Recent Submissions
Item type:Item, Access status: Restricted , Rola FKBP2 w fałdowaniu proinsuliny i powstawaniu komórek β trzustki zróżnicowanych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych(2025) Urbaniak, Edyta; Borowiak, Małgorzata. PromotorCukrzyca stanowi jedno z największych wyzwań zdrowotnych współczesności, a jej przebieg związany jest z postępującą dysfunkcją i utratą komórek β trzustki. Prawidłowe funkcjonowanie tych komórek zależy od zdolności do intensywnej syntezy i wydzielania insuliny, co wymaga sprawnych mechanizmów fałdowania proinsuliny. Kluczową rolę w tym procesie odgrywają molekularne chaperony i izomerazy peptydylo-prolilowe, w tym peptydylo-prolyl cis-trans izomeraza 2 (FKBP2). Celem niniejszej rozprawy było zbadanie roli FKBP2 w procesie różnicowania i powstawaniu ludzkich komórek β in vitro, z wykorzystaniem pluripotencjalnych komórek macierzystych (ang. human pluripotent stem cells, hPSC). Postawiono hipotezę, że białko FKBP2 uczestniczy w prawidłowym fałdowaniu proinsuliny, a jego brak prowadzi do aktywacji stresu retikulum endoplazmatycznego (ER), zaburzeń homeostazy wapniowej oraz zmian w różnicowaniu w kierunku komórek β. W pracy opracowano trzy modele hPSC: 1) z delecją genu FKBP2 (ang. FKBP2 knockout, KO), 2) z jego nadekspresją (ang. FKBP2 gene overexpression, OE) oraz 3) z indukowaną delecją genu (ang. FKBP2 induced knockout, iKO). Hodowla hPSC była różnicowana w kierunku komórek β i analizowana z wykorzystaniem szeregu technik, włączając w to immunofluorescencję, western blot, mikroskopię ze strukturalnym oświetleniem i elektronową, testy sekrecji insuliny, pomiary stężenia wapnia oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (ang. single cell RNA-sequencing, scRNA-seq). Uzyskane wyniki pozwoliły stwierdzić, że brak FKBP2 prowadzi do spadku syntezy insuliny przy zachowanej produkcji proinsuliny, akumulacji C-peptydu, zaburzeń morfologii ziarnistości wydzielniczych oraz zmian w poziomie białek uczestniczących w powstawianiu komórek β. Równocześnie obserwowano aktywację stresu ER oraz spadek syntezy białka SERCA2, co skutkowało zaburzoną homeostazą wapniową. Analizy scRNA-seq ujawniły aktywację szlaku NFAT2–HDAC9, prowadzącą do zmiany fenotypu w kierunku komórek α trzustki. Interwencja farmakologiczna hamująca funkcję HDAC9 częściowo przywróciła syntezę insuliny i znacząco spowolniła proces różnicowania w stronę komórek α. Uzyskane wyniki wskazują, że FKBP2 pełni wieloaspektową rolę w komórkach β – działa jako białko opiekuńcze wspomagające fałdowanie proinsuliny, jako regulator odpowiedzi na stres siateczki śródplazmatycznej (ER) i modulator homeostazy wapniowej oraz jako czynnik stabilizujący „tożsamość” komórek β. Jego brak inicjuje kaskadę zaburzeń molekularnych prowadzących do utraty funkcjonalności i przeprogramowania procesu różnicowania w kierunku komórek α. Wyniki te sugerują, że FKBP2 może być potencjalnym biomarkerem funkcji i wydajności procesu różnicowania komórek β z hPSC, co jest istotne dla terapii komórkowych i interwencji farmakologicznych ukierunkowanych na poprawę powstawania i funkcjonowania komórek β w cukrzycy. Diabetes presents a significant health challenge today, primarily linked to the progressive dysfunction and loss of pancreatic β-cells. The effective functioning of these cells relies on their ability to quickly synthesize and secrete insulin, which hinges on the proper mechanisms for proinsulin folding. In this regard, molecular chaperones and peptidyl-prolyl isomerases, particularly peptidyl-prolyl cis-trans izomerase 2 (FKBP2), are crucial. This dissertation aims to explore the role of FKBP2 in the differentiation and formation of human β-cells in vitro, leveraging human pluripotent stem cells (hPSCs). It is believed that FKBP2 plays a crucial role in ensuring proinsulin folds correctly, and its absence