Identyfikacja nowego i regulowanego przez ABA miRNA oraz charakterystyka jego genu docelowego - AtBRO1 w procesach wzrostu i w odpowiedzi na stres abiotyczny u Arabidopsis thaliana
Loading...
Date
2023
Authors
Advisor
Editor
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Title alternative
Identification of novel and ABA-regulated miRNAs and characterization of its target gene - AtBRO1 upon growth and abiotic stress response in Arabidopsis thaliana
Abstract
Wiele czynników środowiskowych, takich jak podwyższona temperatura, zasolenie i susza, mają wpływ na wzrost i produktywność upraw. Kluczowym szlakiem sygnałowym uczestniczącym w regulacji odpowiedzi roślin na stres jest rdzeniowa sygnalizacja kwasu absysynowego (ABA). ABA kontroluje reakcje roślin poprzez regulację ekspresji genów, także z udziałem ścieżek zależnych od miRNA. miRNA biorą udział w różnych procesach biologicznych, w tym w reakcjach adaptacyjnych na stres abiotyczny. Celem mojej pracy doktorskiej była identyfikacja nowych miRNA zaangażowanych w regulację ekspresji genów w odpowiedzi na ABA. Aby zrealizować postawiony cel badania prowadzono z zastosowaniem rośliny modelowej Arabidopsis thalina formy dzikiej (WT) oraz mutantów szlaku sygnałowego ABA: abi1td, mkkk17 i mkkk18. Analizy z wykorzystaniem RNAseq umożliwiły identyfikację 10 nowych miRNA w odpowiedzi na ABA (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) u formy dzikiej A.thaliana oraz 1 nowy miRNA u mutanta mkkk17. Ponadto, analiza wyników ujawniła, że trzy, siedem i dziewięć znanych miRNA ulegało różnej ekspresji w odpowiedzi na ABA u mutantów abi1td, mkkk17 i mkkk18. Wyniki sekwencjonowania zostały potwierdzone za pomocą ilościowego RT-PCR we wszystkich badanych genotypach. By zidentyfikować geny docelowe i potencjalne miejsca cięcia dla nowozidentyfikowanych miRNA wykorzystano psRNA Target oraz 5′ RLM-RACE. Analiza ontologii wykazała, że potencjalne geny docelowe znanych i nowych miRNA reagujących na ABA są zaangażowane w różne procesy komórkowe w roślinach, w tym rozwój i ruchy aparatów szparkowych. Wyniki te sugerują, że wiele zidentyfikowanych miRNA odgrywa ważną rolę w odpowiedziach roślin na stres środowiskowy i może pełnić wspólne funkcje regulacyjne w szlaku sygnałowym ABA. W kolejnym etapie badania koncentrowały się na charakterystyce nieznanego białka BRO1, zawierającego domenę podobną do BRO (AT1G73390), które jest celem jednego z nowo zidentyfikowanych miRNA, ath-miRn-1. W toku analiz wykazano, że w odpowiedzi na zasolenie, ABA i mannitol transkrypt BRO1 ulegał indukcji. Transgeniczne linie A.thaliana z nadekspresją BRO1 wykazywały silną tolerancję na suszę i stres solny wskazując, że BRO1 reguluje reakcje odpornościowe u roślin. Promotor AtBRO1 w fuzji z GUS wykazywał ekspresję głównie w liściach rozety i kwiatach, zwłaszcza w pylnikach. Analiza lokalizacji subkomórkowej BRO1::GFP wykazała, że białko to lokalizuje się przy błonie cytoplazmatycznej protoplastu. Wyniki analizy transkyptomicznej mutanta typu nokaut w genie BRO1, bro1-1, w odniesieniu do linii dzikiej Arabidopsis, wykazały zmiany w ekspresji wielu genów, o których wiadomo, że są zaangażowane w odpowiedź roślin na stres. Podsumowując, stwierdzono, że BRO1 może odgrywać ważną rolę w regulacji odpowiedzi transkrypcyjnej na ABA i indukcji odpowiedzi roślin na stres abiotyczny. Podsumowując, wyniki badań przedstawione w prezentowanej rozprawie, umożliwiły poznanie nowych mechanizmów regulujących odpowiedź roślin na stres abiotyczny i powiązanych z sygnalizacją ABA. Najważniejszym wynikiem pracy jest identyfikacja aż 11 nieznanych miRNA i głębsza charakterystyka funkcjonowania jednego ze z nich - ath-miRn-1 – w powiązaniu z identyfikacją nowego efektora w reakcji roślin na stres i nieznanego dotąd BRO1. Wyniki uzyskane w ramach pracy rzucają światło na mechanizmy leżące u podstaw tolerancji na stres.
