Rola tlenku azotu w regulacji stanu acetylacji białek histonowych u Phytophthora infestans (Mont.) de Bary

Abstract

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że duża plastyczność fenotypowa jednego z najbardziej niszczycielskich fitopatogenów na świecie, Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, jest efektem mechanizmów epigenetycznych, które umożliwiają mu szybką adaptację do zmiennych sygnałów wewnętrznych i stresorów środowiskowych, w tym również rośliny-gospodarza. Co istotne, 5-metylocytozyna w DNA nie została wykryta u Phytophthora, stąd odwracalne modyfikacje białek histonowych, w szczególności acetylacja i deacetylacja, mogą odgrywać kluczową rolę w epigenetycznej kontroli ekspresji genów. U P. infestans procesy te są kontrolowane przez 33 acetylotransferazy histonowe (HATs) i 11 deacetylaz histonowych (HDACs). Zarówno u roślin, jak i u zwierząt, cząsteczka sygnałowa - tlenek azotu (NO) może również funkcjonować jako epigenetyczny modulator ekspresji genów. Chociaż rola NO w epigenetyce mikroorganizmów pozostaje niezbadana, cząsteczka ta może być formowana w strukturach patogenów podczas krytycznych przemian rozwojowych i ekspozycji na stresy. Wobec powyższego, nadrzędnym celem badań było wyjaśnienie, czy i w jakim stopniu, NO oraz następujący stres nitrozacyjny, na który patogen jest narażony podczas swojego cyklu życiowego, wpływa na wzorce (de)acetylacji histonów i zmiany ekspresji genów, prowadzące do efektywnej adaptacji i/lub patogeniczności P. infestans. Badania oparto na analizie porównawczej pomiędzy izolatem awirulentnym (Avr) MP946 i wirulentnym (vr) MP977 P. infestans względem odmiany ziemniaka (Solanum tuberosum L.) Sarpo Mira z genem odporności R3a, co pozwoliło na śledzenie zmian, potencjalnie związanych z wirulencją patogenu. Eksperymenty obejmowały fazę saprofityczną (in vitro) i pasożytniczą mikroorganizmu (in planta). W celu stworzenia warunków stresu nitrozacyjnego patogen był eksponowany na specyficzne modulatory reaktywnych form azotu (RNS). W pierwszym etapie badań wykazano, że wzmożone formowanie NO i jego pochodnej, nadtlenoazotynu, towarzyszyło fazie sporulacji oraz wzrostowi patogenu in planta. Zarówno w warunkach in planta, jak i in vitro, stres nitrozacyjny prowadził do istotnych zmian w globalnej acetylacji histonów H3 i H4. Zaobserwowana hiperacetylacja lizyny 56 histonu H3 (H3K56ac) i lizyny 16 histonu H4 (H4K16ac) korelowała z indukcją ekspresji genów HATs, tj., PifHAM1 i PifHAC3, które odpowiedzialne są za formowanie H4K16ac i H3K56ac. Zależne od RNS zmiany w architekturze histonów, w postaci wzbogaconej akumulacji znaczników H3K56ac i H4K16ac, w regionach promotorowych molekularnych markerów fazy biotroficznej patogenu (Avr3a i Hmp1) oraz innych krytycznych genów związanych z patogenicznością (CesA1, CesA2, CesA3, sPLD-like1), wpływały na wzrost ekspresji tych genów. W kontynuacji badań, przeprowadzona charakterystyka in silico i identyfikacja jądrowych HDACs wrażliwych na RNS wykazały, że PifHDAC3 potencjalnie katalizuje deacetylację H3K56ac i reprezentuje najwyższy poziom akumulacji transkryptu w odpowiedzi na NO u Avr/vr P. infestans. Ponadto immunoanaliza wykazała, że w środowisku nitrozacyjnym in vitro oraz in planta, białko PifHDAC3 występuje powszechnie. Nie stwierdzono jednak aby RNS wywołały S-nitrozację i inhibicję PifHDAC3. Z uwagi na stwierdzony związek PifHDAC3 z kolonizacją ziemniaka przez P. infestans, ostatni etap badań wyjaśniał, czy NO i zależne od niego komórkowe zmiany redoks mogą wpływać na rekrutację PifHDAC3 do chromatyny. Analiza immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq) umożliwiła identyfikację kluczowych procesów bezpośrednio regulowanych przez PifHDAC3 u P. infestans w warunkach środowiska nitrozacyjnego. Wykazano, że loci genów docelowych dla PifHDAC3 obejmują, m.in., geny zaangażowane w strategie ofensywne P. infestans. Stwierdzony efekt był zależny od genotypu patogenu. Dowiedziono, że dostępność NO prowadzi do przemieszczenia PifHDAC3 z promotora Avr3a, a zniesienie represyjnej struktury chromatyny umożliwia aktywację transkrypcyjną Avr3a. W podsumowaniu należy podkreślić kluczową rolę NO jako ważnego sygnału epigenetycznego w biologii P. infestans oraz dynamiczną interakcję między RNS a HATs/HDACs w regulacji ekspresji genów. Wykazano, że NO/RNS, poprzez zmianę statusu (de)acetylacji histonów, stymulują proces przeprogramowania transkrypcyjnego genów związanych ze strategiami metabolicznymi, rozwojowymi i ofensywnymi patogenu i jego szybką adaptację do nowych środowisk. Wykazano, że sygnalizacja zależna od NO oraz związany z tą cząsteczką stres nitrozacyjny, odgrywają strategiczną rolę u P. infestans egzystującego w warunkach presji środowiska.