triggers endoplasmatic reticulum (ER) stress, disrupts calcium homeostasis, and affects the differentiation process towards β- cells. To investigate this, three hPSC models were established: 1) a model with the FKBP2 gene deleted (knockout, KO), 2) a model with FKBP2 overexpression (OE) and 3) a model with an induced knockout of the gene (iKO). The cell cultures were directed toward β-cells and assessed through a diverse range of techniques, including immunofluorescence, Western blotting, structured illumination microscopy, electron microscopy, insulin secretion assays, calcium measurements, and single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq). The findings indicated that FKBP2 deficiency results in reduced insulin synthesis while maintaining proinsulin production. This was accompanied by C-peptide buildup, changes in secretory granule structure, and diminished expression of β-cell maturation markers. At the same time, there was evidence of ER stress activation and lower levels of SERCA2 protein, which led to disrupted calcium balance. Further scRNA-seq analysis uncovered activation of the NFAT2- HDAC9 pathway, suggesting a transition toward a pancreatic α-cell phenotype. Pharmacological intervention that inhibits HDAC9 function has been shown to partially restore insulin synthesis and notably slow the differentiation process toward α-cells. This highlights the multifaceted role of FKBP2 in β-cells: it serves as a chaperone for proinsulin folding, regulates the endoplasmic reticulum (ER) stress response, modulates calcium homeostasis, and stabilizes β-cell identity. When FKBP2 is absent, it triggers a cascade of molecular disruptions that result in a loss of functionality and a shift in the differentiation process toward α-cells (cellular reprogramming). These findings suggest that FKBP2 could be a valuable biomarker for assessing the function and efficiency of β-cell differentiation from hPSCs, which is crucial for advancing cell therapies and pharmacological strategies aimed at enhancing β-cell formation and function in diabetes.Item type:Item, Access status: Open Access , Związek genów układu odpornościowego nornicy rudej (Clethrionomys glareolus) z genami białek powierzchniowych krętków Borrelia afzelii(2025) Różańska-Wróbel, Joanna; Radwan, Jacek. PromotorInterakcje między żywicielami i pasożytami prowadzą do ich współzależnej ewolucji. Wynikająca z tych oddziaływań koewolucyjna dynamika wpływa na kształtowanie zmienności genetycznej, struktury populacji oraz rozprzestrzeniania się chorób. Może ona sprzyjać utrzymywaniu się wysokiego poziomu polimorfizmu, często przekraczającego założenia wynikające z neutralnej ewolucji. Teoria koewolucji zakłada specyficzne oddziaływania pomiędzy genami żywiciela i pasożyta, jednak niewiele jest bezpośrednich dowodów na takie interakcje, zwłaszcza wśród dzikich populacji kręgowców. Niniejsza rozprawa doktorska ma na celu wypełnienie tej luki poprzez badanie nornicy rudej (Clethrionomys glareolus) oraz infekującej ją bakterii Borrelia afzelii. Bakteria ta przenoszona jest przez kleszcze i u ludzi wywołuje chorobę zwaną boreliozą. Jednak człowiek jest przypadkowym żywicielem dla krętków Borrelia, a ich głównym nosicielem są małe ssaki i ptaki. Badania zawarte w rozprawie bazują na fakcie, że nornice rude są jednym z głównych, naturalnych żywicieli B. afzelii w Europie. W celu zgłębienia genetycznych podstaw interakcji żywiciel-patogen, praca skupia się na poszukiwaniu związków pomiędzy różnymi wariantami genów nornicy i krętków Borrelia, które kodują oddziałujące ze sobą białka, a także bada zmiany ekspresji genów nornic w odpowiedzi na infekcję bakterią Borrelia, wykorzystując sekwencjonowanie całych transkryptomów. Łącznie, oba te podejścia dążą do lepszego zrozumienia genetycznych oddziaływań gospodarz-pasożyt ukształtowanych przez koewolucję, a