Identyfikacja potencjalnych inhibitorów fosfatazy białkowej typu 2C grupa A z Arabidopsis z wykorzystaniem metod bioinformatycznych i biochemicznych
Loading...
Date
2022
Authors
Advisor
Editor
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Title alternative
Integrative structure-based virtual and biochemical screening to identify candidate inhibitors for Arabidopsis group A protein phosphatase type 2C
Abstract
Odwracalna reakcja fosforylacji jest jedną z kluczowych modyfikacji potranslacyjnych, zaangażowanych w regulację procesów komórkowych. U Arabidopisis zidentyfikowano 76 białek przypisanych do rodziny fosfataz białkowych typu 2C (PP2C), które ze względu na podobieństwo sekwencji oraz budowę subdomeny fosfatazowej zostały podzielone na 10 grup. Dotychczasowe wyniki badań wykazują, że przedstawiciele PP2C z grupy A (ABI1, ABI2, HAB1, HAB2, HAI2, HAI2, HAI3 oraz PP2CA/AGH3 i AHG1) są ważnymi komponentami regulacji szlaku sygnalizacji kwasu abscysynowego (ABA). Grupa A fosfataz białkowych PP2C wraz z kinazami białkowymi SnRK2.6 oraz rodziną białek START takich jak: PYL/ PYR/ RCAR (receptory ABA), definiują rdzeń szlaku sygnałowego ABA. Celem tej pracy jest identyfikacja potencjalnych inhibitorów roślinnych fosfataz białkowych z grupy A. Do badań użyto komputerowego przeszukiwania baz związków małocząsteczkowych, a potencjał inhibitorowy wyselekcjonowanych związków chemicznych analizowano biochemicznie z użyciem testów aktywności fosfatazowej. Podczas analiz dokowania molekularnego użyto ponad dwudziestu dwóch milionów związków chemicznych pochodzących z niekomercyjnej bazy ZINC12 oraz kilkuset ligandów od komercyjnych dostawców. Precyzja obliczeń została zwiększona poprzez użycie trzystopniowego algorytmu dokowania molekularnego oraz metod służących estymacji swobodnej energii wiązania (MM-GBSA). Najwyżej ocenione związki zostały zweryfikowane za pomocą analizy in vitro aktywności fosfatazowej. W efekcie prowadzonych analiz zidentyfikowano kilka związków chemicznych o potencjalne hamującym, w tym jedną cząsteczkę, która hamuję aktywność fosfatazy ABI1 o 91% przy stężeniu 100 µm. W pracy badano specyficzność wyselekcjonowanych potencjalnych inhibitorów w obrębie rodziny fosfataz białkowych badając aktywność inhibitorową w kompleksie z fosfatazami z rodzin PP1, PP2A oraz PP2C. Dodatkowo w celu określenia potencjalnej orientacji wiązania wybranych inhibitorów do białka ABI1, przeprowadzono ukierunkowaną mutagenezę fosfatazy białkowej ABI1 oraz analizę jej aktywności fosfatazowej w obecności wybranych związków chemicznych. Reszty aminokwasowe, które zostały poddane mutagenezie wybrano na podstawie symulacji dynamiki molekularnej modeli inhibitor – białko ABI1 oraz analizie PIE wykonaną metodą FMO. Otrzymane wyniki realizacji projektu doktorskiego umożliwią projektowanie nowych inhibitorów fosfataz białkowych 2C u roślin z grupy ABI1 oraz podobnych fosfataz białkowych z grupy 2C, które mogłyby być stosowane w rolnictwie do ochrony upraw przed stresem suszy.
