Opracowanie i zastosowanie mikroczujników fluorescencyjnych do nowej, bezznacznikowej metody detekcji wykorzystujacej zjawisko optycznego rezonansu Whispering Gallery Mode (WGM)

Abstract

Fluorescencyjne, idealnie kuliste mikrocząstki w których na skutek totalnego wewnętrznego odbicia fali świetlnej dochodzi do powstania specyficznych modów rezonansowych zwanych z ang. Whispering Gallery Modes (WGMs), mogą być stosowane jako następna generacja bezznacznikowych bioczujników label-free. Integracja czujników WGM z odpowiednim układem komórek mikroprzepływowych i wysokorozdzielczych komponentów optycznych pozwoliła na wielowymiarową detekcję w czasie rzeczywistym różnorodnych biomolekuł. Celem niniejszej pracy doktorskiej była synteza i charakterystyka fluorescencyjnych rezonatorów WGM o niskiej wartości współczynnika Q oraz ich wykorzystanie w detekcji label-free. Przebadano sześć kluczowych parametrów syntezy mikrocząstek WGM i ich wpływ na jakość sygnału i wydajność detekcji: rodzaj materiału rezonatora, typ polimeryzacji, rozmiar rezonatora, rodzaj i rozkład barwnika fluorescencyjnego oraz technika funkcjonalizacji powierzchnii. Praca zostala podzielona na sześć rozdziałów. W pierwszym rozdziale zatytułowanym General Introduction, przedstawiono ogólne wprowadzenie do optycznych metod detekcji label-free z szczególnym uwzglednieniem metody WGM i jej glównych zalet. Rozdzial drugi, Literature review, przedstawia konkurencyjne, optyczne metody detekcji label-free oraz ich wady i zalety w odniesieniu do metody WGM. W dalszej części zaprezentowane zostały teoretyczne podstawy dotyczace rezonansu WGM, krótki zarys historyczny oraz porównanie sensorow WGM o wysokiej i niskiej wartości współczynnika jakości Q. W ostatniej części rozdziału drugiego opisano metodę warstwowych pokryć polielektrolitami Layer-by-Layer (LbL) będącej glówna techniką wykorzystywaną do funkcjonalizacji powierzchnii sensorów WGM. W rozdziale trzecim zatytułowanym Materials and Methods, przedstawiono materiały użyte w badaniach jak rownież opisano sposób syntezy polielektrolitów znakowanych barwnikami fluorescyncyjnymi oraz biotyną. W dalszej części szczegółowo opisano sposób funkcjonalizacji sensorów WGM wykorzystując metodę LbL. W podrozdziale Methods przedstawiono krótki opis technik analitycznych wykorzystanych do badań. W rozdziale czwartym, Results and Discussion, przedstawiono wyniki przeprowadzonych badań wraz z dyskusją. W pierwszym podrozdziale opisany został wpływ poszczególnych parametrów nowo-zsyntetyzowanych sensorów o niskim Q na jakość i czulość sygnału WGM. W szczególności zwrócono uwagę na oddziaływanie współczynnika załamania światła, chropowatość powierzchnii oraz średnicę rezonatora na formowanie się modów WGM. W podrozdziale drugim przedstawiono praktyczne użycie sensorów WGM o niskim Q w analizie adsorpcji polielektrolitów nakładanych metodą LbL, analizie niespecyficznego wiązania białka lizozymu, detekcji specyficznych oddziaływań biomolekuł na przykładzie systemu streptawidyna-biotyna jak rownież wykrywaniu zanieszczeń wody wywołanych rozpuszczalnikami organicznymi. Na zakończenie każdego podrozdziału przedstawiono podsumowywującą dyskusję. Rozdzial piąty, Conclusions, podsumowuje wyniki przeprowadzonych badań. W rozdziale szóstym, References, zawarto spis literaturowy. Na końcu pracy zamieszczony został mój krótki życiorys, lista publikacji oraz konferecji i sesji posterowych, w których brałem udział.

Fluorescent spherical microcavities that confine the emission light in low-Q Whispering Gallery Modes (WGMs) resonance can be used as the next-generation of miniaturized label-free biosensors. Integration of WGM sensors with a suitable microfluidic cell array and highresolved optical components allowed to multiplexed detection of different biomolecules in real-time. The aim of this work was to develop and characterize fluorescent low-Q WGM resonators which were exploited in label-free bioanalysis. Six key aspects in the fabrication of low-Q WGM microparticles and their impact on the signal quality and sensing performance were studied: the resonator material type, the polymerization method, the resonator size, the fluorescent dye, the dye distribution and the surface functionalization. The investigation of different particle materials showed that the best spectra characterized by high intensity and narrow peaks bandwidth can be obtained for PS particles. The most crucial parameters of WGM microsensors determining the quality of resonance are found to be the refractive index and the surface roughness. The best-suited polymerization method to fabrication of polystyrene low-Q WGM sensors was seeded-growth polymerization because of high WGM performances, monodispersity, and easy control of particle size. Setting the acceptable upper limit of peak bandwidth to 0.1 nm, the minimal diameter of PS particles should be above 8.5 µm. Nevertheless, if the particles are bigger than 11.5 µm many additional weak peaks in the WGM spectra can be observed. A new type of WGM particle sensors were developed by assembling the fluorescent dye molecules outside of the particle on its surface. Nanometer thin layers of coumarin covalently linked to polyelectrolytes were assembled by the LbL technique on non-fluorescent PS particles yielding highly qualitative WGM sensors with narrow bandwidth, low background signal, and easy post-modification possibility. However, continuous measurement lead to a faster photobleaching of the dyes than for dyes immobilized inside the PS particles. The studies of sensing performance showed that the low-Q WGM system can be compared with other well-established label-free detection methodssuch as SPR or QCM and successfully used for the analysis of the binding and release kinetics of many molecules such as polymers, proteins or antibodies. 10 The obtained results suggest that fluorescent low-Q WGM particles have a great potential for their future application as small scale sensors for label-free, low-cost and multiplexed detection of (bio)molecules.