Recent Submissions
Item type:Item, Access status: Open Access , Modulacja endogennej ekspresji MBNL1 poprzez aktywację RNA (RNAa) jako nowe podejście terapeutyczne w dystrofii miotonicznej typu 1 (DM1)(2025) Musiała-Kierklo, Nikola; Stępniak-Konieczna, Ewa. PromotorDystrofia miotoniczna (DM) to autosomalnie dominujące zaburzenie nerwowo-mięśniowe i najczęstsza postać dystrofii mięśniowej u dorosłych. Dystrofia miotoniczna typu 1 (DM1) jest spowodowana ekspansją trójnukleotydowego powtórzenia CTG w nieulegającym translacji regionie 3' (3'UTR) genu kinazy białkowej dystrofii miotonicznej (DMPK) i obejmuje zróżnicowane spektrum objawów, w tym najbardziej charakterystyczną miotonię, kardiomiopatię, insulinooporność, a także osłabienie i zanik mięśni. Zmutowane transkrypty DMPK zawierające nadmiernie wydłużone ciągi powtórzenia CUG (CUGexp) tworzą w jądrach komórkowych struktury przypominające spinki do włosów, gdzie sekwestrują różne białka wiążące RNA, w tym tez rodziny białek typu muscleblind-like (MBNL), gromadząc się jako ziarnistości jądrowe (foci). Białka MBNL kontrolują metabolizm RNA w komórce poprzez regulację alternatywnego splicingu, alternatywnej poliadenylacji, a także biogenezy, stabilności i lokalizacji mRNA. Spośród trzech paralogów MNBL, MBNL1 jest głównie eksprymowanym w większości tkanek i odgrywa kluczową rolę w regulacji alternatywnego splicingu (z wyjątkiem mózgu, gdzie dominuje MBNL2). Co ważne, transkrypcja MBNL1 kontrolowana jest przez trzy promotory (P1, 2 i 3) oraz trzy miejsca startu transkrypcji (TSS1, 2 i 3), spośród których P2 jest najbardziej aktywnym promotorem w większości tkanek. Co więcej, tylko transkrypty pochodzące z P2/TSS2 podlegają zależnej od białek MBNL regulacji alternatywnego splicingu pierwszego eksonu kodującego (e1), podczas gdy mRNA pochodzące z P1/TSS1 i P3/TSS3 zawsze wykazują odpowiednio pominięty lub włączony e1. Obecność mRNA MBNL1 bez e1 prowadzi do powstania niestabilnych izoform białka MBNL1 o obniżonej funkcjonalności, z powodu utraty pierwszych dwóch z czterech palców cynkowych (ZnF), które są niezbędne do rozpoznawania i splicingu RNA. W rezultacie uniemożliwiają one dalszą represję inkluzji e1 i prowadzą do translacji w pełni funkcjonalnego białka z mRNA zawierających e1. Ta oparta na e1 autoregulacyjna pętla sprzężenia zwrotnego zapewnia odpowiedni poziom białka MBNL1, zgodnie z zapotrzebowaniem komórki. Co istotne, wpływ zwiększenia endogennej ilości transkryptu MBNL1, zależnej od P2, nie był dotychczas badany w kontekście terapii eksperymentalnej w DM. Modulacja aktywności P2 może prowadzić do powstania zrównoważonej i różnorodnej ilości wariantów splicingowych MBNL1, regulującej poziom własnego białka poprzez alternatywny splicing e1, chroniąc w ten sposób komórki przed niekontrolowaną i potencjalnie toksyczną nadekspresją MBNL1. Obecnie nie ma skutecznej terapii dla pacjentów z DM. Najlepiej zbadane strategie molekularne w leczeniu DM polegają albo na degradacji wydłużonego RNA CUGexp za pomocą mechanizmów opartych na sekwencjach antysensowych, albo na inhibicji i/lub rozbijaniu toksycznego kompleksu RNA:MBNL za pomocą związków drobnocząsteczkowych i ligandów. Alternatywnie, w badaniach in vivo nad DM nadekspresja MBNL wykazała obiecujący potencjał terapeutyczny, na przykład poprzez dostarczanie MBNL1 przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusami (rAAV) lub endogenną modulację ekspresji MBNL1 za pomocą małych cząsteczek i oligomerów antysensowych. Terapeutyczna regulacja ekspresji endogennego MBNL1, badana w niniejszej rozprawie doktorskiej, opiera się na konserwatywnym komórkowym mechanizmie aktywacji genów – RNAa (aktywacja RNA). RNAa może być indukowana przez sztucznie zaprojektowane, ukierunkowane na promotor dwuniciowe RNA, zwane małymi aktywującymi RNA (saRNA). Terapeutyczna użyteczność RNAa została wykazana w przypadku kilku genów w różnych modelach nowotworowych. Te nowatorskie podejście, zastosowane do MBNL1, pozwoliło na opracowanie nowej strategii terapeutycznej dla DM1. Dwa zidentyfikowane saRNA, skierowane na specyficzne sekwencje docelowe promotora 2 (P2) genu MBNL1, doprowadziły do ~2-krotnego wzrostu poziomu pre-mRNA, mRNA i białka MBNL1 oraz do skorygowania nieprawidłowego alternatywnego splicingu związanego z DM1 w różnych modelach komórkowych. Mechanistycznie, saRNA specyficznie stymulowały transkrypcję MBNL1 poprzez zależne od AGO2 ładowanie nici antysensowej (wiodącej) z dwuniciowego saRNA na promotor MBNL1 oraz rekrutację kluczowych czynników szlaku RNAa (RHA i CTR9) i RNAPII. Ponadto wykryto udział dwóch czynników transkrypcyjnych (MEIS1 i MEIS2) w regulacji ekspresji MBNL1 związanej z jednym ze zidentyfikowanych