także zbadania szerszej perspektywy odpowiedzi immunologicznej nornic, która może leżeć u podstaw tolerancji na infekcję u tych gryzoni. Interactions between hosts and their parasites drive a coevolutionary dynamic, shaping genetic diversity, population structure, and disease spread. This dynamic can promote the maintenance of high levels of polymorphism, often exceeding expectations under neutral evolution. While coevolutionary theory assumes specific genetic associations between hosts and parasites, direct evidence for such relationships, especially in wild vertebrate populations, remains scarce. This thesis aims to contribute to addressing this gap by studying the bank vole (Clethrionomys glareolus) and its pathogen Borrelia afzelii, a bacterium that causes Lyme disease in humans. The research builds on the fact that bank voles are natural reservoir hosts of B. afzelii in Europe. To explore the genetic basis of host–pathogen interactions, the thesis investigates specific gene pairs in both host and pathogen, as well as the bank vole’s transcriptomic response to B. afzelii infection. Together, these two approaches aim to uncover both specific genetic associations shaped by coevolution and broader patterns of immune activation that may underlie infection tolerance in this natural reservoir host.Item type:Item, Access status: Open Access , Opracowanie zestawu polimorficznych markerów STR do genotypowania ludzi oraz jego wdrożenie do analiz pokrewieństwa w dalszych relacjach rodzinnych(2025) Łuczak, Wojciech; Dabert, Mirosława. Promotor; Świerczyńska, Katarzyna. Promotor pomocniczyAnaliza długości sekwencji mikrosatelitarnych, czyli krótkich powtórzeń tandemowych (ang. STR – Short Tandem Repeats), jest jedną z najważniejszych metod stosowanych w genetyce sądowej, w tym w badaniach biologicznego pokrewieństwa. Jej powszechność stosowania wynika z wysokiej informatywności, czułości oraz możliwości badania zdegradowanego DNA. Dodatkowo, metoda ta charakteryzuje się niskim kosztem jednostkowym analizy i krótkim czasem realizacji badań. Rutynowa analiza loci STR w laboratoriach genetyczno-sądowych opiera się na technice multipleks-PCR, wykorzystującej fluorescencyjnie znakowane startery, oraz na elektroforezie kapilarnej, która umożliwia określenie długości zamplifikowanych alleli. W badaniach kryminalistycznych i analizach pokrewieństwa najczęściej stosuje się technologię pozwalającą na jednoczesną analizę dwudziestu loci STR z systemu CODIS (ang. Combined DNA Index System) oraz dodatkowych loci STR, takich jak SE33, PENTA D i PENTA E, przy użyciu komercyjnych zestawów odczynników. Analiza dwudziestu loci STR systemu CODIS jest zazwyczaj wystarczająca w stosunkowo prostych sprawach dotyczących badania biologicznego ojcostwa lub macierzyństwa, jednak okazuje się być niewystarczająco informatywna w przypadku badania pokrewieństwa w relacjach pokrewieństwa drugiego i trzeciego stopnia. Celem niniejszego doktoratu wdrożeniowego było opracowanie metody Kinfinder do badania biologicznego pokrewieństwa w dalszych relacjach rodzinnych. Metoda miała zostać wdrożona w Laboratorium Diagnostyki Molekularnej GenMed, w związku z czym musiała opierać się na technologii reakcji multipleks-PCR oraz elektroforezy kapilarnej. Takie podejście pozwoliłoby na stosowanie metody przez firmę bez konieczności ponoszenia dodatkowych kosztów inwestycyjnych w nową aparaturę, przestrzeń laboratoryjną oraz w szkolenia pracowników. Projekt opracowania metody Kinfinder obejmował analizę bioinformatyczną genomu ludzkiego, w celu identyfikacji 150-200 najbardziej polimorficznych loci STR, następnie zaprojektowanie starterów do reakcji PCR do amplifikacji każdego z wybranych loci i przeprowadzenie laboratoryjnych badań przesiewowych loci STR pozwalających na oszacowanie heterozygotyczności loci w populacji polskiej. W kolejnym