Nowe układy bioanalityczne bazujące na DNAzymach o aktywności peroksydazowej
Loading...
Date
2013-06-13
Authors
Advisor
Editor
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Title alternative
New bioanalytical systems based on DNAzymes with peroxidase-mimicking activity
Abstract
Rozprawa doktorska poświęcona jest problematyce dotyczącej nowych układów bioanalitycznych z udziałem aptamerów DNA o właściwości katalitycznych, które nazywane są DNAzymami. Wybrany został najbardziej interesujący DNAzym, będący kompleksem kwadrupleksu G-4 z hemina i wykazujący aktywność peroksydazową. Taki system może katalizować reakcję indykatorową pomiędzy cząsteczką odpowiedniego substratu (np. barwny związek chemiczny) i nadtlenkiem wodoru, co zostało wykorzystane do amplifikowanej detekcji w różnorodnych aplikacjach bioanalitycznych, także do oznaczania aktywności telomerazy. Enzym ten występuje w 90% komórek nowotworowych i jest stosowany jako marker nowotworów.
Celem podjętych badań była weryfikacja możliwości opracowania nowej bezpośredniej metody wyznaczania aktywności telomerazy w oparciu o DNAzym tworzony na bazie telomerowego DNA oraz zaprojektowanie nowatorskich rozwiązań dotyczących monitorowania reakcji indykatorowej DNAzymu.
Przeprowadzono badania wpływu warunków środowiskowych na aktywność DNAzymu opartego na sekwencji telomerowej. Zbadano wpływ takich warunków jak: rodzaj kationu, obecność i stężenie surfaktantu, obecność czynnika zagęszczającego, buforu, pH, sposób termicznej obróbki układu i temperatura pomiaru. Na podstawie powyższych badań zaprojektowano nową metodę kolorymetrycznej detekcji telomerazy. Przeprowadzono również badania w poszukiwaniu nowych substratów dla reakcji peroksydazowej. Badaniu poddano trzy fluorogenne substraty: tiaminę, Amplex Red i MNBDH. Testowano też możliwość enzymatycznej depozycji srebra przez DNAzym o aktywności peroksydazowej. Pozytywne wyniki pozwoliły na opracowanie układów analitycznych wykorzystujących techniki plazmonowego rezonansu: SPR i LSPR.
Dissertation is devoted to the field concerning new bioanalytical systems based on DNA aptamers with catalytic activity that are known as DNAzymes. The most interesting DNAzyme with peroxidase activity has been selected for study. It is created by a complexation of hemin with G-quadruplex. Such a system is able to catalyze indicator reaction between specific substrate (dye) and H2O2, which was exploited for amplified detection in many bioassays including determination of telomerase activity. This enzyme is present in more than 90% of cancer cells and is used as a cancer biomarker. The aim of this study was to verify whether the development of direct telomerase assay based on telomeric DNA is feasible and to develop novel substrates for indicator reaction of DNAzymes. The environment conditions impact on DNAzyme based on telomeric strand were investigated. The influence of cation nature, presence and concentration of surfactant, presence of crowding agent, buffer, pH, thermal treatment, temperature of measurement were investigated. Based on those experiments the set of optimal conditions for activity of DNAzyme formed by telomeric sequence was chosen. On the basis of optimization experiments, the new method for colorimetric telomerase detection was proposed. The study were also focused on development of fluorogenic substrates. Three substrates were investigated: thiamine, Amplex Red and MNBDH. The possibility of catalytic deposition of silver by DNAzyme was also investigated. Positive results allowed for designing new applications based on Plasmon resonance techniques – SPR and LSPR.
Dissertation is devoted to the field concerning new bioanalytical systems based on DNA aptamers with catalytic activity that are known as DNAzymes. The most interesting DNAzyme with peroxidase activity has been selected for study. It is created by a complexation of hemin with G-quadruplex. Such a system is able to catalyze indicator reaction between specific substrate (dye) and H2O2, which was exploited for amplified detection in many bioassays including determination of telomerase activity. This enzyme is present in more than 90% of cancer cells and is used as a cancer biomarker. The aim of this study was to verify whether the development of direct telomerase assay based on telomeric DNA is feasible and to develop novel substrates for indicator reaction of DNAzymes. The environment conditions impact on DNAzyme based on telomeric strand were investigated. The influence of cation nature, presence and concentration of surfactant, presence of crowding agent, buffer, pH, thermal treatment, temperature of measurement were investigated. Based on those experiments the set of optimal conditions for activity of DNAzyme formed by telomeric sequence was chosen. On the basis of optimization experiments, the new method for colorimetric telomerase detection was proposed. The study were also focused on development of fluorogenic substrates. Three substrates were investigated: thiamine, Amplex Red and MNBDH. The possibility of catalytic deposition of silver by DNAzyme was also investigated. Positive results allowed for designing new applications based on Plasmon resonance techniques – SPR and LSPR.
Description
Wydział Chemii
Sponsor
Keywords
DNAzym, DNAzyme, G-kwadrupleks, G-quadruplex, Telomeraza, Telomerase