dupleksów saRNA., Przedstawione dane wykluczyły mechanistyczny udział długiego niekodującego RNA (lncRNA) MBNL1-AS1, powstającego z niekodującej nici DNA genu MBNL1 i nakładającego się częściowo na jego promotor P2 .Co więcej, dane wchodzące w skład pracy opublikowanej w ramach tej rozprawy, natomiast nie będące częścią tej rozprawy, wykluczyły mechanistyczny udział krótkich RNA związanych z promotorem i wskazały, że potencjalny efekt off-target w postaci obniżenia lncRNA MBNL1-AS1 pod wpływem saRNA zależny jest od aktywności nici sensowej (pasażerskiej) dupleksu i może być wyeliminowany chemiczną modyfikacją. Podsumowując, regulacja ekspresji endogennego MBNL1 przy udziale saRNA oferuje nową strategię terapeutyczną w DM1, przy niższym poziomie MBNL1 w porównaniu z egzogenną nadekspresją, co tym samym może ograniczyć skutki uboczne związane z wysokim poziomem białka. Myotonic Dystrophy (DM) is an autosomal dominant neuromuscular disorder and is the most common form of muscular dystrophy in adults. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is caused by expansion of a CTG triplet repeat in the 3′ untranslated region (3′UTR) of dystrophia myotonica protein kinase (DMPK) gene and involves variable spectrum of symptoms including most characteristic myotonia, cardiomyopathy, insulin-resistance as well as muscular weakness and atrophy. Mutated DMPK transcripts containing expanded CUG repeat tracts (CUGexp) form hairpin-like structures which are retained in the nuclei where they sequester distinct RNA-binding proteins, including Muscleblind-like (MBNL) family members, eventually accumulating as discrete ribonuclear foci. MBNL proteins control cellular RNA metabolism through the regulation of alternative splicing, alternative polyadenylation as well as stability and localization of mRNAs. Amongst the three MNBL paralogs, MBNL1 is predominantly expressed in majority of tissues and plays major roles in alternative splicing regulation (except for the brain where MBNL2 predominates). Importantly, there are three promoters (P1, 2 and 3) and three transcription start sites (TSS1, 2 and 3) involved in MBNL1 expression, among which P2 is the major driver in most tissues. Moreover, only P2/TSS2-derived transcripts undergo MBNL-dependent regulation of the alternative splicing of first coding exon (e1), while P1/TSS1- and P3/TSS3-derived mRNAs exhibit always skipped or included e1, respectively. E1-depleted MBNL1 mRNAs give rise to unstable MBNL1 protein isoforms with decreased functionality, due to loss of first two of four zinc fingers (ZnFs) that are essential for RNA target recognition and splicing, thus unable to further repress e1 inclusion and resulting in translation of a fully functional protein from e1-containing mRNAs. This e1-based autoregulatory feedback loop ensures appropriate MBNL1 protein level according to cellular demands. Notably, the impact of upregulation of the endogenous P2-mediated MBNL1 expression has not been tested previously in the context of experimental therapy against DM. Modulating P2 activity could give a rise to a balanced MBNL1 splice isoforms diversity regulating its own protein level via e1 alternative splicing, hence protecting the cells from uncontrolled and possibly toxic MBNL1 overexpression. Currently, there is no effective therapy for DM patients. The most explored types of molecular strategies for treating DM target either the expanded CUGexp RNA for degradation via distinct antisense-based mechanisms, or inhibit and / or disrupt the toxic RNA:MBNL complex via distinct small molecule compounds and ligands. Alternatively, MBNLs overexpression has shown promising therapeutic potential in DM in vivo, such as delivery of recombinant adeno-associated (rAAV) vectors carrying MBNL1 or endogenous modulation of MBNL1 expression via small molecules and antisense oligomers. The therapeutic upregulation of endogenous MBNL1, investigated in this PhD Thesis, is based on a conserved cellular mechanism of gene activation - RNAa (RNA activation). RNAa can be induced by artificially designed promoter-targeted duplex (double-stranded) RNAs termed small activating RNAs (saRNAs). The therapeutic utility of RNAa was demonstrated with several genes in distinct cancer models. This novel approach, when applied to MBNL1, allowed to develop a new type of possible treatment strategy for DM1. Two identified saRNAs, directed at specific MBNL1 promoter 2 (P2) sequences, led to upregulation of MBNL1 pre-mRNA, mRNA and protein level up to ~2-fold and reversed alternative splicing alterations linked to DM1 in distinct cellular models. Mechanistically, saRNAs stimulated MBNL1 transcription specifically through the