Modulacja endogennej ekspresji MBNL1 poprzez aktywację RNA (RNAa) jako nowe podejście terapeutyczne w dystrofii miotonicznej typu 1 (DM1)

Abstract

Dystrofia miotoniczna (DM) to autosomalnie dominujące zaburzenie nerwowo-mięśniowe i najczęstsza postać dystrofii mięśniowej u dorosłych. Dystrofia miotoniczna typu 1 (DM1) jest spowodowana ekspansją trójnukleotydowego powtórzenia CTG w nieulegającym translacji regionie 3' (3'UTR) genu kinazy białkowej dystrofii miotonicznej (DMPK) i obejmuje zróżnicowane spektrum objawów, w tym najbardziej charakterystyczną miotonię, kardiomiopatię, insulinooporność, a także osłabienie i zanik mięśni. Zmutowane transkrypty DMPK zawierające nadmiernie wydłużone ciągi powtórzenia CUG (CUGexp) tworzą w jądrach komórkowych struktury przypominające spinki do włosów, gdzie sekwestrują różne białka wiążące RNA, w tym tez rodziny białek typu muscleblind-like (MBNL), gromadząc się jako ziarnistości jądrowe (foci). Białka MBNL kontrolują metabolizm RNA w komórce poprzez regulację alternatywnego splicingu, alternatywnej poliadenylacji, a także biogenezy, stabilności i lokalizacji mRNA. Spośród trzech paralogów MNBL, MBNL1 jest głównie eksprymowanym w większości tkanek i odgrywa kluczową rolę w regulacji alternatywnego splicingu (z wyjątkiem mózgu, gdzie dominuje MBNL2). Co ważne, transkrypcja MBNL1 kontrolowana jest przez trzy promotory (P1, 2 i 3) oraz trzy miejsca startu transkrypcji (TSS1, 2 i 3), spośród których P2 jest najbardziej aktywnym promotorem w większości tkanek. Co więcej, tylko transkrypty pochodzące z P2/TSS2 podlegają zależnej od białek MBNL regulacji alternatywnego splicingu pierwszego eksonu kodującego (e1), podczas gdy mRNA pochodzące z P1/TSS1 i P3/TSS3 zawsze wykazują odpowiednio pominięty lub włączony e1. Obecność mRNA MBNL1 bez e1 prowadzi do powstania niestabilnych izoform białka MBNL1 o obniżonej funkcjonalności, z powodu utraty pierwszych dwóch z czterech palców cynkowych (ZnF), które są niezbędne do rozpoznawania i splicingu RNA. W rezultacie uniemożliwiają one dalszą represję inkluzji e1 i prowadzą do translacji w pełni funkcjonalnego białka z mRNA zawierających e1. Ta oparta na e1 autoregulacyjna pętla sprzężenia zwrotnego zapewnia odpowiedni poziom białka MBNL1, zgodnie z zapotrzebowaniem komórki. Co istotne, wpływ zwiększenia endogennej ilości transkryptu MBNL1, zależnej od P2, nie był dotychczas badany w kontekście terapii eksperymentalnej w DM. Modulacja aktywności P2 może prowadzić do powstania zrównoważonej i różnorodnej ilości wariantów splicingowych MBNL1, regulującej poziom własnego białka poprzez alternatywny splicing e1, chroniąc w ten sposób komórki przed niekontrolowaną i potencjalnie toksyczną nadekspresją MBNL1. Obecnie nie ma skutecznej terapii dla pacjentów z DM. Najlepiej zbadane strategie molekularne w leczeniu DM polegają albo na degradacji wydłużonego RNA CUGexp za pomocą mechanizmów opartych na sekwencjach antysensowych, albo na inhibicji i/lub rozbijaniu toksycznego kompleksu RNA:MBNL za pomocą związków drobnocząsteczkowych i ligandów. Alternatywnie, w badaniach in vivo nad DM nadekspresja MBNL wykazała obiecujący potencjał terapeutyczny, na przykład poprzez dostarczanie MBNL1 przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusami (rAAV) lub endogenną modulację ekspresji MBNL1 za pomocą małych cząsteczek i oligomerów antysensowych. Terapeutyczna regulacja ekspresji endogennego MBNL1, badana w niniejszej rozprawie doktorskiej, opiera się na konserwatywnym komórkowym mechanizmie aktywacji genów – RNAa (aktywacja RNA). RNAa może być indukowana przez sztucznie zaprojektowane, ukierunkowane na promotor dwuniciowe RNA, zwane małymi aktywującymi RNA (saRNA). Terapeutyczna użyteczność RNAa została wykazana w przypadku kilku genów w różnych modelach nowotworowych. Te nowatorskie podejście, zastosowane do MBNL1, pozwoliło na opracowanie nowej strategii terapeutycznej dla DM1. Dwa zidentyfikowane saRNA, skierowane na specyficzne sekwencje docelowe promotora 2 (P2) genu MBNL1, doprowadziły do ~2-krotnego wzrostu poziomu pre-mRNA, mRNA i białka MBNL1 oraz do skorygowania nieprawidłowego alternatywnego splicingu związanego z DM1 w różnych modelach komórkowych. Mechanistycznie, saRNA specyficznie stymulowały transkrypcję MBNL1 poprzez zależne od AGO2 ładowanie nici antysensowej (wiodącej) z dwuniciowego saRNA na promotor MBNL1 oraz rekrutację kluczowych czynników szlaku RNAa (RHA i CTR9) i RNAPII. Ponadto wykryto udział dwóch czynników transkrypcyjnych (MEIS1 i MEIS2) w regulacji ekspresji MBNL1 związanej z jednym ze zidentyfikowanych dupleksów saRNA., Przedstawione dane wykluczyły mechanistyczny udział długiego niekodującego RNA (lncRNA) MBNL1-AS1, powstającego z niekodującej nici DNA genu MBNL1 i nakładającego się częściowo na jego promotor P2 .Co więcej, dane wchodzące w skład pracy opublikowanej w ramach tej rozprawy, natomiast nie będące częścią tej rozprawy, wykluczyły mechanistyczny udział krótkich RNA związanych z promotorem i wskazały, że potencjalny efekt off-target w postaci obniżenia lncRNA MBNL1-AS1 pod wpływem saRNA zależny jest od aktywności nici sensowej (pasażerskiej) dupleksu i może być wyeliminowany chemiczną modyfikacją. Podsumowując, regulacja ekspresji endogennego MBNL1 przy udziale saRNA oferuje nową strategię terapeutyczną w DM1, przy niższym poziomie MBNL1 w porównaniu z egzogenną nadekspresją, co tym samym może ograniczyć skutki uboczne związane z wysokim poziomem białka.

