Rola genu AMOTL2 w pluripotencji i różnicowaniu ludzkich komórek macierzystych
Loading...
Date
2024
Authors
Advisor
Editor
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Title alternative
AMOTL2 role in pluripotency and human stem cell differentiation
Abstract
W ostatnich latach prowadzone były szerokie badania nad regulacją transkrypcji w procesach rozwojowych, jednakże nadal istnieje znaczna luka w wiedzy o mechanistycznych i metabolicznych sygnałach, oraz zdarzeniach morfologicznych towarzyszących różnicowaniu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (ang. human pluripotent stem cells, hPSCs). W poszukiwaniu takich sygnałów po raz pierwszy zidentyfikowałem gen Amotl2 w danych z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (ang. single cel RNA-sequencing, scRNA-seq) z rozwijającej się mysiej trzustki z dni embrionalnych 14.5 (e14.5) i 16.5 (e16.5). Co ciekawe, pomimo zachowanych kanonicznych markerów, populacje progenitorów endokrynnych (ang. endocrine progenitors, EP) z tych punktów czasowych różniły się znacząco pod względem transkryptomu, przy czym EP z dnia 16.5 preferencyjnie tworzyły komórki β trzustki, a e14.5 EP preferencyjnie tworzyły komórki α. Amotl2 ulegał specyficznej ekspresji w podtypie e16.5 EP, który odzwierciedlał wychodzenie EP ze struktury sznurów nabłonkowych, słabo poznane zdarzenie, które z kolei może wpływać na los komórek endokrynnych. AMOTL2 należy do rodziny angiomotyn. Jest to białko cytoplazmatyczne, które znajduje się w cytozolu lub na połączeniach komórkowych, ułatwiając przekazywanie sygnału, organizację cytoszkieletu, i modulację szlaków sygnalizacyjnych. AMOTL2 jest znanym regulatorem szlaku Hippo i jego efektora – białka YAP. Jednym z celów niniejszej pracy była identyfikacja wzorców ekspresji genu AMOTL2 w rozwoju ludzkiej trzustki in vivo i różnicowaniu trzustki in vitro przy użyciu publicznie dostępnych zbiorów danych scRNA-seq. AMOTL2 ulegał ekspresji na różnych etapach różnicowania trzustki, w tym w endodermie właściwej, komórkach prekursorowych trzustki i EP in vitro, ale także w EP, mezenchymie i komórkach pęcherzykowych in vivo. Ekspresja genu AMOTL2 nie utrzymywała się w dojrzałych komórkach endokrynnych. Co ważne, tutaj po raz pierwszy wykazano istnienie populacji NGN3(+) / AMOTL2(+) PE u człowieka, zarówno in vitro, jak i in vivo, którą wcześniej zidentyfikowano jedynie u myszy. Ekspresję AMOTL2 zidentyfikowano także w zarodku przedimplantacyjnym i hPSCs, co sugeruje, że może on wpływać również na wcześniejsze decyzje dotyczące losu komórki. W niniejszej pracy wyprowadziłam linię hPSC z wyłączoną ekspresją genu AMOTL2 (ang. knockout, KO) przy użyciu metody CRISPR/Cas9. Podczas wstępnej charakterystyki wyłonił się silny fenotyp dotyczący morfologii kolonii, przy czym kolonie AMOTL2 KO hPSC były bardziej nieregularne i mniej ciasno upakowane niż u typu dzikiego (ang. wild type, WT). Dodatkowo hPSC AMOTL2 KO wykazywały zwiększoną konfluencję w porównaniu z hPSC WT, co było wynikiem ich zwiększonej proliferacji i zmniejszonych szybkości apoptozy. Sekwencjonowanie RNA ujawniło istotne zmiany w zakresie cytoszkieletu, adhezji oraz migracji, rozwoju, metabolizmu komórkowego i szlaków sygnałowych. Wykazano również potencjalne tendencje rozwojowe komórek AMOTL2 KO w kierunku ektodermy kosztem endodermy i mezodermy, co zostało potwierdzone spontanicznym i ukierunkowanym różnicowaniem. W poszukiwaniu mechanizmu odpowiedzialnego za takie tendencje w różnicowaniu jako możliwych winowajców zidentyfikowano depolimeryzację F-aktyny i zwiększoną aktywność YAP. Co zaskakujące, spontaniczne różnicowanie z dodatkiem substancji depolimeryzującej F-aktynę, Y-27632 lub inhibitora YAP, werteporfiny, nie powtórzyło ani nie uratowało fenotypu rozwojowego AMOTL2 KO. Oznacza to, że w grze biorą udział inni, silniejsi gracze, za pomocą których AMOTL2 kontroluje los komórek, a którzy w oparciu o sekwencjonowanie RNA i wstępne dane funkcjonalne mogą obejmować mechanizm wytwarzania energii lub metabolizm komórkowy.