etapie wybrano 50 najbardziej polimorficznych loci i opracowano dwie reakcje multipleks-PCR do genotypowania ludzkiego DNA w zakresie wybranych loci STR. Po zaprojektowaniu i walidacji metody, dysponując możliwością analizy 50 loci w dwóch reakcjach multipleks-PCR, przeprowadzono badania populacyjne mające na celu wyznaczenie częstości występowania alleli każdego locus w populacji polskiej. Badania opisane w niniejszej pracy objęły także sekwencjonowanie loci w celu powiązania długości sekwencji tandemowo powtórzonej z długością amplikonów, a także objęły stworzenie drabiny allelicznej oraz odczynnika do kalibracji analizatora genetycznego. Badania populacyjne potwierdziły bardzo wysoką polimorficzność opracowanych 50 loci STR. Ich średnia heterozygotyczność wynosiła 88,07% co w porównaniu ze średnią heterozygotycznością loci CODIS wynoszącą w polskiej populacji 78,95% jest wyraźnie wyższą wartością. Najbardziej polimorficzne loci w zestawie Kinfinder (D8A26, D15L495, D13S742) cechowały się heterozygotycznością odpowiednio 93,45%, 93,53%, 93,9% co odpowiada najbardziej polimorficznemu locus STR wykorzystywanego w genetyce sądowej (SE33), którego heterozygotyczność w populacji polskiej wynosi od 93,4% do 95,4% w zależności od źródeł literaturowych. Wyniki badań wskazują, że wykorzystane dane wstępne oraz opracowana od podstaw metoda szacowania polimorfizmu loci STR pozwoliły na weryfikację heterozygotyczności wybranych loci w populacji polskiej. Zgodnie z założeniami, potwierdzono, że heterozygotyczność części loci STR jest wyższa niż ta zgłoszona w bazach projektu 1000 Genomes oraz w bazach STRCatalog i WebSTR, co uwidoczniło ograniczenia technologii sekwencjonowania krótkich odczytów zastosowanej w projekcie 1000 Genomes w analizie polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych w genomie ludzkim. Wyniki analiz statystycznych badań pokrewieństwa w różnych relacjach rodzinnych potwierdziły wysoką informatywność metody Kinfinder i jej przydatność zwłaszcza w badaniach pokrewieństwa drugiego i trzeciego stopnia. Zgodnie z założeniami doktoratu wdrożeniowego, metoda Kinfinder została włączona do standardowych procedur Laboratorium Diagnostyki Molekularnej GenMed i została już zastosowana w ponad trzydziestu badaniach pokrewieństwa w tym w sprawach sądowych. The analysis of microsatellite sequences, also known as Short Tandem Repeats (STR), is one of the most important methods used in forensic genetics, including in biological kinship testing. Its widespread use results from its high informativeness, sensitivity, and the ability to analyze degraded DNA. Additionally, this method is characterized by low per-sample cost and a short turnaround time for analysis. Routine STR locus analysis in forensic genetics laboratories relies on the multiplex-PCR technique, which uses fluorescently labeled primers, and capillary electrophoresis, which enables the determination of the lengths of amplified alleles. In forensic investigations and kinship analysis, technology allowing for the simultaneous analysis of twenty CODIS STR loci (Combined DNA Index System) and additional STR loci, such as SE33, PENTA D, and PENTA E, using commercial reagent kits is commonly employed. The analysis of twenty CODIS STR loci is sufficient for relatively simple cases of biological paternity or maternity testing, but it proves to be insufficiently informative for kinship testing in second and third-degree familial relationships. The aim of this implementation PhD was to develop the KinFinder method for investigating biological kinship in more distant familial relationships. The method was intended to be implemented in the GenMed Molecular Diagnostics Laboratory, and therefore, it needed to be based on the technology of multiplex-PCR and capillary electrophoresis. This approach would allow the company to use the