Wpływ bisfosfonianów stosowanych w terapii osteoporozy na metabolizm tlenowy komórek śródbłonka

Abstract

Osteoporoza jest najczęstszą chorobą metabolizmu kości, głównie wśród kobiet w wieku pomenopauzalnym. Najczęściej stosowanymi lekami zmniejszającymi resorpcję kości są bisfosfoniany zawierające azot (N-BPs). Mechanizm działania N-BPs opiera się na blokowaniu enzymu syntazy farnesylopirofosforanu (FPPS) w szlaku mewalonowym. Szlak mewalonowy odgrywa ważną rolę w wielu procesach komórkowych takich jak prenylacja białek i modyfikacje potranslacyjne a także synteza cząsteczek zawierających jednostki izoprenoidowe, w tym hemów a (grup prostetycznych kompleksu IV) czy koenzymu Q (CoQ). CoQ jest kluczowym przenośnikiem elektronów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym oraz ważnym przeciwutleniaczem chroniącym przed uszkodzeniami peroksydacyjnymi, obecnym we wszystkich błonach komórki, głównie mitochondrialnych. Komórki śródbłonka wyściełają naczynia krwionośne, co sprawia, że mają ciągły kontakt z substancjami transportowanymi przez krew, w tym lekami. Praca doktorska koncentruje się na wieloaspektowym wpływie N-BPs na metabolizm tlenowy komórek śródbłonka naczyń krwionośnych. Rozprawa złożona jest z dwóch prac doświadczalnych i jednej pracy przeglądowej, które prezentują analizę mechanizmów, za pomocą których N-BPs, takie jak alendronian i zoledronian, wpływają na metabolizm energetyczny, stres oksydacyjny i funkcjonowanie mitochondriów w komórkach. Materiałem badawczym użytym w pracach doświadczalnych były ludzkie komórki śródbłonka EA.hy926, traktowane przez sześć dni 5 μM alendronianem lub 1 μM zoledronianem, oraz izolowane mitochondria z tych komórek. Analiza zmian metabolizmu energetycznego wywołanych przez N-BPs została przeprowadzona w dwóch etapach tj. na poziomie komórkowym (Publikacja 1) oraz mitochondrialnym (Publikacja 2). Doświadczenia przeprowadzone na całych komórkach śródbłonka (Publikacja 1) pokazały, że N-BPs wywołują spadek żywotności komórek, nasilony stres oksydacyjny i stan zapalny oraz obniżenie aktywności szlaku sygnałowego ERK1/2 zależnego od prenylacji. Stwierdzono także istotne zmiany w metabolizmie energetycznym komórek polegające na zwiększeniu oddychania beztlenowego, obniżeniu mitochondrialnego utleniania głównych substratów oddechowych (oprócz kwasów tłuszczowych) i spadku poziomu ATP. Po raz pierwszy pokazano, że zahamowanie szlaku mewalonowego przez N-BPs wywołuje w komórkach śródbłonka znaczny spadek poziomu całkowitego CoQ oraz utratę jego zredukowanej puli. Zmianom tym towarzyszy wzrost produkcji reaktywnych form tlenu (RFT). Badania wskazują, że N-BPs zmieniają także dynamikę mitochondriów poprzez redukcję ich fragmentacji. A zatem, N-BPs modulują metabolizm energetyczny komórek śródbłonka prowadząc do zmian w statusie energetycznym komórek, homeostazie redoks CoQ, aktywności metabolizmu tlenowego i kontroli jakości mitochondriów. Kolejne badania prowadzone na poziomie mitochondriów izolowanych z komórek śródbłonka poddanych sześciodniowej hodowli z N-BPs (Publikacja 2) koncentrowały się na adaptacji bioenergetyki mitochondriów do dużego ponad 40% spadku poziomu mitochondrialnego CoQ (mtCoQ) wywołanego zahamowaniem szlaku mewalonowego. W mitochondriach komórek traktowanych N-BPs w porównaniu do mitochondriów kontrolnych, obniżeniu całkowitej puli i utracie zredukowanej puli mtCoQ towarzyszy większa produkcja RFT i aktywacja systemów antyoksydacyjnych. Niedobór mtCoQ prowadzi do obniżonego utleniania substratów oddechowych (oprócz kwasów tłuszczowych), obniżonej aktywności kompleksów II i III oraz syntazy ATP, spadku potencjału błonowego mitochondriów, efektywności syntezy ATP oraz reorganizacji superkompleksów łańcucha oddechowego. Większa produkcja RFT związana jest z większym poziomem redukcji mtCoQ. Po raz pierwszy zaobserwowano, że N-BPs mogą prowadzić do obniżenia poziomu hemów a w mitochondriach. A zatem wyniki te wskazują, że wywołane przez N-BPs zaburzenie homeostazy redoks mtCoQ może istotnie wpływać na aktywność bioenergetyczną mitochondriów komórek śródbłonka. Praca przeglądowa przedstawiona w ramach rozprawy (Publikacja 3) zbiera wyniki dotychczasowych badań, wskazujące na szerokie spektrum działania N-BPs poza tkanką kostną – w tym ich wpływ na organizację cytoszkieletu, apoptozę zależną od mitochondriów, gospodarkę wapniową oraz procesy związane z kontrolą jakości mitochondriów. N-BPs, jako inhibitory szlaku mewalonowego, powodują szereg skutków ubocznych zarówno na poziomie całej komórki jak i dotyczących funkcjonowania mitochondriów. Dalsze badania nad złożonym powiązaniem pomiędzy szlakiem mewalonowym, funkcjonowaniem mitochondriów a ogólną homeostazą komórkową mogą być istotne dla optymalizacji klinicznego zastosowania N-BPs, być może uwzględniającego suplementację CoQ10, i ograniczenia efektów ubocznych w tkankach niebędących celem terapii. Wnioski z pracy doktorskiej podkreślają istotne, potencjalnie niepożądane skutki działania N-BPs na komórki niezwiązane z kośćcem, na przykładzie komórek śródbłonka. Przedstawione badania sugerują, że efekty te mogą przyczyniać się do powikłań sercowo-naczyniowych u pacjentów leczonych N-BPs, a mechanizmy mitochondrialne mogą stanowić istotny punkt docelowy dalszych badań oraz potencjalnych strategii ochronnych.