involvement of AGO2-mediated loading of the antisense strand of saRNA duplex onto MBNL1 promoter, and recruitment of crucial RNAa pathway components (RHA and CTR9) and RNAPII. Additionally, contribution of two transcription factors (MEIS1 and MEIS2) in saRNA-mediated MBNL1 upregulation was detected. Furthermore, presented data ruled out potential involvement of lncRNA MBNL1-AS1 in MBNL1 RNAa. Moreover, data included in the published original article that are part of this dissertation, but not part of my PhD Thesis, excluded the mechanistic involvement of short promoter-associated RNAs and indicated that the potential off-target effect of lncRNA MBNL1-AS1 downregulation by saRNA depends on the activity of the sense (passenger) strand of the duplex and can be eliminated by chemical modification. In summary, saRNA-mediated upregulation of the endogenous MBNL1 offers a new opportunity to achieve therapeutic effects in DM1 with lower level of MBNL1 upregulation compared to exogenous overexpression, and hence may limit side effects associated with high protein levels.Item type:Item, Access status: Open Access , Taksonomiczne i genetyczne badania sekcji Ricciella z rodzaju Riccia w Europie ze szczególnym uwzględnieniem R. fluitans i R. rhenana(2025) Gospodinov, Galin; Buczkowska-Chmielewska, Katarzyna. Promotor; Natcheva, Rayna. PromotorTaksonomia dostarcza systematycznych ram do klasyfikacji organizmów żywych, które są nieustannie udoskonalane, aby uwzględniać różnorodność i dynamikę życia. Gatunek, jako podstawowa jednostka klasyfikacji taksonomicznej, historycznie definiowano na podstawie cech morfologicznych, cech ekologicznych i rozmieszczenia geograficznego. W erze pregenetycznej badacze gromadzili okazy, dokumentowali ich morfologię, ekologię i rozmieszczenie oraz publikowali szczegółowe opisy gatunków. Po opublikowaniu i dostosowaniu do zasad odpowiedniego Międzynarodowego Kodeksu Nomenklatury, gatunek był formalnie uznawany. Społeczność naukowa mogła jednak odrzucić proponowany gatunek lub dla tego samego organizmu w różnych regionach mogły pojawić się różne nazwy gatunkowe, co odzwierciedlało dynamiczny i iteracyjny charakter taksonomii. Postępy w badaniach genetycznych znacząco wpłynęły na rozwój taksonomii, umożliwiając precyzyjniejsze rozgraniczenie gatunków oraz wspierając ciągłe doskonalenie systemów klasyfikacyjnych. W ujęciu uproszczonym, współczesna taksonomia stanowi systematyczne ramy klasyfikacyjne, łączące dane morfologiczne i genetyczne w celu precyzyjnego porządkowania różnorodności biologicznej. Ponieważ ranga gatunkowa stanowi podstawę całej nauki taksonomicznej, procesy specjacji i ich zrozumienie odgrywają fundamentalną rolę w rozwoju taksonomii. Hybrydyzacja stanowi kluczowy mechanizm specjacji, prowadzący do powstania mieszańców w wyniku rozmnażania płciowego między osobnikami należącymi do różnych gatunków. Struktura genetyczna takich mieszańców zależy od gatunków rodzicielskich, co może skutkować hybrydyzacją homoploidalną, gdy mieszaniec zachowuje tę samą liczbę chromosomów co rodzice, lub hybrydyzacją poliploidalną, gdy mieszaniec dziedziczy połączone zestawy chromosomów obojga rodziców, tworząc poliploid. Poliploidia może również powstawać w wyniku mechanizmów innych niż hybrydyzacja, takich jak podwojenie somatyczne, aposporia lub apogamia. Poliploidia dzieli się na autoploidy, gdy duplikacja chromosomów zachodzi w obrębie jednego gatunku, oraz na alloploidy, gdy powstają w wyniku hybrydyzacji międzygatunkowej. Procesy te są szczególnie istotne dla specjacji w sekcji Ricciella z rodzaju Riccia, gdzie różnorodność genetyczna i prostota morfologiczna potęgują złożoność taksonomiczną. Głównym celem niniejszej pracy było określenie pokrewieństwa genetycznego między R. fluitans a R. rhenana. W tym celu objęto analizą całą sekcję Ricciella. Przeanalizowano najważniejsze prace dotyczące tego rodzaju i dokonano niezbędnych wyjaśnień taksonomicznych. Omówiono ważne aspekty biologiczne i zidentyfikowano nowe cechy charakterystyczne dla danego gatunku. W przeprowadzonych badaniach przeanalizowano rozmiary genomów, liczbę chromosomów, dane izoenzymatyczne oraz sekwencje barkodowe DNA. Wyniki uzyskane w trakcie mojej pracy zdecydowanie potwierdzają hybrydowe pochodzenie R. rhenana, a tym samym jej pozycję taksonomiczną jako odrębnego gatunku, a nie jako cytotypu R. fluitans. Udowodniłem również istniejącą już hipotezę, że R. fluitans jest kompleksem blisko spokrewnionych gatunków kryptycznych. Na podstawie uzyskanych wstępnych wyników, sekcja Ricciella nie tworzy monofiletycznego kladu w obrębie podrodzaju Ricciella. Obecny skład gatunkowy sekcji nie został tutaj potwierdzony. Możliwa rearanżacja