method without incurring additional investment costs for new equipment, laboratory space, or employee training. The development of the Kinfinder method involved a bioinformatic analysis of the human genome to identify 150-200 of the most polymorphic STR loci, followed by the design of PCR primers for the amplification of each selected locus, and laboratory screening of STR loci to estimate the heterozygosity of these loci in the Polish population. In the next phase, 50 of the most polymorphic loci were selected, and two multiplex-PCR reactions were developed for genotyping human DNA at the selected STR loci. After the design and validation of the method, with the ability to analyze 50 loci in two multiplex-PCR reactions, population studies were conducted to determine the allele frequencies of each locus in the Polish population. The research described in this dissertation also included sequencing of the loci to link the length of the tandem repeat sequence to the length of the amplicons, as well as the creation of an allelic ladder and a reagent for calibrating the genetic analyzer. Population studies confirmed the very high polymorphism of the 50 developed STR loci. Their average heterozygosity was 88.07%, which is significantly higher compared to the average heterozygosity of CODIS loci in the Polish population, which is 78.95%. The most polymorphic loci in the KinFinder set (D8A26, D15L495, D13S742) had heterozygosity rates of 93.45%, 93.53%, and 93.9%, respectively, comparable to the most polymorphic STR locus used in forensic genetics (SE33), whose heterozygosity in the Polish population ranges from 93.4% to 95.4%, depending on the literature reports. The results of the study show that the preliminary data used, as well as the newly developed method for estimating STR locus polymorphism, allowed for the verification of the heterozygosity of selected loci in the Polish population. As predicted, it was confirmed that the heterozygosity of some STR loci is higher than that reported in the 1000 Genomes project database and the STRCatalog and WebSTR databases, highlighting the limitations of the short-read sequencing technology used in the 1000 Genomes project for analyzing microsatellite sequence polymorphism in the human genome. The statistical analysis of kinship tests in various familial relationships confirmed the high informativeness of the KinFinder method and its usefulness, particularly in second and third-degree kinship testing. In line with the objectives of this implementation PhD, the KinFinder method has been incorporated into the standard procedures of the GenMed Molecular Diagnostics Laboratory and has already been applied in over thirty kinship tests, including court cases.Item type:Item, Access status: Open Access , Wpływ bisfosfonianów stosowanych w terapii osteoporozy na metabolizm tlenowy komórek śródbłonka(2025) Budzińska, Adrianna; Jarmuszkiewicz, Wiesława. PromotorOsteoporoza jest najczęstszą chorobą metabolizmu kości, głównie wśród kobiet w wieku pomenopauzalnym. Najczęściej stosowanymi lekami zmniejszającymi resorpcję kości są bisfosfoniany zawierające azot (N-BPs). Mechanizm działania N-BPs opiera się na blokowaniu enzymu syntazy farnesylopirofosforanu (FPPS) w szlaku mewalonowym. Szlak mewalonowy odgrywa ważną rolę w wielu procesach komórkowych takich jak prenylacja białek i modyfikacje potranslacyjne a także synteza cząsteczek zawierających jednostki izoprenoidowe, w tym hemów a (grup prostetycznych kompleksu IV) czy koenzymu Q (CoQ). CoQ jest kluczowym przenośnikiem elektronów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym oraz ważnym przeciwutleniaczem chroniącym przed uszkodzeniami peroksydacyjnymi, obecnym we wszystkich błonach komórki, głównie mitochondrialnych. Komórki śródbłonka wyściełają naczynia krwionośne, co sprawia, że mają ciągły kontakt z