Rola struktury drugorzędowej RNA w regulacji translacji w odpowiedzi na stres antybiotykowy u bakterii antybiotykoopornych na przykładzie metycylinoopornego szczepu Staphylococcus aureus

Abstract

Szybka reakcja bakterii na bodźce środowiskowe ma kluczowe znaczenie dla adaptacji bakterii do nowych warunków. W kontekście bakterii lekoopornych szybkie dostosowanie się bakterii do zmian środowiskowych powoduje, że potrafią one niwelować działanie antybiotyków o wąskim spektrum działania, aktywując mechanizmy regulujące ekspresję odpowiednich genów (McCallum i in. 2010, Craft i in. 2019). Odpowiedź ta jest oparta o liczne mechanizmy, w tym o zdolność zwijania mRNA w alternatywne struktury, które uczestniczą w regulacji m.in. translacji (Geissmann i in. 2009). W efekcie, mechanizmy regulacyjne oparte o RNA, a w szczególności ryboprzełączniki, zyskały w ostatnich latach status potencjalnych celów terapeutycznych, umożliwiających precyzyjne modulowanie ekspresji genów kluczowych dla funkcjonowania bakterii. Niniejsza rozprawa doktorska stanowi próbę systemowej analizy tych mechanizmów regulacyjnych u Staphylococcus aureus — bakterii Gram-dodatniej, która wykształciła wiele szczepów lekoopornych, w tym MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus). W badaniach wykorzystano zaawansowane techniki, takie jak SHAPE-MaP (ang. Selective 2′-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension and Mutational Profiling) oraz Ribo-seq (profilowanie translacyjne), umożliwiające szczegółowe mapowanie struktury RNA i ocenę aktywności translacyjnej. Analiza porównawcza translatomu przeprowadzona została w warunkach fizjologicznych oraz pod wpływem subletalnych stężeń antybiotyków — wankomycyny i cefoksytyny. Integracja danych strukturalnych z wynikami profilowania rybosomalnego pozwoliła na ilościowe określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA oraz ocenę dostępności elementów kluczowych dla inicjacji tego procesu. Opracowana metoda oparta na danych NGS stwarza możliwości szybszej identyfikacji celów terapeutycznych w leczeniu infekcji bakteryjnych. Podejście to umożliwia projektowanie leków oddziałujących na wiele szlaków regulacyjnych jednocześnie, co może zwiększyć skuteczność terapii i ograniczyć rozwój oporności. Taki systemowy model działania, w kontekście rosnącej liczby izolatów MRSA poza środowiskiem szpitalnym (Lakhundi i Zhang 2018), stanowi odpowiedź na jedno z najpoważniejszych wyzwań współczesnej medycyny.

A rapid bacterial response to environmental stimuli is crucial for adaptation to changing conditions. In the context of antibiotic-resistant bacteria, swift adjustment to environmental changes enables them to counteract the effects of narrow-spectrum antibiotics by activating mechanisms that regulate the expression of specific genes (McCallum et al. 2010, Craft et al. 2019). This response relies on multiple regulatory pathways, including the ability of mRNA to fold into alternative structures that influence processes such as translation (Geissmann et al. 2009). As a result, RNA-based regulatory mechanisms — particularly riboswitches — have recently gained recognition as potential therapeutic targets, offering the possibility of precisely modulating the expression of resistance-related genes at the translational level. This doctoral dissertation presents a systemic analysis of these regulatory mechanisms in Staphylococcus aureus, a Gram-positive bacterium that has developed numerous resistant strains, including MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus). The study employs advanced techniques such as SHAPE-MaP (Selective 2′-Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension and Mutational Profiling) and Ribo-seq (ribosomal profiling), which enable detailed mapping of RNA structure and assessment of translational activity. Comparative analysis of the translatome was conducted under physiological conditions and in the presence of sublethal concentrations of antibiotics — vancomycin and cefoxitin. Integration of structural data with ribosome profiling results allowed for quantitative evaluation of mRNA translation efficiency and assessment of the accessibility of key elements involved in translation initiation. The developed NGS-based approach offers a framework for faster identification of therapeutic targets in the treatment of bacterial infections. This strategy enables the design of drugs that act on multiple regulatory pathways simultaneously, potentially enhancing treatment efficacy and limiting the development of resistance. Such a systemic model of action, considering the growing number of MRSA isolates outside hospital settings (Lakhundi & Zhang 2018), addresses one of the most pressing challenges in modern medicine.