesis represents the application, evaluation, and development of a high-throughput simulations protocol using protein-ligand complexes to study ligand binding processes and its role in improving the understanding of the coupling between the dynamics and function of enzymes.
Poszukiwanie markerów starzenia się niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis
(2024) Nagwani, Amit Kumar; Kmita, Hanna. Promotor; Kaczmarek, Łukasz. Promotor
Zakłada się, że starzenie się jest nieuniknione, nieodwracalne i postępujące, ale dostępne dane wskazują, że starzenie się niesporczaków może być opóźnione przez kryptobiozę. Możliwość tę uwzględnia hipoteza Śpiącej Królewny. Weryfikacja tej hipotezy wymaga zastosowania wielopoziomowych markerów starzenia się niesporczaków. Dlatego celem tej pracy doktorskiej było wskazanie potencjalnych markerów starzenia się niesporczaków. Aby osiągnąć ten cel, przeanalizowano dostępne publikacje pod względem możliwych markerów i opracowano odpowiedni model do ich eksperymentalnej walidacji, obejmujący samice i samce niesporczaka Paramacrobiotus experimentalis w różnym wieku. Wyniki pozwoliły na wskazanie następujących markerów starzenia się niesporczaków: żywotność, średnia liczba złożonych jaj przez samicę, przeżywalność warunków ekstremalnych (tj. anhydrobioza i pole hipomagnetyczne), poziom potencjału błony wewnętrznej mitochondriów (Δψ ) i poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS). Weryfikacja przydatności wymienionych markerów może przyczynić się do wykorzystania niesporczaków także jako organizm modelowy w biologii starzenia. Wraz z weryfikacją hipotezy Śpiącej Królewny może to przyczynić się do opracowania strategii przeciwstarzeniowych i skutecznych rozwiązań dotyczących konserwacji materiałów biologicznych. Niemniej jednak uzyskane wyniki należy poddać dalszej weryfikacji w odniesieniu do innych dwupłciowych gatunków niesporczaków, co pozwoli na lepsze zrozumienie obserwowanych różnic międzypłciowych. It is assumed that aging is inevitable, irreversible, and progressive but available data indicate that tardigrade aging might be delayed by cryptobiosis. The possibility is addressed by the Sleeping Beauty hypothesis. However, the hypothesis verification requires multilevel markers of tardigrade aging. Therefore, the aim of the thesis was to indicate potential tardigrade aging markers. To implement the aim available relevant papers were searched for the putative markers and suitable tardigrade model comprising Paramacrobiotus experimentalis females and males of different age was developed for the markers validation. The results allowed for indication of the following tardigrade aging markers: the vitality rate, average number of laid eggs per female, survival of the extreme conditions (i.e., anhydrobiosis and hypomagnetic field), the level of the mitochondrial inner membrane potential (Δψ) and the level of intracellular reactive oxygen species (ROS). Verification of usability of the mentioned markers could open the opportunity for tardigrades to be also a model organism for aging biology. Together with verification of the Sleeping Beauty hypothesis, this might contribute to developing of anti-aging strategies and efficient approaches for preservation of biological materials. Nevertheless, the obtained results should be further verified for other dioecious tardigrade species which will allow for a better understanding of the observed differences between the sexes.
Rodzaj Paramacrobiotus(Tardigrada): taksonomia integratywna, biogeografia i oraz wpływ czynników stresowych na wybrane gatunki
(2023) Kayastha, Pushpalata; Kaczmarek, Łukasz. Promotor; Mioduchowska, Monika. Promotor pomocniczy
Paramacrobiotus stanowi jeden z rodzajów należących do typu Tardigrada (grupy zwierząt potocznie nazywanej niesporczakami lub misiami wodnymi). Rodzaj ten został utworzony ponad dekadę temu. Poprzednio, przedstawiciele tego rodzaju byli zaliczani do kompleksu richtersi-areolatus wewnątrz rodzaju Macrobiotus, by w końcu, przy pomocy technik analizy molekularnej i filogenetycznej zostać wyodrębnionymi jako nowy rodzaj. Jak sugeruje tytuł, celem niniejszej rozprawy były badania rodzaju Paramacrobiotus, z uwzględnieniem zastosowania taksonomii integratywnej w opisie nowych dla wiedzy gatunków, ustalenie potencjalnych zasięgów występowania gatunków partenogenetycznych oraz sprawdzenie zasadności hipotezy „wszystko jest wszędzie” względem badanych gatunków, zbadanie wpływu czynników stresowych na gatunek Pam. experimentalis, badania nad rozmieszczeniem poszczególnych gatunków, badania mikrobiomu, a także przyjrzenie się historiom życiowym poszczególnych gatunków z uwzględnieniem zdolności do anhydrobiozy. Ponadto sporządzony został nowy klucz diagnostyczny dla rodzaju Paramacrobiotus wykorzystujący cechy morfologiczne i morfometryczne osobników dorosłych i jaj. Wykorzystując techniki taksonomii integratywnej (klasyczna morfologia i morfometria oraz badania genetyczne), nowy gatunek, Pam. gadabouti, został opisany na podstawie materiału