Osteoporosis is the most common disease of bone metabolism, mainly among postmenopausal women. The most commonly used drugs to reduce bone resorption are nitrogen-containing bisphosphonates (N-BPs). The mechanism of action of N-BPs is based on blocking the enzyme farnesylpyrophosphate synthase (FPPS) in the mevalonate pathway. The mevalonate pathway plays an important role in many cellular processes such as protein prenylation and post-translational modifications as well as the synthesis of molecules containing isoprenoid units, including a-hemes (prosthetic groups of complex IV) or coenzyme Q (CoQ). CoQ is a key electron carrier in the mitochondrial respiratory chain and an important antioxidant present in all cell membranes, mainly mitochondrial, that protects against peroxidative damage. Endothelial cells line blood vessels, which means they are in constant contact with substances transported by the blood, including drugs. The doctoral thesis focuses on the multifaceted influence of N-BPs on the oxidative metabolism of vascular endothelial cells. The dissertation consists of two experimental papers and one review paper, which present an analysis of the mechanisms by which N-BPs, such as alendronate and zoledronate, affect energy metabolism, oxidative stress and mitochondrial function in cells. The research material used in the experiments were human endothelial cells EA.hy926, treated for six days with 5 μM alendronate or 1 μM zoledronate, and isolated mitochondria from these cells. The analysis of changes in energy metabolism induced by N-BPs was carried out in two stages, i.e., at the cellular level (Publication 1) and the mitochondrial level (Publication 2). Experiments conducted on whole endothelial cells (Publication 1) showed that N-BPs cause a decrease in cell viability, increased oxidative stress and inflammation, and a decrease in the activity of the prenylation-dependent ERK1/2 signaling pathway. Significant changes in cell energy metabolism were also observed, consisting in increased anaerobic respiration, decreased mitochondrial oxidation of the main respiratory substrates (except fatty acids) and a decrease in ATP level. For the first time, it has been shown that inhibition of the mevalonate pathway by N-BPs induces a significant decrease in the level of total CoQ and a loss of its reduced pool in endothelial cells. These changes are accompanied by an increase in the production of reactive oxygen species (ROS). Studies indicate that N-BPs also change the dynamics of mitochondria by reducing their fission. Thus, N-BPs modulate the energy metabolism of endothelial cells leading to changes in the energy status of cells, CoQ redox homeostasis, the activity of oxygen metabolism and mitochondrial quality control. Further studies conducted at the level of mitochondria isolated from endothelial cells cultured for six days with N-BP (Publication 2) focused on the adaptation of mitochondrial bioenergetics to the large decrease of more than 40% in mitochondrial CoQ (mtCoQ) levels caused by the inhibition of the mevalonate pathway. In mitochondria of cells treated with N-BPs, compared with control mitochondria, the decrease in the total pool and the loss of the reduced pool of mtCoQ are accompanied by greater production of ROS and activation of antioxidant systems. mtCoQ deficiency leads to decreased oxidation of respiratory substrates (except fatty acids), decreased activity of complexes II and III and ATP synthase, decreased mitochondrial membrane potential, efficiency of ATP synthesis and reorganization of respiratory chain supercomplexes. Increased ROS production is associated with higher reduction level of mtCoQ. It was observed for the first time that N-BPs can lead to decreased level of heme a in mitochondria. Therefore, these results indicate that N-BP-induced disruption of mtCoQ redox homeostasis can significantly affect bioenergetic activity of endothelial mitochondria. The review presented in the dissertation (Publication 3) summarizes the results of previous studies indicating a wide spectrum of N-BP action outside bone tissue – including their effects on cytoskeletal organization, mitochondrial-dependent apoptosis, calcium metabolism and processes related to mitochondrial quality control. N-BPs, as inhibitors of the mevalonate pathway, cause a number of side effects both at the cellular level and mitochondrial function. Further studies on the complex relationship between the mevalonate pathway, mitochondrial function and overall cellular homeostasis may be important to optimize the clinical use of N-BPs, possibly including CoQ10 supplementation, and to limit side effects in off-target tissues. The conclusions of the doctoral thesis highlight the significant, potentially adverse effects of N-BP on non-skeletal cells, exemplified by endothelial cells. The studies presented suggest that these effects may contribute to cardiovascular complications in patients treated with N-BP, and mitochondrial mechanisms may be an important target for further research and potential protective strategies.