Emerging evidence suggests that the high phenotypic plasticity of one of the world's most destructive phytopathogens, Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, is driven by epigenetic mechanisms that enable its rapid adaptation to internal signals and environmental stressors, including the host-plant. Notably, Phytophthora lacks 5-methylcytosine DNA modifications, suggesting that reversible histone modifications—particularly acetylation and deacetylation—play a central role in gene regulation in these microorganisms. In P. infestans, these processes are mediated by 33 histone acetyltransferases (HATs) and 11 histone deacetylases (HDACs). Recent studies have shown that a potent signaling molecule, nitric oxide (NO), beyond its diverse regulatory roles, may also function as an epigenetic modulator of gene expression in both animals and plants. Although NO role in microbial epigenetics remains underexplored, it may accumulate in pathogen structures during critical developmental transitions and under stress. Based on the above, the primary aim of the research was to determine whether and to what extent NO and the following nitrosative stress to which P. infestans is exposed during its lifecycle affect the histone (de)acetylation patterns, thereby modulating gene expression to enhance adaptability and/or pathogenicity. The research was based on a comparative analysis between the virulent (vr) MP977 and avirulent (Avr) MP946 isolates of P. infestans against the potato (Solanum tuberosum L.) ‘Sarpo Mira’, genotype with the R3a resistance gene, to identify changes that may affect the pathogen’s virulence. The experiments included the saprophytic phase (in vitro) and the microorganism’s parasitic phase (in planta). To mimic nitrosative stress, specific reactive nitrogen species (RNS) modulators were applied to the pathogen culture. Firstly, a significant increase in the formation of NO and its derivative, peroxynitrite, was documented in P. infestans' structures during both the sporulation phase and in planta growth. It has been shown that similarly to in planta conditions, pharmacologically induced nitrosative stress results in significant changes in the global acetylation of histones H3 and H4. The observed hyperacetylation of histone H3 lysine 56 (H3K56ac) and histone H4 lysine 16 (H4K16ac) correlated with the induction of the expression of HAT genes, i.e., PifHAM1 and PifHAC3, which may catalyze the formation of H4K16ac and H3K56ac, respectively. The RNS-mediated changes in histone architecture in the form of enriched H3K56ac and H4K16ac mark accumulation in the promoter regions of the molecular markers of the pathogen’s biotrophic phase (i.e., Avr3a and Hmp1) and other critical pathogenicity-related genes (CesA1, CesA2, CesA3, sPLD-like1) up-regulated their expression. Subsequent in silico characterization and identification of RNS-responsive nuclear HDACs in P. infestans revealed that PifHDAC3 potentially catalyzes H3K56ac deacetylation and shows the highest level of transcript accumulation in response to NO. Notably, PifHDAC3 showed high abundance under nitrosative environments (in vitro and in planta); however, RNS did not provoke S-nitrosation and inhibition of recombinant PifHDAC3. As PifHDAC3 was associated with the host colonization by P. infestans, the final stage of the study evaluated whether NO and the subsequent shift in the redox environment could affect the HDAC’s recruitment to chromatin. Thus, chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) profiling provided insight into the key pathways regulated by PifHDAC3 in Avr/vr P. infestans exposed to a nitrosative environment, and revealed PifHDAC3-targeted genes involved, including those related to the pathogen's offensive strategies in a genotype-dependent manner. Notably, the NO availability led to the displacement of PifHDAC3 from the Avr3a promoter, and the loss of repressive chromatin structure enabled the transcriptional activation of Avr3a. Summarizing, the dynamic interplay between RNS and HATs/HDACs is vital in influencing the expression of diverse P. infestans genes and documents NO as an essential epigenetic signal in the pathogen biology. By altering the histone (de)acetylation status, NO/RNS trigger the transcriptional reprogramming of genes related to metabolic, developmental, and offensive strategies, which may promote high adaptability to new (micro)environments. Thus, NO signaling and nitrosative stress play a crucial role in the operation of P. infestans’ under environmental pressure.