sekcji mogłaby wyglądać następująco: sekcja. Ricciella obejmuje gatunki wodne R. fluitans, R. rhenana, R. stricta, R. stenophylla oraz gatunki kryptyczne do nich należące, w tym różne mieszańce, w obrębie kompleksu R. rhenana. Należy utworzyć osobną sekcję dla grupy R. canaliculata, obejmującej również R. perennis, R. duplex i potencjalne inne gatunki mieszańcowe. Nadal nie jest jasne, czy R. huebeneriana i R. multifida powinny być włączone razem do grupy Canaliculata. Na obecnym etapie wiedzy na temat rodzaju nie jest możliwe dokonanie ostatecznych reorganizacji taksonomicznych. Dane i interpretacje dotyczące sekcji Ricciella przedstawione w niniejszej pracy posłużą jako podstawa do dalszych badań. Taxonomy provides a systematic framework for classifying living organisms, which is continuously evolving to accommodate the diversity and dynamics of life. The species, as the fundamental unit of taxonomic classification, has historically been defined based on morphological characters, ecological traits, and geographic distribution. In the pregenetic era, researchers collected specimens, documented their morphology, ecology, and distribution, and published detailed descriptions. Once published and compliant with the rules of the relevant International Code of Nomenclature, a species was formally recognized. However, the scientific community could reject a proposed species, or multiple species epithets might emerge for the same organism across different regions, reflecting the dynamic and iterative nature of taxonomy. Advances in genetic research have significantly enhanced taxonomic science, enabling more precise species delineation and fostering ongoing refinements to classification systems. In a simpler way, taxonomy today is a systematic framework that integrates morphological and genetic traits to classify living organisms. With the species rank being the backbone to the entire taxonomic science, the processes of speciation and their understanding have the fundamental role of moving taxonomy forward. Hybridization is a key mechanism of speciation, producing hybrids through sexual reproduction between individuals of different species. The genetic structure of a hybrid varies depending on the parental species, resulting in either homoploid hybridization, where the hybrid retains the same chromosome number as its parents, or polyploid hybridization, where the hybrid inherits the combined chromosome sets of both parents, forming a polyploid. Polyploidy can also arise through mechanisms other than hybridization, such as somatic doubling, apospory, or apogamy. Polyploids are classified as autopolyploids when chromosome duplication occurs within a single species, or allopolyploids when resulting from interspecific hybridization. These processes are particularly relevant to the speciation of sect. Ricciella genus Riccia, where genetic diversity and morphological simplicity drive taxonomic complexity. The main focus of this work is the genetic relationship between R. fluitans and R. rhenana. In order this relationship to be revealed, the entire section Ricciella is taken into account. Major works dealing with the genus are analyzed and essential taxonomic clarification are made. Important biological aspects are discussed and a new species-specific characteristics identified. Genome sizes, chromosome counts, isozyme data, and barcodes are generated and analyzed. The results obtained during my work strongly support the hybrid origin of R. rhenana and by this its taxonomic position as a separate species, and not as a cytotype of R. fluitans. I also prove the already existing hypothesis of R. fluitans being a complex of closely related cryptic species. Based on the obtained preliminary results, section Ricciella does not form a monophyletic clade, within subgenus Ricciella. The current species composition of the section is here not supported. A possible section rearrangement could be as follows: sect. Ricciella comprised by the aquatic species R. fluitans, R. rhenana, R. stricta, R. stenophylla and the cryptic species belonging to them, including the different hybrids, withing the R. rhenana complex. A separate section should be established for the R. canaliculata group, including also R. perennis, R. duplex and the potential other hybrid species. Whether R. huebeneriana and R. multifida should be included together within the Canaliculata group at this points is still unclear. At the current stage of knowledge on the genus, definite taxonomic rearrangements cannot be made. The data and interpretations on section Ricciella presented herein will be used as foundation for further investigation.Item type:Item, Access status: Open Access , Rola struktury drugorzędowej RNA w regulacji translacji w odpowiedzi na stres antybiotykowy u bakterii antybiotykoopornych na przykładzie metycylinoopornego szczepu Staphylococcus aureus(2026) Szustakowska, Marta Katarzyna; Żywicki, Marek. PromotorSzybka reakcja bakterii na bodźce środowiskowe ma kluczowe znaczenie dla adaptacji bakterii do nowych warunków. W kontekście bakterii lekoopornych szybkie dostosowanie się bakterii do zmian środowiskowych powoduje, że potrafią one niwelować działanie antybiotyków o wąskim spektrum działania, aktywując mechanizmy regulujące ekspresję odpowiednich genów (McCallum i in. 2010, Craft i in. 2019). Odpowiedź ta jest oparta o liczne mechanizmy, w tym o zdolność zwijania mRNA w alternatywne struktury, które uczestniczą w regulacji m.in. translacji (Geissmann i in. 2009). W efekcie, mechanizmy regulacyjne oparte o RNA, a w szczególności ryboprzełączniki, zyskały w ostatnich latach status potencjalnych celów terapeutycznych, umożliwiających precyzyjne modulowanie ekspresji genów kluczowych dla funkcjonowania bakterii. Niniejsza rozprawa doktorska stanowi próbę systemowej analizy tych mechanizmów regulacyjnych u Staphylococcus aureus — bakterii Gram-dodatniej, która wykształciła wiele szczepów lekoopornych, w tym MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus). W badaniach wykorzystano zaawansowane techniki, takie jak SHAPE-MaP (ang. Selective 2′-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension and Mutational Profiling) oraz Ribo-seq (profilowanie translacyjne), umożliwiające szczegółowe mapowanie struktury RNA i ocenę aktywności translacyjnej. Analiza porównawcza translatomu przeprowadzona została w warunkach fizjologicznych oraz pod wpływem subletalnych stężeń antybiotyków — wankomycyny i cefoksytyny. Integracja danych strukturalnych z wynikami profilowania rybosomalnego pozwoliła na ilościowe określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA oraz ocenę dostępności elementów kluczowych dla inicjacji tego procesu. Opracowana metoda oparta na danych NGS stwarza możliwości szybszej identyfikacji celów terapeutycznych w leczeniu infekcji bakteryjnych. Podejście to umożliwia projektowanie leków oddziałujących na wiele szlaków regulacyjnych jednocześnie, co może zwiększyć skuteczność terapii i ograniczyć rozwój oporności. Taki systemowy model działania, w kontekście rosnącej liczby izolatów MRSA poza środowiskiem szpitalnym (Lakhundi i Zhang 2018), stanowi odpowiedź na jedno z najpoważniejszych wyzwań współczesnej medycyny. A rapid bacterial response to environmental stimuli is crucial for adaptation to changing conditions. In the context of antibiotic-resistant bacteria, swift adjustment to environmental changes enables them to counteract the effects of narrow-spectrum antibiotics by activating mechanisms that regulate the expression of specific genes (McCallum et al. 2010, Craft et al. 2019). This response relies on multiple regulatory pathways, including the ability of mRNA to fold into alternative structures that influence processes such as translation (Geissmann et al. 2009). As a result, RNA-based regulatory mechanisms — particularly riboswitches — have recently gained recognition as potential therapeutic targets, offering the possibility of precisely modulating the expression of resistance-related genes at the translational level. This doctoral dissertation presents a systemic analysis of these regulatory mechanisms in Staphylococcus aureus, a Gram-positive bacterium that has developed numerous resistant strains, including MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus). The study employs advanced techniques such as SHAPE-MaP (Selective 2′-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension and Mutational Profiling) and Ribo-seq (ribosomal profiling), which enable detailed mapping of RNA structure and assessment of translational activity. Comparative analysis of the translatome was conducted under physiological conditions and in the presence of sublethal concentrations of antibiotics — vancomycin and cefoxitin. Integration of structural data with ribosome profiling results allowed for quantitative evaluation of mRNA translation efficiency and assessment of the accessibility of key elements involved in translation initiation. The developed NGS-based approach offers a framework for faster identification of therapeutic targets in the treatment of bacterial infections. This strategy enables the design of drugs that act on multiple regulatory pathways simultaneously, potentially enhancing treatment efficacy and limiting the development of resistance. Such a systemic model of action, considering the growing number of MRSA isolates