substancjami transportowanymi przez krew, w tym lekami. Praca doktorska koncentruje się na wieloaspektowym wpływie N-BPs na metabolizm tlenowy komórek śródbłonka naczyń krwionośnych. Rozprawa złożona jest z dwóch prac doświadczalnych i jednej pracy przeglądowej, które prezentują analizę mechanizmów, za pomocą których N-BPs, takie jak alendronian i zoledronian, wpływają na metabolizm energetyczny, stres oksydacyjny i funkcjonowanie mitochondriów w komórkach. Materiałem badawczym użytym w pracach doświadczalnych były ludzkie komórki śródbłonka EA.hy926, traktowane przez sześć dni 5 μM alendronianem lub 1 μM zoledronianem, oraz izolowane mitochondria z tych komórek. Analiza zmian metabolizmu energetycznego wywołanych przez N-BPs została przeprowadzona w dwóch etapach tj. na poziomie komórkowym (Publikacja 1) oraz mitochondrialnym (Publikacja 2). Doświadczenia przeprowadzone na całych komórkach śródbłonka (Publikacja 1) pokazały, że N-BPs wywołują spadek żywotności komórek, nasilony stres oksydacyjny i stan zapalny oraz obniżenie aktywności szlaku sygnałowego ERK1/2 zależnego od prenylacji. Stwierdzono także istotne zmiany w metabolizmie energetycznym komórek polegające na zwiększeniu oddychania beztlenowego, obniżeniu mitochondrialnego utleniania głównych substratów oddechowych (oprócz kwasów tłuszczowych) i spadku poziomu ATP. Po raz pierwszy pokazano, że zahamowanie szlaku mewalonowego przez N-BPs wywołuje w komórkach śródbłonka znaczny spadek poziomu całkowitego CoQ oraz utratę jego zredukowanej puli. Zmianom tym towarzyszy wzrost produkcji reaktywnych form tlenu (RFT). Badania wskazują, że N-BPs zmieniają także dynamikę mitochondriów poprzez redukcję ich fragmentacji. A zatem, N-BPs modulują metabolizm energetyczny komórek śródbłonka prowadząc do zmian w statusie energetycznym komórek, homeostazie redoks CoQ, aktywności metabolizmu tlenowego i kontroli jakości mitochondriów. Kolejne badania prowadzone na poziomie mitochondriów izolowanych z komórek śródbłonka poddanych sześciodniowej hodowli z N-BPs (Publikacja 2) koncentrowały się na adaptacji bioenergetyki mitochondriów do dużego ponad 40% spadku poziomu mitochondrialnego CoQ (mtCoQ) wywołanego zahamowaniem szlaku mewalonowego. W mitochondriach komórek traktowanych N-BPs w porównaniu do mitochondriów kontrolnych, obniżeniu całkowitej puli i utracie zredukowanej puli mtCoQ towarzyszy większa produkcja RFT i aktywacja systemów antyoksydacyjnych. Niedobór mtCoQ prowadzi do obniżonego utleniania substratów oddechowych (oprócz kwasów tłuszczowych), obniżonej aktywności kompleksów II i III oraz syntazy ATP, spadku potencjału błonowego mitochondriów, efektywności syntezy ATP oraz reorganizacji superkompleksów łańcucha oddechowego. Większa produkcja RFT związana jest z większym poziomem redukcji mtCoQ. Po raz pierwszy zaobserwowano, że N-BPs mogą prowadzić do obniżenia poziomu hemów a w mitochondriach. A zatem wyniki te wskazują, że wywołane przez N-BPs zaburzenie homeostazy redoks mtCoQ może istotnie wpływać na aktywność bioenergetyczną mitochondriów komórek śródbłonka. Praca przeglądowa przedstawiona w ramach rozprawy (Publikacja 3) zbiera wyniki dotychczasowych badań, wskazujące na szerokie spektrum działania N-BPs poza tkanką kostną – w tym ich wpływ na organizację cytoszkieletu, apoptozę zależną od mitochondriów, gospodarkę wapniową oraz procesy związane z kontrolą jakości mitochondriów. N-BPs, jako inhibitory szlaku mewalonowego, powodują szereg skutków ubocznych zarówno na poziomie całej komórki jak i dotyczących funkcjonowania mitochondriów. Dalsze badania nad złożonym powiązaniem pomiędzy szlakiem mewalonowym, funkcjonowaniem mitochondriów a ogólną homeostazą komórkową mogą być istotne dla optymalizacji klinicznego zastosowania N-BPs, być może uwzględniającego suplementację CoQ10, i ograniczenia efektów ubocznych w tkankach niebędących celem