Kompetycja pomiędzy białkami wiążącymi cząsteczki RNA u Escherichia coli

Abstract

Organizmy bakteryjne wykszta.ci.y ro.norodne mechanizmy w celu szybkiej adaptacji do zmieniaj.cych si. warunkow .rodowiska. Istotn. rol. w potranskrypcyjnej regulacji genow u bakterii pe.ni. ma.e niekoduj.ce cz.steczki RNA (sRNA), ktore bior. udzia. w regulacji wi.kszo.ci szlakow komorkowych, procesow metabolicznych i reakcji stresowych w komorce. Mechanizm dzia.ania sRNA polega na oddzia.ywaniu z ich docelowymi mRNA do czego cz.sto wymagana jest obecno.. bia.ek wi...cych cz.steczki RNA. Bia.ka te przyczyniaj. si. mi.dzy innymi do stabilizacji struktury RNA, ochrony przed degradacj. oraz u.atwiaj. oddzia.ywanie pomi.dzy cz.steczkami RNA. Najlepiej poznanym bakteryjnym bia.kiem wi...cym cz.steczki RNA jest bia.ko Hfq. W ostatnich latach zidentyfikowano rownie. now. rodzin. bia.ek wi...cych RNA, ktore zawieraj. domen. FinO. Bia.ka nale..ce do rodziny FinO s. wysoce konserwatywne i szeroko rozpowszechnione w ro.nych Ŕ- i Á-proteobakteriach, takich jak Escherichia coli, Salmonella enterica oraz Neisseria meningitidis, ktore maj. istotne znaczenie dla zdrowia cz.owieka. Komorki bakteryjne Escherichia coli posiadaj. dwa bia.ka z domen. FinO: plazmidowe bia.ko FinO oraz chromosomalne bia.ko ProQ. Analizy globalnego wi.zania cz.steczek RNA w komorkach Escherichia coli oraz Salmonella enterica wykaza.y, .e bia.ka ProQ i Hfq oddzia.uj. z ro.nymi, lecz cz..ciowo nak.adaj.cymi si. pulami cz.steczek RNA. Wykazano, .e bia.ka ProQ, Hfq oraz FinO wi... RNA w obr.bie regionow wewn.trznych spinek terminatorow transkrypcji. Dodatkowo, udowodniono, .e obecno.. motywow bogatych w reszty adenozyny w RNA regulowanych przez ProQ ogranicza ich wi.zanie przez Hfq. Nadal jednak nie wiadomo, jakie czynniki determinuj. specyficzno.. tych bia.ek wobec docelowych cz.steczek RNA oraz jaki jest wp.yw kompetycji i wzajemnych oddzia.ywa. tych bia.ek na selekcj. RNA. Celem niniejszej pracy doktorskiej by.o zbadanie mechanizmow selektywnego rozpoznawania cz.steczek RNA przez wybrane bia.ka wi...ce RNA u Escherichia coli oraz okre.lenie czynnikow determinuj.cych konkurencj. i wzajemne oddzia.ywanie pomi.dzy tymi bia.kami. W zwi.zku z tym skupi.am si. na trzech uzupe.niaj.cych si. kierunkach bada.: identyfikacji cech sekwencyjnych i strukturalnych cz.steczek RNA odpowiedzialnych za ich rozpoznawanie przez bia.ka z domen. FinO, analizie roli wybranych reszt aminokwasowych domeny FinO bia.ka ProQ na wi.zanie cz.steczek RNA w komorkach Escherichia coli oraz na zbadaniu znaczenia kompetycji i wzajemnych oddziaływań pomiędzy białkiem ProQ i Hfq na wiązane cząsteczek RNA w warunkach in vivo. W pierwszej części pracy udowodniłam, że sekwencja nukleotydowa u podstawy spinki terminatorowej jest kluczowa w specyficznym rozpoznawaniu cząsteczek RNA przez białko ProQ i FinO. Nawet niewielkie różnice nukleotydowe w tym regionie mogą zmienić preferencje wiązania RNA przez badane białka. W drugiej części pracy doktorskiej zbadałam znaczenie wybranych reszt aminokwasowych w domenie FinO białka ProQ na wiązanie cząsteczek RNA w warunkach in vivo. Wyniki analizy RIP-seq wykazały, że mutacje w obrębie domeny FinO wpływają w zróżnicowany sposób na zdolność wiązania różnych cząsteczek RNA. Szczególnie istotna okazała się mutacja reszty argininy w pozycji 80, ponieważ prowadziła do znacznego osłabienia wiązania wielu RNA, szczególnie antysensowych RNA oraz cząsteczek należących do systemów toksyna-antytoksyna, takich jak cząsteczki z rodziny Sib RNA. Dalsze analizy strukturalne oraz mapowanie miejsc wiązania na cząsteczkach SibA oraz SibC wykazały, że białko ProQ oraz jego domena FinO wiąże się w rejonie spinki terminatorowej oraz w sąsiadujących elementach struktury drugorzędowej, co powoduje zmiany struktury badanego RNA. Co więcej, na przykładzie SibA i SibC sRNA wykazałam, że domena FinO rozpoznaje RNA zawierające terminator transkrypcji, podczas gdy pełnej długości białko ProQ wiąże również cząsteczki pozbawione tej struktury. Sugeruje to udział innych regionów białka w tworzeniu kompleksów RNA-białko. W ostatniej części pracy zbadałam kompetycję oraz wzajemne oddziaływania pomiędzy białkami ProQ i Hfq w komórkach Escherichia coli. Analiza RIL-seq pokazała, że białka te tworzą dynamiczny system regulacyjny, w którym wzajemnie na siebie wpływają. Zmiany poziomu stężenia jednego białka skutkowały zmianami w wiązanych parach RNA-RNA przez drugie białko, natomiast efekt ten różnił się w zależności od konkretnej pary RNA-RNA. Podsumowując, wyniki niniejszej pracy doktorskiej wykazały, że selektywność oraz zakres oddziaływań białek ProQ, FinO oraz Hfq z wiązanymi cząsteczkami RNA są determinowane w sposób wielopoziomowy. Pojedyncze różnice w sekwencji nukleotydowej u podstawy struktury terminatora transkrypcji RNA zmieniają preferencje wiązania, natomiast mutacje w domenie FinO białka ProQ modyfikują oddziaływania z określonymi cząsteczkami RNA w komórce. Dodatkowo, kompetycja oraz wzajemne oddziaływanie pomiędzy białkiem ProQ i Hfq kształtują pulę wiązanych RNA u Escherichia coli, stanowiąc ważny mechanizm regulacyjny, umożliwiający adaptację komórki do zmieniających się warunków środowiska.