Myotonic Dystrophy (DM) is an autosomal dominant neuromuscular disorder and is the most common form of muscular dystrophy in adults. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is caused by expansion of a CTG triplet repeat in the 3′ untranslated region (3′UTR) of dystrophia myotonica protein kinase (DMPK) gene and involves variable spectrum of symptoms including most characteristic myotonia, cardiomyopathy, insulin-resistance as well as muscular weakness and atrophy. Mutated DMPK transcripts containing expanded CUG repeat tracts (CUGexp) form hairpin-like structures which are retained in the nuclei where they sequester distinct RNA-binding proteins, including Muscleblind-like (MBNL) family members, eventually accumulating as discrete ribonuclear foci. MBNL proteins control cellular RNA metabolism through the regulation of alternative splicing, alternative polyadenylation as well as stability and localization of mRNAs. Amongst the three MNBL paralogs, MBNL1 is predominantly expressed in majority of tissues and plays major roles in alternative splicing regulation (except for the brain where MBNL2 predominates). Importantly, there are three promoters (P1, 2 and 3) and three transcription start sites (TSS1, 2 and 3) involved in MBNL1 expression, among which P2 is the major driver in most tissues. Moreover, only P2/TSS2-derived transcripts undergo MBNL-dependent regulation of the alternative splicing of first coding exon (e1), while P1/TSS1- and P3/TSS3-derived mRNAs exhibit always skipped or included e1, respectively. E1-depleted MBNL1 mRNAs give rise to unstable MBNL1 protein isoforms with decreased functionality, due to loss of first two of four zinc fingers (ZnFs) that are essential for RNA target recognition and splicing, thus unable to further repress e1 inclusion and resulting in translation of a fully functional protein from e1-containing mRNAs. This e1-based autoregulatory feedback loop ensures appropriate MBNL1 protein level according to cellular demands. Notably, the impact of upregulation of the endogenous P2-mediated MBNL1 expression has not been tested previously in the context of experimental therapy against DM. Modulating P2 activity could give a rise to a balanced MBNL1 splice isoforms diversity regulating its own protein level via e1 alternative splicing, hence protecting the cells from uncontrolled and possibly toxic MBNL1 overexpression. Currently, there is no effective therapy for DM patients. The most explored types of molecular strategies for treating DM target either the expanded CUGexp RNA for degradation via distinct antisense-based mechanisms, or inhibit and / or disrupt the toxic RNA:MBNL complex via distinct small molecule compounds and ligands. Alternatively, MBNLs overexpression has shown promising therapeutic potential in DM in vivo, such as delivery of recombinant adeno-associated (rAAV) vectors carrying MBNL1 or endogenous modulation of MBNL1 expression via small molecules and antisense oligomers. The therapeutic upregulation of endogenous MBNL1, investigated in this PhD Thesis, is based on a conserved cellular mechanism of gene activation - RNAa (RNA activation). RNAa can be induced by artificially designed promoter-targeted duplex (double-stranded) RNAs termed small activating RNAs (saRNAs). The therapeutic utility of RNAa was demonstrated with several genes in distinct cancer models. This novel approach, when applied to MBNL1, allowed to develop a new type of possible treatment strategy for DM1. Two identified saRNAs, directed at specific MBNL1 promoter 2 (P2) sequences, led to upregulation of MBNL1 pre-mRNA, mRNA and protein level up to ~2-fold and reversed alternative splicing alterations linked to DM1 in distinct cellular models. Mechanistically, saRNAs stimulated MBNL1 transcription specifically through the involvement of AGO2-mediated loading of the antisense strand of saRNA duplex onto MBNL1 promoter, and recruitment of crucial RNAa pathway components (RHA and CTR9) and RNAPII. Additionally, contribution of two transcription factors (MEIS1 and MEIS2) in saRNA-mediated MBNL1 upregulation was detected. Furthermore, presented data ruled out potential involvement of lncRNA MBNL1-AS1 in MBNL1 RNAa. Moreover, data included in the published original article that are part of this dissertation, but not part of my PhD Thesis, excluded the mechanistic involvement of short promoter-associated RNAs and indicated that the potential off-target effect of lncRNA MBNL1-AS1 downregulation by saRNA depends on the activity of the sense (passenger) strand of the duplex and can be eliminated by chemical modification. In summary, saRNA-mediated upregulation of the endogenous MBNL1 offers a new opportunity to achieve therapeutic effects in DM1 with lower level of MBNL1 upregulation compared to exogenous overexpression, and hence may limit side effects associated with high protein levels.