Udział ludzkich paralogów białka VDAC w przeciwdziałaniu skutkom stresu oksydacyjnego wywołanego brakiem dysmutaz wewnątrzkomórkowych

Abstract

W mitochondriach zachodzi proces oddychania komórkowego, którego substraty i metabolity są transportowane przez kanał VDAC zlokalizowany w zewnętrznej błonie mitochondrialnej. To białko kanałowe transportuje również drobne cząsteczki i jony nieorganiczne oraz oddziałuje z wieloma białkami mitochondrialnymi i komórkowymi, dzięki czemu pośredniczy w regulacji funkcjonowania mitochondriów i całej komórki. VDAC może występować w postaci paralogów, np. u drożdży występują 2 paralogi (yVDAC1 i yVDAC2), a u człowieka występują 3 (hVDAC1, hVDAC2 i hVDAC3), podobnie jak u innych ssaków i kręgowców. Podczas procesu oddychania komórkowego, oprócz cząsteczek „niosących” energię, powstają także reaktywne formy tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species), których nadmiar w komórce zwiększa ryzyko uszkodzeń i mutacji. Naturalnie nadmiar ROS usuwają enzymy antyoksydacyjne, wśród których kluczową role pełni dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), występująca w komórkach w postaci dwóch form. SOD1 (CuZnSOD) występuje w różnych strukturach komórkowych, także w mitochondrialnej przestrzeni międzybłonowej, natomiast SOD2 (MnSOD) zlokalizowana jest w macierzy mitochondrialnej. Zwiększony poziom ROS stanowi wskaźnik stresu oksydacyjnego, któremu z kolei komórka może przeciwdziałać uruchamiając odpowiednie mechanizmy obronne. Dostępne dane wskazują, że w odpowiedzi komórek człowieka na stres oksydacyjny istotną rolę może odgrywać hVDAC3, któremu przypisuje się funkcję czujnika stanu redukcyjno-oksydacyjnego (stan redoks; ang. redox sensitive VDAC; rsVDAC), co z kolei wynikać może z liczby oraz swoistej lokalizacji reszt cysteiny w sekwencji tego białka. W związku z tym, celem niniejszej pracy było określenie częstości występowania rsVDAC poza grupą kręgowców oraz skonstruowanie modelu drożdżowego pozwalającego na analizę funkcjonalności poszczególnych paralogów VDAC człowieka w warunkach stresu oksydacyjnego. W realizacji tego celu wykorzystano narzędzia do przewidywania struktur drugorzędowych badanych białek, a następnie rozmieszczenia reszt cysteiny, w celu określenia częstości występowania rsVDAC w zależności od liczby paralogów VDAC oraz poziomu złożoności organizmów, ich środowiska życia i ich trybu życia oraz technikę CRISPR/Cas9 dla otrzymania modelu opartego na komórkach drożdży Saccharomyces cerevisiae, w których dokonano heterologicznej ekspresji genów kodujących hVDAC1, hVDAC2 i hVDAC3 (hVDAC3 także w wariancie pozbawionym reszt cysteiny - hVDAC3ΔCys) w warunkach nieobecności genów kodujących yVDAC1 i yVDAC2 oraz usunięto geny kodujące SOD1 i SOD2. Uzyskane wyniki wskazują, że: (1) rsVDAC może być jedynym wariantem VDAC w mitochondriach, a jego obecność może korelować z warunkami siedliskowymi, ponieważ rsVDAC wydaje się być powszechny u pasożytów, co z kolei sugeruje, że kanał ten może pośredniczyć w wykrywaniu i adaptacji do warunków środowiskowych; (2) genotyp komórek drożdży S. cerevisiae może mieć istotne znaczenie dla ich wykorzystania w badaniach hVDAC, w tym szczególnie hVDAC3, ze względu na jego wpływ na wewnątrzkomórkowy stan redoks i (3) hVDAC3 może chronić komórkę w warunkach stresu oksydacyjnego w sposób nie wymagający obecności dysmutaz ponadtlenkowych i sprowadzający się do uruchomienia swoistego stanu bioenergetycznego mitochondriów związanego z intensywną syntezą ATP, co z kolei wymaga obecności w tym białku reszt cysteiny. Wyniki te poszerzają wiedzę na temat rozpowszechnienia występowania rsVDAC w mitochondriach zwierząt oraz swoistej roli hVDAC3 w warunkach stresu oksydacyjnego.

The process of cellular respiration takes place in the mitochondria, whose substrates and metabolites are transported through the VDAC channel located in the outer mitochondrial membrane. This channel protein also transports small molecules and inorganic ions and interacts with many mitochondrial and cellular proteins, thus mediating the regulation of mitochondrial and whole cell function. VDAC can exist in the form of paralogs, e.g. in yeast there are 2 paralogs (yVDAC1 and yVDAC2), and in humans there are 3 (hVDAC1, hVDAC2 and hVDAC3), as in other mammals and vertebrates. During the process of cellular respiration, in addition to molecules "carrying" energy, reactive oxygen species (ROS) are also produced, the excess of which in the cell increases the risk of damage and mutations. Naturally, the excess of ROS is removed by antioxidant enzymes, among which the key role is played by superoxide dismutase (SOD), which occurs in cells in the form of two forms. SOD1 (CuZnSOD) is found in various cellular structures, including the mitochondrial intermembrane space, while SOD2 (MnSOD) is localized in the mitochondrial matrix. Increased ROS levels are an indicator of oxidative stress, which in turn can be counteracted by the cell by activating appropriate defense mechanisms. Available data indicate that hVDAC3 may play an important role in the response of human cells to oxidative stress, which is attributed to the function of a sensor of the reduction-oxidation state (redox state; redox sensitive VDAC; rsVDAC), which in turn may be due to the number and specific location of cysteine residues in the sequence of this protein. Therefore, the aim of this study was to determine the frequency of rsVDAC occurrence outside the vertebrate group and to construct a yeast model to analyze the functionality of individual human VDAC paralogs under oxidative stress conditions. In pursuit of this goal, tools were used to predict the secondary structures of the studied proteins, followed by the distribution of cysteine residues, in order to determine the frequency of rsVDACs depending on the number of VDAC paralogs and the level of complexity of the organisms, their living environment and their lifestyle, and the CRISPR/Cas9 technique to obtain a model based on Saccharomyces cerevisiae yeast cells, in which the genes encoding hVDAC1, hVDAC2 and hVDAC3 (hVDAC3 also in a variant devoid of cysteine residues - hVDAC3ΔCys) were heterologously expressed in the absence of the genes encoding yVDAC1 and yVDAC2 and the genes encoding SOD1 and SOD2 were deleted. The obtained results indicate that: (1) rsVDAC may be the only VDAC variant in mitochondria and its presence may correlate with habitat conditions, as rsVDAC seems to be common in parasites, which in turn suggests that this channel may mediate sensing and adaptation to environmental conditions; (2) the genotype of S. cerevisiae yeast cells may be important for their use in hVDAC studies, including hVDAC3 in particular, due to its effect on the intracellular redox state and (3) hVDAC3 may protect the cell under oxidative stress conditions in a way that does not require the presence of superoxide dismutases and comes down to the activation of a specific bioenergetic state of mitochondria associated with intensive ATP synthesis, which in turn requires the presence of cysteine residues in this protein. These results expand the knowledge on the prevalence of rsVDAC in animal mitochondria and the specific role of hVDAC3 under oxidative stress conditions.