outside hospital settings (Lakhundi & Zhang 2018), addresses one of the most pressing challenges in modern medicine.Item type:Item, Access status: Restricted , Rola tlenku azotu w regulacji stanu acetylacji białek histonowych u Phytophthora infestans (Mont.) de Bary(2025) Guan, Yufeng; Arasimowicz-Jelonek, Magdalena. PromotorCoraz więcej dowodów wskazuje na to, że duża plastyczność fenotypowa jednego z najbardziej niszczycielskich fitopatogenów na świecie, Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, jest efektem mechanizmów epigenetycznych, które umożliwiają mu szybką adaptację do zmiennych sygnałów wewnętrznych i stresorów środowiskowych, w tym również rośliny-gospodarza. Co istotne, 5-metylocytozyna w DNA nie została wykryta u Phytophthora, stąd odwracalne modyfikacje białek histonowych, w szczególności acetylacja i deacetylacja, mogą odgrywać kluczową rolę w epigenetycznej kontroli ekspresji genów. U P. infestans procesy te są kontrolowane przez 33 acetylotransferazy histonowe (HATs) i 11 deacetylaz histonowych (HDACs). Zarówno u roślin, jak i u zwierząt, cząsteczka sygnałowa - tlenek azotu (NO) może również funkcjonować jako epigenetyczny modulator ekspresji genów. Chociaż rola NO w epigenetyce mikroorganizmów pozostaje niezbadana, cząsteczka ta może być formowana w strukturach patogenów podczas krytycznych przemian rozwojowych i ekspozycji na stresy. Wobec powyższego, nadrzędnym celem badań było wyjaśnienie, czy i w jakim stopniu, NO oraz następujący stres nitrozacyjny, na który patogen jest narażony podczas swojego cyklu życiowego, wpływa na wzorce (de)acetylacji histonów i zmiany ekspresji genów, prowadzące do efektywnej adaptacji i/lub patogeniczności P. infestans. Badania oparto na analizie porównawczej pomiędzy izolatem awirulentnym (Avr) MP946 i wirulentnym (vr) MP977 P. infestans względem odmiany ziemniaka (Solanum tuberosum L.) Sarpo Mira z genem odporności R3a, co pozwoliło na śledzenie zmian, potencjalnie związanych z wirulencją patogenu. Eksperymenty obejmowały fazę saprofityczną (in vitro) i pasożytniczą mikroorganizmu (in planta). W celu stworzenia warunków stresu nitrozacyjnego patogen był eksponowany na specyficzne modulatory reaktywnych form azotu (RNS). W pierwszym etapie badań wykazano, że wzmożone formowanie NO i jego pochodnej, nadtlenoazotynu, towarzyszyło fazie sporulacji oraz wzrostowi patogenu in planta. Zarówno w warunkach in planta, jak i in vitro, stres nitrozacyjny prowadził do istotnych zmian w globalnej acetylacji histonów H3 i H4. Zaobserwowana hiperacetylacja lizyny 56 histonu H3 (H3K56ac) i lizyny 16 histonu H4 (H4K16ac) korelowała z indukcją ekspresji genów HATs, tj., PifHAM1 i PifHAC3, które odpowiedzialne są za formowanie H4K16ac i H3K56ac. Zależne od RNS zmiany w architekturze histonów, w postaci wzbogaconej akumulacji znaczników H3K56ac i H4K16ac, w regionach promotorowych molekularnych markerów fazy biotroficznej patogenu (Avr3a i Hmp1) oraz innych krytycznych genów związanych z patogenicznością (CesA1, CesA2, CesA3, sPLD-like1), wpływały na wzrost ekspresji tych genów. W kontynuacji badań, przeprowadzona charakterystyka in silico i identyfikacja jądrowych HDACs wrażliwych na RNS wykazały, że PifHDAC3 potencjalnie katalizuje deacetylację H3K56ac i reprezentuje najwyższy poziom akumulacji transkryptu w odpowiedzi na NO u Avr/vr P. infestans. Ponadto immunoanaliza wykazała, że w środowisku nitrozacyjnym in vitro oraz in planta, białko PifHDAC3 występuje powszechnie. Nie stwierdzono jednak aby RNS wywołały S-nitrozację i inhibicję PifHDAC3. Z uwagi na stwierdzony związek PifHDAC3 z kolonizacją ziemniaka przez P. infestans, ostatni etap badań wyjaśniał, czy NO i zależne od niego komórkowe zmiany redoks mogą wpływać na rekrutację PifHDAC3 do chromatyny. Analiza immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq) umożliwiła identyfikację kluczowych procesów bezpośrednio regulowanych przez PifHDAC3 u P. infestans w warunkach środowiska nitrozacyjnego. Wykazano, że loci genów docelowych dla PifHDAC3 obejmują, m.in., geny zaangażowane w strategie ofensywne P. infestans. Stwierdzony efekt był zależny od genotypu patogenu. Dowiedziono, że dostępność NO prowadzi do przemieszczenia PifHDAC3 z promotora Avr3a, a zniesienie represyjnej struktury chromatyny umożliwia aktywację transkrypcyjną Avr3a. W podsumowaniu należy podkreślić kluczową rolę NO jako ważnego sygnału epigenetycznego w biologii P. infestans oraz dynamiczną interakcję między RNS a HATs/HDACs w regulacji ekspresji genów. Wykazano, że NO/RNS, poprzez zmianę statusu (de)acetylacji histonów, stymulują proces przeprogramowania transkrypcyjnego genów związanych ze strategiami metabolicznymi, rozwojowymi i ofensywnymi