Charakterystyka genów z rodziny MIR444 w jęczmieniu zwyczajnym (Hordeum vulgare) i ich potencjału kodującego

Abstract

MikroRNA (miRNA) są krótkimi jednoniciowymi cząsteczkami RNA, regulującymi poziom ekspresji innych genów. Geny MIR444 zidentyfikowano jedynie u roślin jednoliściennych i ich charakterystyczną cechą jest obecność intronu, który rozdziela dwie połowy struktury prekursora mikroRNA. Sekwencja mikroRNA* znajduje się w jednym egzonie, natomiast mikroRNA zlokalizowana jest w kolejnym egzonie. W jęczmieniu zidentyfikowano trzy geny MIR444 o złożonej budowie egzonowo-intronowej. Ich transkrypty, pri-miRNA444, podlegają alternatywnemu splicingowi generując izoformy, które można podzielić na funkcjonalne (mikroRNA jest produkowany) i niefunkcjonalne (mikroRNA nie jest produkowany). Z wykorzystaniem analizy bioinformatycznej i techniki profilowania polisomów wykazano, że zidentyfikowane izoformy pri-miR444 posiadają otwarte ramki odczytu, które mogą kodować peptydy o długościach 119 (PEP444a), 51 (miPEP444b) oraz 168 (PEP444c) aminokwasów. Przy użyciu specyficznych przeciwciał potwierdzono obecność PEP444a w pędach jęczmienia w warunkach stresu nadmiaru azotu oraz PEP444c w pędach i korzeniach, zarówno w warunkach kontrolnych jak i w stresie nadmiaru azotu. Wykazano, że mutacje wprowadzone w rejonie sekwencji kodującej PEP444a mają najprawdopodobniej efekt letalny. Mutacje w sekwencji kodującej PEP444c wprowadziły przedwczesny kodon stop. U roślin transgenicznych pep444c ze zmienioną sekwencją aminokwasową PEP444c zaobserwowano obniżony poziom mikroRNA444c w korzeniach, co wskazuje na istotną rolę PEP444c w regulacji poziomu ekspresji genu MIR444c.

MicroRNAs (miRNAs) are small single-stranded RNA molecules that regulate the level of expression of their target genes. MIR444 family genes have been identified in monocots and their characteristic feature is the presence of an intron that separates two halves of microRNA precursor structure. The microRNA* is in one exon, while the microRNA is in the next exon. Three MIR444 genes with a complex exon-intron structure have been identified in barley. Their transcripts, pri-miRNA444, undergo alternative splicing events generating isoforms that can be divided into functional (microRNA is roduced) and non-functional (microRNA is not produced). Using bioinformatic analysis and polysome profiling technique, it was shown that identified isoforms contain open reading frames (ORFs) that can encode peptides of 119 (PEP444a), 51 (miPEP444b) and 168 (PEP444c) amino acids. Using specific antibodies, we confirmed the presence of PEP444a in barley shoots under nitrogen excess stress and PEP444c in shoots and roots, both under control and nitrogen excess conditions. Mutations introduced in the sequence encoding PEP444a have been shown to be most likely lethal. Mutations in the PEP444c coding sequence have introduced a premature stop codon. Moreover, pep444c transgenic plants with mutations in the sequence encoding PEP444c showed reduced level of microRNA444c in barley roots. This result indicates an important role of PEP444c in regulating the expression level of the MIR444c.