pochodzącego z Ribeiro Frio na Maderze. Ponadto, eksperymentalnie zbadano sposób rozmnażania się tego gatunku, co potwierdziło wzajemne powiązania między szerokim rozprzestrzenieniem a partenogenezą. W kolejnej pracy przeanalizowano rozmieszczenie oraz zróżnicowanie genetyczne dwóch partenogenetycznych gatunków z rodzaju Paramacrobiotus, tj. Pam. gadabouti oraz Pam. fairbanksi potwierdzając prawdziwość hipotezy „wszystko jest wszędzie” przynajmniej dla niektórych gatunków niesporczaków. Modelowanie niszy środowiskowych wykonane przy użyciu narzędzia MaxEnt, potwierdza szeroki zasięg obydwu partenogenetycznych gatunków. W kolejnej publikacji zbadano przeżywalność niesporczaków z gatunku Pam. experimentalis, wystawianych na działanie różnych stężeń (0,25%; 0,50% oraz 1,00%) nadchloranu magnezu (uwzględniając stężenia zaobserwowane w marsjańskim regolicie) w dwóch różnych przedziałach czasowych (24h i 72h). W próbach, w których osobniki zostały poddane 24-godzinnej ekspozycji, kolejno 33,3%; 16,7% oraz 0% osobników pozostało aktywnych w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00%. Jednakże, ponad 75% z nich powróciło do stanu aktywnego po przeniesieniu ich do medium hodowlanego (93,3%; 76,7% oraz 86,7% osobników w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00%). W próbach, w których osobniki zostały poddane 72-godzinnej ekspozycji, kolejno 30,0%; 26,7% oraz 0% osobników pozostało aktywnych w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00%. Po przeniesieniu ich do medium hodowlanego kolejno 83,3%; 86,7% oraz 10,0% osobników w stężeniach 0,25%; 0,50% oraz 1,00% powróciło do stanu aktywnego. W następnej pracy zbadano zmiany w ultrastrukturze komórek spichrzowych zarówno u aktywnych osobników, jak i u osobników w anhydrobiozie. Zbadano też poziom syntezy białek szoku cieplnego (Hsp27, Hsp60 oraz Hsp70) u aktywnych osobników Pam. experimentalis wystawionych na podwyższoną temperaturę (35 °C, 37 °C, 40 °C i 42 °C) przez pięć godzin, w porównaniu do optymalnej temperatury hodowlanej (20 °C). Pojedyncze komórki spichrzowe z grupy kontrolnej, znajdowały się w jamie ciała, pośród narządów wewnętrznych, przyjmując kuliste i ameboidalne kształty. Niewielkie, choć zauważalne zmiany w mitochondriach zostały zaobserwowane u osobników aktywnych wystawionych na temperaturę 35 °C. Znaczące zmiany w ultrastrukturze komórek spichrzowych zaobserwowane zostały u osobników poddanych temperaturze 37 °C. Zaobserwowano u nich liczne, uszkodzone mitochondria z zauważalnym zanikiem grzebieni oraz pojawieniem się struktur autofagicznych. Jeszcze więcej zmian zaobserwowano w temperaturze 40 °C, objawiających się nieregularnym kształtem komórek spichrzowych, uszkodzeniami organelli komórkowych oraz zwiększoną obecnością ciał autofagicznych i autolizosomów w mitochondriach. Jednakże najbardziej drastyczne zmiany zaobserwowano w 42 °C, gdzie nastąpiła pełna degradacja komórek i organelli, wskazująca na wystąpienie martwicy, do poziomu utrudniającego rozpoznanie komórek. Jednocześnie, osobniki w anhydrobiozie, poddane działaniu podwyższonej temperatury, nie wykazywały jakichkolwiek negatywnych zmian w komórkach spichrzowych na poziomie ultrastrukturalnym. Spośród pięciu zastosowanych w badaniu temperatur, trzy uznane za najważniejsze zostały wybrane (20 °C – optymalna temperatura do hodowli, 35 °C – najwyższa temperatura, po której nastąpił powrót osobników do aktywności oraz 42 °C – gdzie zaobserwowana została pełna martwica) i wykorzystane do określenia poziomów białek szoku cieplnego (Hsp27, Hsp60 oraz Hsp70) w aktywnych osobnikach. Wszystkie próbki wskazywały na wyraźny wzrost poziomu ekspresji białek wraz ze wzrostem temperatury. W ostatniej pracy składającej się na rozprawę doktorską zebrano całkowitą dostępną wiedzę na temat rodzaju Paramacrobiotus. Podsumowując więc, do rodzaju Paramacrobiotus należy obecnie 45 gatunków (wliczając w to Pam. gadabouti dodany w ramach niniejszej pracy), które można znaleźć na całym świecie, popierając tezę, że rodzaj ten jest kosmopolityczny. W rodzaju występują zarówno partenogenetyczne, jak i obupłciowe gatunki, wykazujące zarówno krótką jak i długą długość życia. Gatunki w tym rodzaju mogą być wszystkożerne (jednak z przewagą drapieżników), a odżywiają się między innymi, cyjanobakteriami, algami, grzybami, wrotkami, nicieniami oraz niesporczakami. Gatunki z tego rodzaju charakteryzują się dość dobrą zdolnością do kryptobiozy, dzięki czemu często stanowią obiekt badań w pracach nad anhydrobiozą. Paramacrobiotus is one of the genera of the phylum Tardigrada (commonly referred as water bears). This genus was erected more than a decade ago. Previously all representatives of this genus were included in the richtersi-areolatus complex within the genus Macrobiotus, but with the help of molecular and phylogenetic analysis, this new genus was identified and established. As the title of thesis suggests, the goal of this dissertation was the overall study of the genus Paramacrobiotus, including: incorporating integrative taxonomy in new