patogenu i jego szybką adaptację do nowych środowisk. Wykazano, że sygnalizacja zależna od NO oraz związany z tą cząsteczką stres nitrozacyjny, odgrywają strategiczną rolę u P. infestans egzystującego w warunkach presji środowiska. Emerging evidence suggests that the high phenotypic plasticity of one of the world's most destructive phytopathogens, Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, is driven by epigenetic mechanisms that enable its rapid adaptation to internal signals and environmental stressors, including the host-plant. Notably, Phytophthora lacks 5-methylcytosine DNA modifications, suggesting that reversible histone modifications—particularly acetylation and deacetylation—play a central role in gene regulation in these microorganisms. In P. infestans, these processes are mediated by 33 histone acetyltransferases (HATs) and 11 histone deacetylases (HDACs). Recent studies have shown that a potent signaling molecule, nitric oxide (NO), beyond its diverse regulatory roles, may also function as an epigenetic modulator of gene expression in both animals and plants. Although NO role in microbial epigenetics remains underexplored, it may accumulate in pathogen structures during critical developmental transitions and under stress. Based on the above, the primary aim of the research was to determine whether and to what extent NO and the following nitrosative stress to which P. infestans is exposed during its lifecycle affect the histone (de)acetylation patterns, thereby modulating gene expression to enhance adaptability and/or pathogenicity. The research was based on a comparative analysis between the virulent (vr) MP977 and avirulent (Avr) MP946 isolates of P. infestans against the potato (Solanum tuberosum L.) ‘Sarpo Mira’, genotype with the R3a resistance gene, to identify changes that may affect the pathogen’s virulence. The experiments included the saprophytic phase (in vitro) and the microorganism’s parasitic phase (in planta). To mimic nitrosative stress, specific reactive nitrogen species (RNS) modulators were applied to the pathogen culture. Firstly, a significant increase in the formation of NO and its derivative, peroxynitrite, was documented in P. infestans' structures during both the sporulation phase and in planta growth. It has been shown that similarly to in planta conditions, pharmacologically induced nitrosative stress results in significant changes in the global acetylation of histones H3 and H4. The observed hyperacetylation of histone H3 lysine 56 (H3K56ac) and histone H4 lysine 16 (H4K16ac) correlated with the induction of the expression of HAT genes, i.e., PifHAM1 and PifHAC3, which may catalyze the formation of H4K16ac and H3K56ac, respectively. The RNS-mediated changes in histone architecture in the form of enriched H3K56ac and H4K16ac mark accumulation in the promoter regions of the molecular markers of the pathogen’s biotrophic phase (i.e., Avr3a and Hmp1) and other critical pathogenicity-related genes (CesA1, CesA2, CesA3, sPLD-like1) up-regulated their expression. Subsequent in silico characterization and identification of RNS-responsive nuclear HDACs in P. infestans revealed that PifHDAC3 potentially catalyzes H3K56ac deacetylation and shows the highest level of transcript accumulation in response to NO. Notably, PifHDAC3 showed high abundance under nitrosative environments (in vitro and in planta); however, RNS did not provoke S-nitrosation and inhibition of recombinant PifHDAC3. As PifHDAC3 was associated with the host colonization by P. infestans, the final stage of the study evaluated whether NO and the subsequent shift in the redox environment could affect the HDAC’s recruitment to chromatin. Thus, chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) profiling provided insight into the key pathways regulated by PifHDAC3 in Avr/vr P. infestans exposed to a nitrosative environment, and revealed PifHDAC3-targeted genes involved, including those related to the pathogen's offensive strategies in a genotype-dependent manner. Notably, the NO availability led to the displacement of PifHDAC3 from the Avr3a promoter, and the loss of repressive chromatin structure enabled the transcriptional activation of Avr3a. Summarizing, the dynamic interplay between RNS and HATs/HDACs is vital in influencing the expression of diverse P. infestans genes and documents NO as an essential epigenetic signal in the pathogen biology. By altering the histone (de)acetylation status, NO/RNS trigger the transcriptional reprogramming of genes related to metabolic, developmental, and offensive strategies, which may promote high adaptability to new (micro)environments. Thus, NO signaling and