The reversible phosphorylation reaction is one of the key modifications involved in the regulation of numerous cellular processes. In Arabidopisis, 76 members of the protein phosphatase 2C (PP2C) family were identified, which were divided into 10 groups due to sequence similarity and subdomain structure. Recent studies show that PP2C members from group A (ABI1, ABI2, HAB1, HAB2, HAI2, HAI2, HAI3, and PP2CA / AGH3 and AHG1) are important components in the regulation of the abscisic acid (ABA) signaling pathway. Group A of PP2C protein phosphatases together with SnRK2.6 protein kinases and the START family of proteins such as PYL / PYR / RCAR (ABA receptors) consist the core the ABA signaling pathway. As part of the identification of potential inhibitors, a computer search of databases of small molecule compounds was used, combined with the validation of selected chemical compounds by means of in vitro analyzes. During molecular docking analyzes, over twenty-two million chemical compounds from the non-commercial ZINC12 database and several hundred ligands from commercial suppliers were used. The precision of the calculations was increased by the use of the three-stage molecular docking algorithm and the methods for estimating the free energy of binding (MM-GBSA). The highest rated compounds were verified by the analysis of phosphatase activity. Studies have identified several compounds with potential inhibitory potential, including one molecule that inhibits ABI1 phosphatase activity by 91% at a concentration of 100 µm. Selected chemical compounds have also been tested in vitro as part of the family of protein phosphatases (PP1, PP2A and PP2C). Additionally, to determine the potential orientation of the selected inhibitors, ABI1 targeted mutagenesis and analysis of phosphatase activity were performed. The amino acid residues that were mutated were selected on the basis of molecular dynamics simulation of inhibitor-ABI1 protein models and PIE analysis by FMO. The obtained results of the doctoral project should support the design of new inhibitors with increased biological activity against ABI1 and other PP2C proteins that could be used in agriculture to protect crops from drought stres.
The reversible phosphorylation reaction is one of the key modifications involved in the regulation of numerous cellular processes. In Arabidopisis, 76 members of the protein phosphatase 2C (PP2C) family were identified, which were divided into 10 groups due to sequence similarity and subdomain structure. Recent studies show that PP2C members from group A (ABI1, ABI2, HAB1, HAB2, HAI2, HAI2, HAI3, and PP2CA / AGH3 and AHG1) are important components in the regulation of the abscisic acid (ABA) signaling pathway. Group A of PP2C protein phosphatases together with SnRK2.6 protein kinases and the START family of proteins such as PYL / PYR / RCAR (ABA receptors) consist the core the ABA signaling pathway. As part of the identification of potential inhibitors, a computer search of databases of small molecule compounds was used, combined with the validation of selected chemical compounds by means of in vitro analyzes. During molecular docking analyzes, over twenty-two million chemical compounds from the non-commercial ZINC12 database and several hundred ligands from commercial suppliers were used. The precision of the calculations was increased by the use of the three-stage molecular docking algorithm and the methods for estimating the free energy of binding (MM-GBSA). The highest rated compounds were verified by the analysis of phosphatase activity. Studies have identified several compounds with potential inhibitory potential, including one molecule that inhibits ABI1 phosphatase activity by 91% at a concentration of 100 µm. Selected chemical compounds have also been tested in vitro as part of the family of protein phosphatases (PP1, PP2A and PP2C). Additionally, to determine the potential orientation of the selected inhibitors, ABI1 targeted mutagenesis and analysis of phosphatase activity were performed. The amino acid residues that were mutated were selected on the basis of molecular dynamics simulation of inhibitor-ABI1 protein models and PIE analysis by FMO. The obtained results of the doctoral project should support the design of new inhibitors with increased biological activity against ABI1 and other PP2C proteins that could be used in agriculture to protect crops from drought stres.
Description
Wydział Biologii
Sponsor
Środki finansowe na realizację niniejszej rozprawy doktorskiej uzyskano w ramach projektów: 1. „Badanie skuteczności związków małocząsteczkowych związków chemicznych jako potencjalnych inhibitorów roślinnych fosfataz białkowych 2C grupy A”, kierownik grantu: prof. UAM dr hab. Agnieszka Ludwików; Narodowe Centrum Nauki, UMO-2016/22/E/NZ3/00345; 2. „Paszport do przyszłości - Interdyscyplinarne studia doktoranckie na Wydziale Biologii UAM”, Narodowe Centrum Badań i Rozwoju, POWR.03.02.00-00-I006/17; 3. „Biologia obliczeniowa”, Poznańskie Centrum Superkomputerowo-Sieciowo (PCSS), grant nr. 312.
Keywords
fosfataza białkowa ABI1, inhibitory fosfataz PP2C z grupy A, wirtualne badanie przesiewowe, dokowanie molekularne, dynamika molekularna, protein phosphatase ABI1, PP2C group A inhibitors, virtual screening, molecular docking, molecular dynamics