The transcriptional regulation of developmental processes was extensively studied over the last years, yet there is still a considerable gap of knowledge concerning the mechanistic and metabolic cues, and underlying morphological events that accompany human pluripotent stem cell (hPSC) differentiation. In search of such signals, I first identified the Amotl2 gene in the single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) data of the developing murine pancreata from embryonic days 14.5 (e14.5) and 16.5 (e16.5). Interestingly, despite conserved canonical markers, the endocrine progenitor (EP) populations from these timepoints differed significantly in their transcriptomes, with e16.5 EPs being more prone to form pancreatic β-cells, and e14.5 EPs preferentially forming α-cells. Amotl2 was specifically expressed in the subtype of e16.5 EPs, which reflected EPs delamination from epithelial cords, a poorly understood event that might influence endocrine cell fate. AMOTL2 is a member of the angiomotin family. It is a cytoplasmic protein that resides either in cytosol or at the cellular junctions, facilitating signal transduction, cytoskeleton organization, and modulation of signaling pathways. AMOTL2 in a known regulator of Hippo pathway and its downstream effector YAP. One of the aims of this thesis was identification of AMOTL2 expression patterns in developing human pancreas in vivo and pancreatic differentiation in vitro using publicly available scRNA-seq datasets. AMOTL2 was expressed at the different stages of pancreatic differentiation, including definitive endoderm, pancreatic progenitors, and EPs, in vitro, and in EPs, mesenchyme, and acinar cells in vivo. AMOTL2 expression did not persist into mature endocrine cell. Importantly, here, for the first time, is shown the existence of the NGN3(+) / AMOTL2(+) EP population in human, in both in vitro and in vivo, which was previously identified only in mice. AMOTL2 expression was also identified in the preimplantation embryo and hPSCs, suggesting that it might influence also earlier cell fate decisions. In this thesis, I developed an AMOTL2 knockout (KO) hPSC line using CRISPR/Cas9 approach. During initial characterization, a strong phenotype concerning colony morphology emerged, with AMOTL2 KO hPSC colonies being more irregular and less tightly packed than in wild type (WT). Additionally, AMOTL2 KO hPSCs showed increased confluency compared to WT hPSCs, which was a result of increased proliferation and decreased apoptosis rates. RNA-sequencing revealed substantial changes in terms connected with cytoskeleton, adhesion, and migration, development, cell metabolism, and signaling pathways. It also shown a potential developmental bias of AMOTL2 KO cells towards ectoderm, at the expense of endoderm and mesoderm, which was confirmed with spontaneous and directed differentiation. In search of the mechanism behind the differentiation bias, the F-actin depolymerization and increased YAP activity were identified as possible culprits. Surprisingly, spontaneous differentiation with F-actin depolymerizing agent, Y-27632, or YAP inhibitor, verteporfin, failed to repeat or rescue AMOTL2 KO developmental phenotype. This indicates that there are other, more potent players in the game, by which AMOTL2 controls cell fate, which, based on RNA-sequencing and preliminary functional data, might include energy production mechanism or cellular metabolism.
Description
Wydział Biologii
Sponsor
The research work included in the dissertation was supported by the following funding:
- Faculty of Biology Dean’s Grant (GDWB-03/2020) to Anna Jędrzejak,
- MINIGRANT MG/POWER17/2021/12 to Anna Jędrzejak, within the project Passport to the future - Interdisciplinary doctoral studies at the Faculty of Biology AMU, POWR.03.02.00-00-I006/17,
- National Science Centre (NCN) Preludium grant 2021/41/NZ4/02626 to Anna Jędrzejak,
- Foundation for Polish Science (FNP) grant POIR.04.04.00-00-20C5/16-00 (TEAM.2016-2/10) to Małgorzata Borowiak,
- Polish National Science Centre (NCN) grant 2019/33/B/NZ3/01226 to Małgorzata Borowiak.
Keywords
AMOTL2, ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste, pluripotencja, różnicowanie, rozwój trzustki, human pluripotent stem cells, pluripotency, differentiation, pancreatic development