nitrosative stress play a crucial role in the operation of P. infestans’ under environmental pressure.Item type:Item, Access status: Open Access , Strategie terapeutyczne w dystrofii mięśniowej Duchenne’a: badanie kompensacyjnej roli DP71 we wczesnych stadiach rozwoju mięśni(2025) Szwec, Sylwia; Konieczny, Patryk. PromotorDystrofia mięśniowa Duchenne’a (DMD) to ciężka choroba prowadząca do zaniku mięśni, dotykająca 1 na 5000 chłopców i prowadząca do przedwczesnej śmierci około 30. roku życia. Choroba ta spowodowana jest mutacjami w genie DMD, prowadzącymi do utraty pełnej izoformy dystrofiny — DP427. U około 10% pacjentów brak jest także występującej w mioblastach izoformy DP71, co wiąże się z cięższym fenotypem choroby. Utrofina UP395, paralog dystrofiny DP427, której ekspresja dominuje w życiu płodowym, może częściowo kompensować brak DP427, natomiast funkcja DP71 w dojrzałej tkance mięśniowej wciąż nie została dokładnie poznana. Nasze badania koncentrowały się na wyjaśnieniu ograniczeń obecnych strategii terapeutycznych opartych na dystrofinie i utrofinie, określeniu ról DP427 i DP71 w proliferacji komórek oraz różnicujących włókienkach mięśniowych, ocenie potencjału kompensacyjnego DP71 w mięśniach pozbawionych DP427, a także analizie terapeutycznego znaczenia różnych wariantów splicingowych DP71. Zidentyfikowaliśmy regiony utrofiny ograniczające jej funkcję kompensacyjną oraz fragmenty dystrofiny, które mogą przyczyniać się do wywoływania odpowiedzi immunologicznej w terapiach DMD. Wykorzystując modele DMD, wykazaliśmy, że brak DP427 we włóknach mięśniowych oraz brak DP71 w proliferujących mioblastach prowadzą do podobnego fenotypu. Dodatkowo, nasze badania pokazały wzrost DP71 w komórkach pozbawionych DP427 oraz rolę kompensacyjną DP71 we wczesnym różnicowaniu mięśni poprzez poprawę przeżywalności komórek, redukcje ROS oraz napływu wapnia. Zbadaliśmy także wpływ różnych wariantów splicingowych DP71, ujawniając różnice w ich stabilności, lokalizacji wewnątrzkomórkowej i zdolności do przywracania funkcji komórkowych - niektóre z nich powodowały wzrost poziomu ROS w określonych przedziałach komórkowych. Podsumowując, wykazaliśmy znaczenie specyficznych domen dystrofiny i utrofiny zarówno dla skuteczności terapii, jak i dla kontroli odpowiedzi immunologicznej. Nasze analizy podkreśliły podobieństwa oraz różnice funkcjonalne DP427 i DP71, dostarczając nowych informacji na temat potencjalnej roli DP71 jako czynnika terapeutycznego we wczesnych etapach różnicowania się mięśni pozbawionych dystrofiny. Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe muscle-wasting disorder affecting 1 in 5,000 boys, leading to premature death around age 30. It is caused by mutations in the DMD gene, resulting in the loss of the full-length dystrophin isoform DP427. In about 10% of cases, a short DP71 isoform, synthesized ubiquitously in myoblasts, is also absent, and these patients tend to show more severe phenotype. The DP427 paralog, utrophin UP395, generated during fetal muscle development, can partially compensate for DP427 deficiency in patients. In contrast, the roles of DP71 in control and DMD muscle cells are not known. Our research focused on explaining limitations of current dystrophin- and utrophin-based therapeutic approaches in DMD, identifying the roles of DP427 and DP71 in cell proliferation and myofiber differentiation, determining compensatory potential of DP71 in DP427-deficient muscle fibers, and evaluating therapeutic roles of various DP71 splice variants. We analyzed key dystrophin and utrophin domains for DMD treatment, identifying regions in utrophin that limit its compensatory function and potential immune triggers in dystrophin-based therapies. Next, using various DMD models, we found that loss of DP427 in myofibers and DP71 in proliferating myoblasts led to similar cellular defects and apoptosis. Further investigation showed that DP71 can compensate for DP427 loss during the early stage of myofiber differentiation, with its synthesis increasing in cells lacking DP427. This upregulation reduced ROS, calcium influx, and improved cell viability. We also explored the impact of different DP71 splice variants, revealing variations in their stability, localization, and ability to restore cellular functions, though some increased ROS levels in specific compartments. In summary, we demonstrated the significance of specific dystrophin and utrophin domains in both treatment efficacy and immune response regulation. Our analysis also highlighted similar and distinct functions of DP427 and DP71, providing new insights into the therapeutic potential of DP71 during the early stages of muscle fibers lacking all dystrophins.