Doktoraty (WB)
Permanent URI for this collection
Browse
Browsing Doktoraty (WB) by Subject "ABA"
Now showing 1 - 4 of 4
Results Per Page
Sort Options
Item Charakterystyka mechanizmu degradacji kinazy kaskady MAP - MAPKKK18 zależnej od proteasomu(2022) Tajdel-Zielińska, Małgorzata; Ludwików, Agnieszka. PromotorKinazy MAP uczestniczą w szlakach sygnalizacyjnych w postaci kaskady tworzonej przez kolejno aktywowane w wyniku fosforylacji kinazy MAPKKK, MAPKK i MPK. Kaskady kinaz MAP przekształcają bodźce zewnątrzkomórkowe w odpowiedzi wewnątrzkomórkowe, przez co odgrywają kluczową rolę w sprawnym przystosowaniu się do stresów środowiskowych, zarówno o podłożu biotycznym jak i abiotycznym. Jednym z głównych fitohormonów roślinnych związanych z koordynacją odpowiedzi na stresy środowiskowe jest kwas abscysynowy (ABA). Najważniejszymi efektorami sygnalizacji ABA są fosfatazy i kinazy białkowe. Jednak, mimo intensywnych badań niewiele wiadomo na temat roli kinaz MAP, zwłaszcza MAPKKK, w szlaku sygnałowym ABA. Obiektem badań przeprowadzonych w ramach niniejszej pracy jest kinaza aktywowana przez ABA inicjująca kaskadę kinaz MAP, tj. MAPKKK18. Aby scharakteryzować kaskadę kinaz MAP rozpoczynającą się od kinazy MAPKKK18 podjęto próbę zidentyfikowania kinazy MKK działającej poniżej MAPKKK18. Przeprowadzone analizy wykazały, że jedynym partnerem kinazy MAPKKK18 w kaskadach kinaz MAP jest kinaza MKK3. Aby opisać funkcję biologiczną tego oddziaływania, badano wpływ modułu MAPKKK18-MKK3 na proces rozwoju aparatów szparkowych. Uzyskane wyniki wskazują, że MKK3 działa poniżej MAPKKK18 w rozwoju aparatów szparkowych zarówno na wczesnych, jak i na późniejszych etapach. Oznacza to, że kaskada MAPKKK18-MKK3 może funkcjonować jako efektor sygnalizacji ABA w procesie rozwoju aparatów szparkowych. W kolejnych etapach prac skupiono się na mechanizmach zaangażowanych w regulację aktywności MAPKKK18. Analizowano rolę białek kompleksu podstawowej sygnalizacji ABA w regulacji aktywności MAPKKK18. Z wykorzystaniem drożdżowego systemu dwuhybrydowego, a także techniki pull-down zidentyfikowano oddziaływania między MAPKKK18 i ABI1, a także między MAPKKK18 i SNRK2.6. Tym samym, kompleksy MAPKKK18/ABI1/SnRK2.6 mogą stanowić ważny element skomplikowanego systemu regulacji aktywności MAPKKK18. Ponadto powyższe rezultaty podkreślają istotne znaczenie MAPKKK18 w transdukcji sygnału ABA. Ponieważ integralną częścią transdukcji sygnałów z udziałem efektorów ABA jest degradacja białek przez proteasom 26 S, w niniejszej pracy skupiono się na dwóch niezwykle istotnych molekularnych aspektach degradacji MAPKKK18. Pierwszy dotyczył identyfikacji reszt lizynowych będących miejscem poliubikwitynacji MAPKKK18, a drugi - poznania ligazy ubikwityny E3 specyficznie modyfikującej MAPKKK18. Zidentyfikowano trzy ligazy ubikwityny E3, mogące kierować MAPKKK18 do degradacji, tj. KEG, UPL1 oraz UPL4. Przeprowadzone badania wskazują także, że sygnałem do degradacji MAPKKK18 przez proteasom 26 S jest przyłączenie cząsteczki ubikwityny do lizyny 154 w sekwencji MAPKKK18. Wyniki uzyskane w ramach niniejszej pracy rzucają światło na mechanizmy leżące u podstaw przekazywania zewnątrzkomórkowych sygnałów z udziałem efektorów ABA.Item Identyfikacja nowego i regulowanego przez ABA miRNA oraz charakterystyka jego genu docelowego - AtBRO1 w procesach wzrostu i w odpowiedzi