species descriptions, working out the distribution patterns of parthenogenetic Pramacrobiotus species, testing if the ‘everything is everywhere’ hypothesis is true for them, testing the influence of different types of stressors on the species Pam. experimentalis, assessing biogeography, distribution, microbiome, reproduction, feeding behaviour, life history, Wolbachia endosymbiont identification and cryptobiotic abilities of the species from the genus Pramacrobiotus and providing a new diagnostic key for the genus using morphological and morphometric characters of adults and eggs. Using an integrative taxonomy approach (classical morphology and morphometry, as well as, genotypic using DNA barcodes and phylogenetic tree), a new species: Pam. gadabouti was described from a moss sample collected in Ribeiro Frio, Madeira. Furthermore, the mode of reproduction of this species was studied experimentally, which corroborates the interrelatedness between wide distribution and parthenogenesis. In the subsequent paper constituting the doctoral dissertation, two parthenogenetic species of the Paramacrobiotus, i.e., Pam. gadabouti and Pam. fairbanksi were analysed to study the distribution, as well as genetic variability which showed that the ‘everything is everywhere’ hypothesis is true for, at least, some tardigrade species. Environmental niche modelling performed using MaxEnt supports the wide distribution of these two parthenogenetic species. In the next publication, survivability of the Pam. experimentalis was tested at various concentrations (0.25%, 0.50% and 1.00%) of magnesium perchlorates (in range with the concentration present in Martian regolith) for two different time points (24h and 72h). In experiments where specimens were exposed to 24h time period, 33.3%, 16.7% and 0% were active in 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively. However, more than 75% returned to activity after transferring them to the culture medium (93.3%, 76.7% and 86.7% of specimens exposed to 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively). In experiments where specimens were exposed to 72h time period, 30.0%, 26.7% and 0% were active in 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively and after transferring them to the culture medium, 83.3%, 86.7% and 10.0% of specimens exposed to 0.25%, 0.50% and 1.00% solutions, respectively, returned to activity. In the following paper constituting the doctoral dissertation, changes in ultrastructure for both active animals and desiccated tuns, as well as levels of heat shock proteins (Hsp27, Hsp60 and Hsp70) in active animals of Pam. experimentalis were studied when exposed at higher temperatures (35 °C, 37 °C, 40 °C, and 42 °C) for 5 hours, compared to optimal temperature (20 °C). Isolated storage cells from the control group persisted in the body cavity among internal organs in an amoeboid or spherical shape. Small, but visible changes were observed in specimens exposed to 35°C in the form of alterations in the mitochondria. Significant ultrastructural changes were observed in storage cells of specimens exposed to 37 °C. There were multiple deteriorating mitochondria with the loss of its cristae and there was a presence of autophagic structures. The level of changes increased at 40°C, with the irregular and shrunken shape of storage cells, deteriorated cell organelles and mitochondria with a higher number of autophagosomes and autolysosomes. Most drastic changes were observed at 42 °C, with full degeneration of cells and organelles showing signs of necrosis, making even cell identification difficult. However, when exposed to higher temperatures, tuns exhibited absolutely no differences from the control group. Out of five temperatures tested, the three deemed most important were selected (20 °C – optimum temperature, 35 °C – the highest temperature from which the return to activity was observed and 42 °C – where full necrosis was observed) and used for quantification of heat shock proteins (Hsp27, Hsp60 and Hsp70) in active specimens. All of them showed significant upregulation with the increase of the temperature. In the last paper, all available information on the genus Paramacrobiotus were summarized. Thus, in summary, the genus Paramacrobiotus currently includes 45 species (including Pam. gadabouti added as a part of the present thesis). The species of this genus can be found everywhere throughout the globe, supporting the statement that the genus is cosmopolitan. Both dioecious and unisexual species are present in the genus, with both long and short lifespan. The species in this genus are generally carnivorous with their food preference, including certain rotifers, nematodes and juvenile tardigrades. However, it was reported that they could also feed on cyanobacteria, algae, and fungi. The species generally have a good affinity for cryptobiosis, which is why multiple studies involving anhydrobiosis have been performed to date using specimens of various species of the Paramacrobiotus.

Browse

Recent Submissions