Many environmental factors, such as increased temperature, salinity and drought, affect the growth and productivity of crops. A key signaling pathway involved in regulating plant responses to stress is the absisic acid (ABA) signaling pathway. ABA controls plant responses through the regulation of gene expression, also through miRNA dependent pathways. miRNAs are involved in various biological processes, including adaptive responses to abiotic stress. The aim of my PhD thesis was the identification of novel miRNAs which are involved in the regulation of gene expression in response to ABA. In order to achieve this goal, the study was carried out using the model plant Arabidopsis thaliana wild type (WT) and mutants of the ABA signalling pathway: abi1td, mkkk17 and mkkk18. The RNAseq analyses identified 10 new miRNAs in response to ABA in the wild type A. thaliana (ath-miRn-1, ath-miRn-2, ath-miRn-3, ath-miRn-4, ath-miRn-5, ath-miRn-6, ath-miRn-7, ath-miRn-8, ath-miRn-9 and ath-miRn-10) and 1 new miRNA in the mkkk17 mutant. In addition, analysis of the results showed that three, seven and nine known miRNAs were differentially expressed in response to ABA in the abi1td, mkkk17 and mkkk18 mutants, respectively. In all genotypes tested, the sequencing results were confirmed by quantitative RT-PCR. To identify target genes and potential cleavage sites for newly identified miRNAs, psRNA-Target and 5′ RLM RACE were used. Ontology analysis revealed that the potential target genes of known and novel ABA-responsive miRNAs are involved in various cellular processes in plants, including stomatal development and movement. These results suggest that many of the identified miRNAs play important roles in plant responses to environmental stress. They may have common regulatory functions in the ABA signalling pathway. In the next step, they focused on characterising of the unknown BRO-like domain-containing protein AtBRO1 (AT1G73390) which is targeted by one of the newly identified miRNAs, ath-miRn-1. Analyses showed that BRO1 is induced in response to salinity, ABA and mannitol. Transgenic Arabidopsis lines overexpressing BRO1 showed strong tolerance to drought and salt stress, suggesting that BRO1 regulates stress responses in plants. The BRO1 promoter fused to GUS was expressed mainly in rosette leaves and flowers, especially in anthers. Analysis of the subcellular localisation of BRO1::GFP showed that this protein was localised to the cytoplasmic membrane of the protoplast. The results of the transcriptomic analysis of the knockout mutant in the BRO1 gene, bro1-1, compared to the wild Arabidopsis line showed changes in the expression of many genes known to be involved in plant stress responses. It was concluded that BRO1 may play an important role in regulating the transcriptional response to ABA and in inducing plant responses to abiotic stress. In conclusion, the results presented have allowed the identification of new mechanisms regulating the response of plants to abiotic stress and related to ABA signalling. The most important result is the identification of 11 unknown miRNAs and a deeper characterisation of the function of one of them - ath-miRn-1 - in connection with the identification of a new effector in the plant response to stress - the previously unknown BRO1. The results of this work will shed light on the mechanisms underlying stress tolerance in plants.
Description
Wydział Biologii
Sponsor
This work was supported by the following sources:
1. The Polish National Science Centre grant, NCN SONATA BIS 2016/22/E/NZ3/00345.
2. The European Union: Passport to the future - Interdisciplinary doctoral studies at the Faculty of Biology, Adam Mickiewicz University. POWR.03.02.00-00-I022/16.
3. Faculty of Biology ‘Dean’s grant’, GDWB-09/2019.
Keywords
miRNA, ABA, ABI1 PP2C, MAPKKK17, MAPKKK18, BRO1, stres abiotyczny, kiełkowanie nasion, Arabidopsis thaliana, abiotic stress, seed germination