na stres abiotyczny u Arabidopsis thaliana(2023) Syed, Muhammad Muntazir Mehdi; Ludwików, Agnieszka. PromotorWiele czynników środowiskowych, takich jak podwyższona temperatura, zasolenie i susza, mają wpływ na wzrost i produktywność upraw. Kluczowym szlakiem sygnałowym uczestniczącym w regulacji odpowiedzi roślin na stres jest rdzeniowa sygnalizacja kwasu absysynowego (ABA). ABA kontroluje reakcje roślin poprzez regulację ekspresji genów, także z udziałem ścieżek zależnych od miRNA. miRNA biorą udział w różnych procesach biologicznych, w tym w reakcjach adaptacyjnych na stres abiotyczny. Celem mojej pracy doktorskiej była identyfikacja nowych miRNA zaangażowanych w regulację ekspresji genów w odpowiedzi na ABA. Aby zrealizować postawiony cel badania prowadzono z zastosowaniem rośliny modelowej Arabidopsis thalina formy dzikiej (WT) oraz mutantów szlaku sygnałowego ABA: abi1td, mkkk17 i mkkk18. Analizy z wykorzystaniem RNAseq umożliwiły identyfikację 10 nowych miRNA w odpowiedzi na ABA (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) u formy dzikiej A.thaliana oraz 1 nowy miRNA u mutanta mkkk17. Ponadto, analiza wyników ujawniła, że trzy, siedem i dziewięć znanych miRNA ulegało różnej ekspresji w odpowiedzi na ABA u mutantów abi1td, mkkk17 i mkkk18. Wyniki sekwencjonowania zostały potwierdzone za pomocą ilościowego RT-PCR we wszystkich badanych genotypach. By zidentyfikować geny docelowe i potencjalne miejsca cięcia dla nowozidentyfikowanych miRNA wykorzystano psRNA Target oraz 5′ RLM-RACE. Analiza ontologii wykazała, że potencjalne geny docelowe znanych i nowych miRNA reagujących na ABA są zaangażowane w różne procesy komórkowe w roślinach, w tym rozwój i ruchy aparatów szparkowych. Wyniki te sugerują, że wiele zidentyfikowanych miRNA odgrywa ważną rolę w odpowiedziach roślin na stres środowiskowy i może pełnić wspólne funkcje regulacyjne w szlaku sygnałowym ABA. W kolejnym etapie badania koncentrowały się na charakterystyce nieznanego białka BRO1, zawierającego domenę podobną do BRO (AT1G73390), które jest celem jednego z nowo zidentyfikowanych miRNA, ath-miRn-1. W toku analiz wykazano, że w odpowiedzi na zasolenie, ABA i mannitol transkrypt BRO1 ulegał indukcji. Transgeniczne linie A.thaliana z nadekspresją BRO1 wykazywały silną tolerancję na suszę i stres solny wskazując, że BRO1 reguluje reakcje odpornościowe u roślin. Promotor AtBRO1 w fuzji z GUS wykazywał ekspresję głównie w liściach rozety i kwiatach, zwłaszcza w pylnikach. Analiza lokalizacji subkomórkowej BRO1::GFP wykazała, że białko to lokalizuje się przy błonie cytoplazmatycznej protoplastu. Wyniki analizy transkyptomicznej mutanta typu nokaut w genie BRO1, bro1-1, w odniesieniu do linii dzikiej Arabidopsis, wykazały zmiany w ekspresji wielu genów, o których wiadomo, że są zaangażowane w odpowiedź roślin na stres. Podsumowując, stwierdzono, że BRO1 może odgrywać ważną rolę w regulacji odpowiedzi transkrypcyjnej na ABA i indukcji odpowiedzi roślin na stres abiotyczny. Podsumowując, wyniki badań przedstawione w prezentowanej rozprawie, umożliwiły poznanie nowych mechanizmów regulujących odpowiedź roślin na stres abiotyczny i powiązanych z sygnalizacją ABA. Najważniejszym wynikiem pracy jest identyfikacja aż 11 nieznanych miRNA i głębsza charakterystyka funkcjonowania jednego ze z nich - ath-miRn-1 – w powiązaniu z identyfikacją nowego