terapii. Wnioski z pracy doktorskiej podkreślają istotne, potencjalnie niepożądane skutki działania N-BPs na komórki niezwiązane z kośćcem, na przykładzie komórek śródbłonka. Przedstawione badania sugerują, że efekty te mogą przyczyniać się do powikłań sercowo-naczyniowych u pacjentów leczonych N-BPs, a mechanizmy mitochondrialne mogą stanowić istotny punkt docelowy dalszych badań oraz potencjalnych strategii ochronnych. Osteoporosis is the most common disease of bone metabolism, mainly among postmenopausal women. The most commonly used drugs to reduce bone resorption are nitrogen-containing bisphosphonates (N-BPs). The mechanism of action of N-BPs is based on blocking the enzyme farnesylpyrophosphate synthase (FPPS) in the mevalonate pathway. The mevalonate pathway plays an important role in many cellular processes such as protein prenylation and post-translational modifications as well as the synthesis of molecules containing isoprenoid units, including a-hemes (prosthetic groups of complex IV) or coenzyme Q (CoQ). CoQ is a key electron carrier in the mitochondrial respiratory chain and an important antioxidant present in all cell membranes, mainly mitochondrial, that protects against peroxidative damage. Endothelial cells line blood vessels, which means they are in constant contact with substances transported by the blood, including drugs. The doctoral thesis focuses on the multifaceted influence of N-BPs on the oxidative metabolism of vascular endothelial cells. The dissertation consists of two experimental papers and one review paper, which present an analysis of the mechanisms by which N-BPs, such as alendronate and zoledronate, affect energy metabolism, oxidative stress and mitochondrial function in cells. The research material used in the experiments were human endothelial cells EA.hy926, treated for six days with 5 μM alendronate or 1 μM zoledronate, and isolated mitochondria from these cells. The analysis of changes in energy metabolism induced by N-BPs was carried out in two stages, i.e., at the cellular level (Publication 1) and the mitochondrial level (Publication 2). Experiments conducted on whole endothelial cells (Publication 1) showed that N-BPs cause a decrease in cell viability, increased oxidative stress and inflammation, and a decrease in the activity of the prenylation-dependent ERK1/2 signaling pathway. Significant changes in cell energy metabolism were also observed, consisting in increased anaerobic respiration, decreased mitochondrial oxidation of the main respiratory substrates (except fatty acids) and a decrease in ATP level. For the first time, it has been shown that inhibition of the mevalonate pathway by N-BPs induces a significant decrease in the level of total CoQ and a loss of its reduced pool in endothelial cells. These changes are accompanied by an increase in the production of reactive oxygen species (ROS). Studies indicate that N-BPs also change the dynamics of mitochondria by reducing their fission. Thus, N-BPs modulate the energy metabolism of endothelial cells leading to changes in the energy status of cells, CoQ redox homeostasis, the activity of oxygen metabolism and mitochondrial quality control. Further studies conducted at the level of mitochondria isolated from endothelial cells cultured for six days with N-BP (Publication 2) focused on the adaptation of mitochondrial bioenergetics to the large decrease of more than 40% in mitochondrial CoQ (mtCoQ) levels caused by the inhibition of the mevalonate pathway. In mitochondria of cells treated with N-BPs, compared with control mitochondria, the decrease in the total pool and the loss of the reduced pool of mtCoQ are accompanied by greater production of ROS and activation of antioxidant systems. mtCoQ deficiency leads to decreased oxidation of respiratory substrates (except fatty acids), decreased