Rola FKBP2 w fałdowaniu proinsuliny i powstawaniu komórek β trzustki zróżnicowanych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Abstract

Cukrzyca stanowi jedno z największych wyzwań zdrowotnych współczesności, a jej przebieg związany jest z postępującą dysfunkcją i utratą komórek β trzustki. Prawidłowe funkcjonowanie tych komórek zależy od zdolności do intensywnej syntezy i wydzielania insuliny, co wymaga sprawnych mechanizmów fałdowania proinsuliny. Kluczową rolę w tym procesie odgrywają molekularne chaperony i izomerazy peptydylo-prolilowe, w tym peptydylo-prolyl cis-trans izomeraza 2 (FKBP2). Celem niniejszej rozprawy było zbadanie roli FKBP2 w procesie różnicowania i powstawaniu ludzkich komórek β in vitro, z wykorzystaniem pluripotencjalnych komórek macierzystych (ang. human pluripotent stem cells, hPSC). Postawiono hipotezę, że białko FKBP2 uczestniczy w prawidłowym fałdowaniu proinsuliny, a jego brak prowadzi do aktywacji stresu retikulum endoplazmatycznego (ER), zaburzeń homeostazy wapniowej oraz zmian w różnicowaniu w kierunku komórek β. W pracy opracowano trzy modele hPSC: 1) z delecją genu FKBP2 (ang. FKBP2 knockout, KO), 2) z jego nadekspresją (ang. FKBP2 gene overexpression, OE) oraz 3) z indukowaną delecją genu (ang. FKBP2 induced knockout, iKO). Hodowla hPSC była różnicowana w kierunku komórek β i analizowana z wykorzystaniem szeregu technik, włączając w to immunofluorescencję, western blot, mikroskopię ze strukturalnym oświetleniem i elektronową, testy sekrecji insuliny, pomiary stężenia wapnia oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (ang. single cell RNA-sequencing, scRNA-seq). Uzyskane wyniki pozwoliły stwierdzić, że brak FKBP2 prowadzi do spadku syntezy insuliny przy zachowanej produkcji proinsuliny, akumulacji C-peptydu, zaburzeń morfologii ziarnistości wydzielniczych oraz zmian w poziomie białek uczestniczących w powstawianiu komórek β. Równocześnie obserwowano aktywację stresu ER oraz spadek syntezy białka SERCA2, co skutkowało zaburzoną homeostazą wapniową. Analizy scRNA-seq ujawniły aktywację szlaku NFAT2–HDAC9, prowadzącą do zmiany fenotypu w kierunku komórek α trzustki. Interwencja farmakologiczna hamująca funkcję HDAC9 częściowo przywróciła syntezę insuliny i znacząco spowolniła proces różnicowania w stronę komórek α. Uzyskane wyniki wskazują, że FKBP2 pełni wieloaspektową rolę w komórkach β – działa jako białko opiekuńcze wspomagające fałdowanie proinsuliny, jako regulator odpowiedzi na stres siateczki śródplazmatycznej (ER) i modulator homeostazy wapniowej oraz jako czynnik stabilizujący „tożsamość” komórek β. Jego brak inicjuje kaskadę zaburzeń molekularnych prowadzących do utraty funkcjonalności i przeprogramowania procesu różnicowania w kierunku komórek α. Wyniki te sugerują, że FKBP2 może być potencjalnym biomarkerem funkcji i wydajności procesu różnicowania komórek β z hPSC, co jest istotne dla terapii komórkowych i interwencji farmakologicznych ukierunkowanych na poprawę powstawania i funkcjonowania komórek β w cukrzycy.

Diabetes presents a significant health challenge today, primarily linked to the progressive dysfunction and loss of pancreatic β-cells. The effective functioning of these cells relies on their ability to quickly synthesize and secrete insulin, which hinges on the proper mechanisms for proinsulin folding. In this regard, molecular chaperones and peptidyl-prolyl isomerases, particularly peptidyl-prolyl cis-trans izomerase 2 (FKBP2), are crucial. This dissertation aims to explore the role of FKBP2 in the differentiation and formation of human β-cells in vitro, leveraging human pluripotent stem cells (hPSCs). It is believed that FKBP2 plays a crucial role in ensuring proinsulin folds correctly, and its absence triggers endoplasmatic reticulum (ER) stress, disrupts calcium homeostasis, and affects the differentiation process towards β- cells. To investigate this, three hPSC models were established: 1) a model with the FKBP2 gene deleted (knockout, KO), 2) a model with FKBP2 overexpression (OE) and 3) a model with an induced knockout of the gene (iKO). The cell cultures were directed toward β-cells and assessed through a diverse range of techniques, including immunofluorescence, Western blotting, structured illumination microscopy, electron microscopy, insulin secretion assays, calcium measurements, and single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq). The findings indicated that FKBP2 deficiency results in reduced insulin synthesis while maintaining proinsulin production. This was accompanied by C-peptide buildup, changes in secretory granule structure, and diminished expression of β-cell maturation markers. At the same time, there was evidence of ER stress activation and lower levels of SERCA2 protein, which led to disrupted calcium balance. Further scRNA-seq analysis uncovered activation of the NFAT2- HDAC9 pathway, suggesting a transition toward a pancreatic α-cell phenotype. Pharmacological intervention that inhibits HDAC9 function has been shown to partially restore insulin synthesis and notably slow the differentiation process toward α-cells. This highlights the multifaceted role of FKBP2 in β-cells: it serves as a chaperone for proinsulin folding, regulates the endoplasmic reticulum (ER) stress response, modulates calcium homeostasis, and stabilizes β-cell identity. When FKBP2 is absent, it triggers a cascade of molecular disruptions that result in a loss of functionality and a shift in the differentiation process toward α-cells (cellular reprogramming). These findings suggest that FKBP2 could be a valuable biomarker for assessing the function and efficiency of β-cell differentiation from hPSCs, which is crucial for advancing cell therapies and pharmacological strategies aimed at enhancing β-cell formation and function in diabetes.