efektora w reakcji roślin na stres i nieznanego dotąd BRO1. Wyniki uzyskane w ramach pracy rzucają światło na mechanizmy leżące u podstaw tolerancji na stres. Many environmental factors, such as increased temperature, salinity and drought, affect the growth and productivity of crops. A key signaling pathway involved in regulating plant responses to stress is the absisic acid (ABA) signaling pathway. ABA controls plant responses through the regulation of gene expression, also through miRNA dependent pathways. miRNAs are involved in various biological processes, including adaptive responses to abiotic stress. The aim of my PhD thesis was the identification of novel miRNAs which are involved in the regulation of gene expression in response to ABA. In order to achieve this goal, the study was carried out using the model plant Arabidopsis thaliana wild type (WT) and mutants of the ABA signalling pathway: abi1td, mkkk17 and mkkk18. The RNAseq analyses identified 10 new miRNAs in response to ABA in the wild type A. thaliana (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) and 1 new miRNA in the mkkk17 mutant. In addition, analysis of the results showed that three, seven and nine known miRNAs were differentially expressed in response to ABA in the abi1td, mkkk17 and mkkk18 mutants, respectively. In all genotypes tested, the sequencing results were confirmed by quantitative RT-PCR. To identify target genes and potential cleavage sites for newly identified miRNAs, psRNA-Target and 5′ RLM RACE were used. Ontology analysis revealed that the potential target genes of known and novel ABA-responsive miRNAs are involved in various cellular processes in plants, including stomatal development and movement. These results suggest that many of the identified miRNAs play important roles in plant responses to environmental stress. They may have common regulatory functions in the ABA signalling pathway. In the next step, they focused on characterising of the unknown BRO-like domain-containing protein AtBRO1 (AT1G73390) which is targeted by one of the newly identified miRNAs, ath-miRn-1. Analyses showed that BRO1 is induced in response to salinity, ABA and mannitol. Transgenic Arabidopsis lines overexpressing BRO1 showed strong tolerance to drought and salt stress, suggesting that BRO1 regulates stress responses in plants. The BRO1 promoter fused to GUS was expressed mainly in rosette leaves and flowers, especially in anthers. Analysis of the subcellular localisation of BRO1::GFP showed that this protein was localised to the cytoplasmic membrane of the protoplast. The results of the transcriptomic analysis of the knockout mutant in the BRO1 gene, bro1-1, compared to the wild Arabidopsis line showed changes in the expression of many genes known to be involved in plant stress responses. It was concluded that BRO1 may play an important role in regulating the transcriptional response to ABA and in inducing plant responses to abiotic stress. In conclusion, the results presented have allowed the identification of new mechanisms regulating the response of plants to abiotic stress and related to ABA signalling. The most important result is the identification of 11 unknown miRNAs and a deeper characterisation of the function of one of them - ath-miRn-1 - in connection with the identification of a new effector in the plant response