Bacterial organisms have envolved a variety of mechanisms that enable rapid adaptation to changing environmental conditions. Small non-coding RNAs (sRNAs) play a crucial role in post-transcriptional gene regulation in bacteria, participating in the regulation of most cellular pathways, metabolic processes and stress responses. The mechanism of sRNA action relies on interactions with their target mRNAs, which often require the presence of RNA-binding proteins. These proteins contribute, among other functions, to the stabilization of RNA structure, protection against degradation and facilitation of RNA-RNA interactions. The most characterized bacterial RNA-binding protein is Hfq. In recent years, a new family of RNA-binding proteins containing the FinO domain has also been identified. Proteins that belong to the FinO family are highly conserved and widely distributed among various β- i γ-proteobacteria, such as Escherichia coli, Salmonella enterica and Neisseria meningitidis, which are significant for human health. Escherichia coli cells encode two FinO-domain proteins: the plasmid-encoded FinO protein and the chromosomally encoded ProQ protein. Global analyses of RNA binding in Escherichia coli and Salmonella enterica have shown that ProQ and Hfq interact with distinct but partially overlapping pools of RNA molecules. It has been demonstrated that ProQ, Hfq and FinO bind RNA within internal regions of transcription terminator hairpins. Furthermore, the presence of adenosine-rich motifs in ProQ-regulated RNAs has been shown to limit their binding by Hfq. However, the factors that determine the specificity of these proteins toward their target RNAs, as well as the impact of competition and mutual interactions between these proteins on RNA selection, remain largely unknown. The aim of this doctoral thesis was to investigate the mechanisms underlying selective RNA recognition by selected RNA-binding proteins in Escherichia coli and to identify factors determining competition and mutual interactions between these proteins. This work focused on three complementary research directions: identification of sequence and structural features of RNA molecules responsible for their recognition by FinO-domain proteins, analysis of the role of selected amino acid residues within the FinO domain of ProQ in RNA binding in Escherichia coli cells, and investigation of the significance of competition and mutual interactions between ProQ and Hfq in shaping RNA binding in vivo. In the first part of this work, I demonstrated that the nucleotide sequence at the base of the transcription terminator hairpin is critical for the specific recognition of RNA molecules by ProQ and FinO. Even minor nucleotide differences in this region can alter RNA-binding preferences of the studied protein. In the second part of the thesis, I examined the role of selected amino acid residues within the FinO domain of ProQ in RNA binding under in vivo conditions. RIP-seq analysis revealed that mutations within the FinO domain differentially affect the binding capacity of ProQ toward distinct RNA molecules. A mutation of the arginine residue at position 80 proved to be particularly significant, as it resulted in a substantial reduction in the binding of many RNAs, especially antisense RNAs and RNAs that belong to toxin-antitoxin systems, such as members of the Sib RNA family. Further structural analyses and mapping of binding sites on SibA and SibC RNAs showed that ProQ and its FinO domain bind within the terminator hairpin region as well as adjacent secondary structure elements, inducing structural changes in the RNA. Moreover, using SibA and SibC sRNAs as examples, I demonstrated that the FinO domain recognizes RNAs containing a transcription terminator, whereas full-length ProQ is also capable of binding RNAs lacking this structure. This suggests that regions outside the FinO domain contribute to RNA-protein complex formation. In the final part of this work, I investigated competition and interactions between ProQ and Hfq in Escherichia coli cells. RIL-seq analysis showed that these proteins form a dynamic regulatory system in which they influence each other. Changes in the cellular level of one protein resulted in alterations in RNA-RNA pairs bound by the other protein, with the magnitude and direction of the effect depending on the specific RNA-RNA pair. In summary, the results of this doctoral thesis demonstrate that the selectivity and range of interactions between ProQ, FinO and Hfq and their associated RNA molecules are determined in a multilayered manner. Single nucleotide differences at the base of RNA transcription terminator structures alter binding preferences, while mutations within the FinO domain of ProQ modulate interactions with specific RNA molecules in the cell. In addition, competition and mutual interactions between ProQ and Hfq shape the pool of bound RNAs in Escherichia coli, representing an important regulatory mechanism that enables cellular adaptation to changing environmental conditions.