Identyfikacja mikroRNA specyficznych dla podkładek u jabłoni

Abstract

Cząsteczki mikroRNA (miRNA) odgrywają niezwykle istotną rolę w regulacji ekspresji genów u roślin i zwierząt poprzez wyciszanie ekspresji transkryptów docelowych. Dla jabłoni (Malus domestica) jest obecnie znanych i dostępnych w bazie „miRBase” 206 cząsteczek miRNA. Identyfikacja nowych cząsteczek, jak również poznawanie funkcji już istniejących może przyczynić się do ich praktycznego wykorzystania w celu lepszej ochrony roślin przed patogenami. Celem niniejszej pracy było zidentyfikowanie cząsteczek miRNA jabłoni odmiany „Gala” i określenie ich zróżnicowanej ekspresji w zależności od podkładki. Zwrócono szczególną uwagę na miRNA zaangażowane w kształtowanie odporności na zarazę ogniową, chorobę wywoływaną przez bakterię Erwinia amylovora. W badaniach opierano się głównie na metodach głębokiego sekwencjonowania i analizach bioinformatycznych, których wyniki potwierdzano przy użyciu metod eksperymentalnych. Materiałem badawczym były drzewa odmiany „Gala” rosnące na podkładkach o różnej odporności na zarazę ogniową (M.27, B.9, M.111 i G.30). W pierwszym etapie pracy, poprzez porównanie ekspresji miRNA zidentyfikowanych w zdrowych drzewach, skoncentrowano się na wytypowaniu cząsteczek charakterystycznych dla poszczególnych podkładek. Następnie zidentyfikowano transkrypty docelowe dla miRNA oraz przeanalizowano potencjalny związek pomiędzy profilem ekspresji miRNA a odpornością jabłoni na zarazę ogniową. Spośród dwustu pięćdziesięciu dwóch zidentyfikowanych w tej części pracy cząsteczek, biorąc pod uwagę wszystkie późniejsze wyniki, wytypowano cztery cząsteczki potencjalnie zaangażowane w kształtowanie oporności na zarazę ogniową: mdm-miR535b,c, mdm-miR169a, mdm-miR167b-g oraz mdm-miR168a,b. Celem drugiego etapu pracy było zidentyfikowanie miRNA zaangażowanych w odpowiedź jabłoni na zakażenie bakteryjne poprzez porównanie poziomów ekspresji miRNA pochodzących z drzew zakażonych i niezakażonych bakteriami E amylovora. W tej części pracy wytypowano trzy cząsteczki wykazujące zróżnicowaną ekspresję w odpowiedzi na zakażenie bakteryjne: mdm-miR168a,b, mdm-miR194C i mdm-miR1392C. Dodatkowo, analiza transkryptów docelowych wymienionych cząsteczek potwierdziła ich potencjalną rolę w odpowiedzi na stres biotyczny. Przeprowadzone badania znacznie poszerzyły katalog znanych dla jabłoni cząsteczek miRNA oraz pozwoliły wysnuć hipotezę o udziale cząsteczki mdm-miR535b,c i noduliny w reakcjach obronnych jabłoni na zakażenie zarazą ogniową. Ponadto przyczyniły się do lepszego poznania funkcji innych cząsteczek miRNA, zwłaszcza w odniesieniu do choroby jaką jest zaraza ogniowa. Micro RNAs (miRNAs) play crucial role in gene expression regulation in plants and animals through the silencing mechanism of target genes. Currently, there are 206 miRNA records for apple tree (Malus domestica) available in the miRBase database. The identification of novel miRNAs, as well as discovery of functions of already known molecules may help in developing practical applications of miRNAs in order to protect plants against pathogenes. The main goal of this research was to identify miRNAs from “Gala” apple and to characterize rootstock-specific miRNA expression. Particularly, miRNAs involved in fire blight resistance, disease caused by Erwinia amylovora, were analyzed and described. The project methodology was based on Next Generation Sequencing and bioinformatics analyses followed by the experimental validation. The plant material was “Gala” apple scions grafted on four rootstocks with various fire blight resistance (M.27, B.9, M.111 and G.30). In the first part of the project, through the comparison of miRNA expression profiles in non-inoculated scions, rootstock-dependent miRNAs were indicated. Then, miRNA targets were identified and the relation between miRNA expression and fire blight resistance was analyzed. Out of 252 newly identified miRNAs, taking into consideration also following results, four miRNAs were indicated as potentially involved in fire blight resistance of apple: mdm-miR535b,c, mdm-miR169a, mdm-miR167b-g and mdm-miR168a,b. The goal of the second part of the project was the identification of miRNAs involved in apple response to bacterial infection through the comparison of miRNA expression levels from E. amylovora infected and non-infected trees. Three miRNAs showing differential expression in response to bacterial infection were selected: mdm-miR168a,b, mdm-miR194C i mdm-miR1392C. Additional analysis of their targets confirmed their role in response to biotic stress. Performed analyses significantly extended apple miRNA repertoire and allowed to create the hypothesis that mdm-miR535b,c and nodulins are involved in apple defense mechanisms in response to fire blight infection. Additionally, the results shed light on other miRNA functions, especially in relation to fire blight disease.