to stress - the previously unknown BRO1. The results of this work will shed light on the mechanisms underlying stress tolerance in plants.Item Określenie roli kinazy kaskady MAP - MAPKKK18 w regulacji sygnalizacji kwasu abscysynowego u Arabidopsis thaliana(2018) Mituła, Filip; Ludwików, Agnieszka. PromotorKinazy aktywowane mitogenami (MAP) tworzą u roślin rozbudowane ścieżki sygnałowe w formie kaskad - sygnał przekazywany jest poprzez fosforylację kolejnych kinaz MAP. Aktywne MAPKKK fosforylują specyficzne MAPKK, które fosforylują kinazy MAPK. Kinazy MAP są zaangażowane w odpowiedź na stres, zarówno o podłożu biotycznym, jak i abiotycznym. ABA jest fitohormonem silnie związanym z odpowiedzią na stresy środowiskowe. Poziom ABA reguluje m.in. kiełkowanie nasion, elongację korzeni i ruchy aparatów szparkowych. Obiektem badań zawartych w pracy jest MAPKKK18, kinaza MAP u Arabidopsis, której ekspresja jest zależna od aktywności rdzeniowej sygnalizacji ABA. W niniejszej pracy podjęto próbę określenia mechanizmów regulujących aktywność MAPKKK18 i opisania funkcji MAPKKK18 w sygnalizacji ABA. W toku badań nie zaobserwowano zmiany aktywności MAPKKK18 pod wpływem fitohormonów innych niż ABA. Udokumentowano zmianę lokalizacji subkomórkowej MAPKKK18 w wyniku indukcji ABA. Udowodniono również, że MAPKKK18 oddziałuje bezpośrednio z fosfatazą ABI1 i kinazą SnRK2.6/OST1. Na podstawie tych wyników postanowiono zbadać wpływ aktywności genu MAPKKK18 na fenotypy powiązane z sygnalizacją ABA i wykazano wpływ MAPKKK18 na siłę kiełkowania nasion i ruchy aparatów szparkowych. MAPKKK18 jest również zaangażowana w regulację procesu tworzenia aparatów szparkowych i wpływa na liczbę aparatów szparkowych na w epidermie Arabidopsis poprzez ścieżkę niezależną od kaskady kinaz MAP rozpoczynającej się od kinazy YODA.Item Rola czynników transkrypcyjnych MYB33, MYB65 i MYB101 w odpowiedzi roślin na niedobór wody(2019) Wyrzykowska, Anna; Szweykowska- Kulińska, Zofia. PromotorBiałko CBP80/ABH1, które wraz z białkiem CBP20 wiążą się do struktury kapu każdego transkryptu RNA polimerazy, dzięki czemu biorą one udział w regulacji dojrzewania pre-mRNA i pri-miRNA. Stąd też wniosek, że brak aktywności genu CBP80/ABH1 musi wywoływać efekt plejotropowy na rozwój i życie rośliny. Rośliny z unieczynnionym genem CBP80/ABH1 wykazują nadmierną wrażliwość na kwas abscysynowy w trakcie kiełkowania, szybciej niż rośliny typu dzikiego zamykają aparaty szparkowe pod jego wpływem oraz lepiej tolerują niedobór wody. Celem tej pracy jest analiza roli genów poniżej genu CBP80/ABH1 w szlaku transdukcji sygnału ABA w odpowiedzi roślin na stres suszy, hipoteza jaką postawiłam zakłada iż nadekspresja genów MYB33, MYB65 i MYB101 nie wywoła poważnych zakłóceń w innych szlakach rozwoju roślin oraz zwiększy tolerancję roślin na niedobór wody. Uzyskano linie Arabidopsis o nadekspresji białek MYB33, MYB65 i MYB101 pochodzących z Arabidopsis, oraz o nadekspresji białek MYB33 i MYB65 pochodzących z ziemniaka. Natomiast w liniach transgenicznych ziemniaka uzyskano nadekspresję genów MYB33, MYB65 i MYB101 pochodzących z Arabidopsis, oraz jego własnych genów MYB33 i MYB65. Wszystkie te rośliny zdecydowanie lepiej tolerują suszę dzięki wyższej względnej zawartości wody w liściach, a ich aparaty szparkowe są znacząco bardziej wrażliwe na ABA w porównaniu do roślin typu dzikiego.