System drożdżowy do przeszukiwania inhibitorów głównej proteazy SARS-CoV-2

Abstract

Pandemia COVID-19, wywołana wirusem Betacoronavirus pandemicum (SARS-CoV-2) doprowadziła do śmierci milionów ludzi na całym świecie. Jednym z białek niezbędnych do funkcjonowania SARS-CoV-2 jest jego główna proteaza (Mpro), co czyni ją jednym z ważniejszych celów dla potencjalnych leków. Celem niniejszej rozprawy doktorskiej było opracowanie bezpiecznego, ekonomicznie przystępnego i szybkiego systemu przesiewowego, opartego na drożdżach Saccharomyces cerevisiae, do badania aktywności Mpro oraz poszukiwania jej inhibitorów. System ten umożliwia kontrolowaną ekspresję genu kodującego Mpro, który został umieszczony pod kontrolą promotora GAL1. Zaproponowany system pozwala na określenie aktywności Mpro zarówno poprzez jego toksyczny wpływ na wzrost komórek drożdży, jak i pomiar zmian poziomu fluorescencji. System wykazał czułość na znane inhibitory Mpro, ale także umożliwił identyfikację nowych, wcześniej nieopisanych inhibitorów, takich jak meisoindigo. Dodatkowo, przeprowadzone badania wskazały na związek między aktywnością Mpro a funkcjonowaniem mitochondriów. Zaobserwowano, że Mpro jest szczególnie toksyczne w warunkach wymagających od komórek aktywnych mitochondriów. Na podstawie pomiarów poziomu oddychania komórkowego oraz obserwacji mikroskopowych wykazano, że Mpro obniża zużycie tlenu, zakłóca potencjał wewnętrznej błony mitochondrialnej oraz powoduje deformację struktury mitochondriów. Ponadto, w ramach pracy przedstawiono przegląd literatury dotyczącej szerokiego wykorzystania drożdży w badaniach nad SARS-CoV-2, obejmujących analizę aktywności Mpro, badanie oddziaływań między białkami wirusa a białkami gospodarza, produkcję szczepionek oraz tworzenie replikonów SARS-CoV-2. Niniejsza rozprawa doktorska prezentuje skuteczny system drożdżowy umożliwiający wykrywanie inhibitorów Mpro. oraz dostarcza nowej wiedzy na temat wpływu Mpro na kluczowe struktury subkomórkowe, takie jak mitochondria, pogłębiając zrozumienie mechanizmów działania SARS-CoV-2.

The COVID-19 pandemic, caused by the Betacoronavirus pandemicum virus (SARS-CoV-2), has resulted in the death of millions of people worldwide. One of the proteins required for SARS-CoV-2 to function is its main protease (Mpro), making it one of the most important targets for potential drugs. The aim of this thesis was to develop a safe, inexpensive and rapid screening system based on the yeast Saccharomyces cerevisiae to study Mpro activity and search for its inhibitors. This system allows the controlled expression of the Mpro gene under the control of the GAL1 promoter. The proposed system allows for the determination of Mpro activity both through its toxic effect on yeast cell growth and through measurement of changes in fluorescence level. The system showed sensitivity to known Mpro inhibitors, but also allowed the identification of new, previously undescribed inhibitors, such as meisoindigo. In addition, the results indicated a relationship between Mpro activity and mitochondrial function. Mpro was observed to be particularly toxic under conditions that require active mitochondria in cells. Based on measurements of cellular respiration levels and microscopic observations, Mpro was shown to reduce oxygen consumption, disrupt the inner mitochondrial membrane potential, and cause deformation of mitochondrial structure. In addition, this thesis presents a literature review of the extensive use of yeast in SARS-CoV-2 research, including the analysis of Mpro activity, the study between viral- host protein interactions, vaccine production, and the formation of SARS-CoV-2 replicons. This dissertation presents an effective yeast system for the detection of Mpro inhibitors and provides new insights into the effects of Mpro on key subcellular structures such as mitochondria, expanding our understanding of the mechanisms of SARS-CoV-2 action.