activity of complexes II and III and ATP synthase, decreased mitochondrial membrane potential, efficiency of ATP synthesis and reorganization of respiratory chain supercomplexes. Increased ROS production is associated with higher reduction level of mtCoQ. It was observed for the first time that N-BPs can lead to decreased level of heme a in mitochondria. Therefore, these results indicate that N-BP-induced disruption of mtCoQ redox homeostasis can significantly affect bioenergetic activity of endothelial mitochondria. The review presented in the dissertation (Publication 3) summarizes the results of previous studies indicating a wide spectrum of N-BP action outside bone tissue – including their effects on cytoskeletal organization, mitochondrial-dependent apoptosis, calcium metabolism and processes related to mitochondrial quality control. N-BPs, as inhibitors of the mevalonate pathway, cause a number of side effects both at the cellular level and mitochondrial function. Further studies on the complex relationship between the mevalonate pathway, mitochondrial function and overall cellular homeostasis may be important to optimize the clinical use of N-BPs, possibly including CoQ10 supplementation, and to limit side effects in off-target tissues. The conclusions of the doctoral thesis highlight the significant, potentially adverse effects of N-BP on non-skeletal cells, exemplified by endothelial cells. The studies presented suggest that these effects may contribute to cardiovascular complications in patients treated with N-BP, and mitochondrial mechanisms may be an important target for further research and potential protective strategies.Item type:Item, Access status: Open Access , Powiązania pomiędzy retrogenami i nowotworami – kontekst ewolucyjny(2025) Staszak, Klaudia; Makałowska, Izabela. PromotorProces retropozycji, w którym dojrzały mRNA podlega odwrotnej transkrypcji do cDNA i ponownej integracji z genomem, skutkuje powstaniem dodatkowej kopii istniejącego genu (genu rodzicielskiego). Kopie takie, nazywane retrokopiami lub retrogenami, często osadzają się w intronach innych genów, zwanych genami gospodarzy. Retrokopie, dotychczas opisywane jako niefunkcjonalne elementy, są obecnie uznawane za istotne w kontekście ewolucji, a ich rola w kształtowaniu genomów, transkryptomów i proteomów staje się coraz bardziej widoczna. Rosnąca liczba danych z wysokoprzepustowych eksperymentów umożliwia identyfikację nowych funkcjonalnych retrogenów. Bardzo często regulują one poziom ekspresji swoich genów rodzicielskich działając jako gąbki miRNA czy antysensowne transkrypty oraz mogą brać udział w regulacji epigenetycznej, modyfikacji alternatywnego splicingu czy w formacji transkryptów fuzyjnych. Zjawisko retropozycji było szczególnie wzmożone podczas ewolucji naczelnych. Związek między wyjątkowo dużą liczbą retrokopii człowieka, w porównaniu do innych gatunków zwierząt, a transformacją nowotworową u naszego gatunku, nie jest dobrze poznany. Dlatego głównym celem pracy było sprawdzenie na ile intensywny proces retropozycji u naczelnych może być powiązany ze wzmożonymi, w porównaniu z innymi gatunkami, procesami nowotworzenia u człowieka. Materiał do badań stanowiły dane transkryptomiczne człowieka, psa oraz kury. Ekspresję retrogenów związanych z nowotworami zweryfikowano także eksperymentalnie w ludzkich liniach komórkowych, w panelu cDNA pochodzącego z różnych narządów badanych gatunków oraz w świeżo mrożonych próbach nowotworowych i tkankach okalających pobranych od psów i szczurów. Ekspresję wybranych retrogenów wyciszono w ludzkich liniach komórkowych, by zbadać wpływ na ekspresję genu rodzicielskiego lub genu gospodarza. W oparciu o wyniki analizy ekspresji różnicowej zidentyfikowano 135 retrogenów o zmienionej ekspresji w nowotworach człowieka. Spośród nich ponad trzykrotnie więcej należy do retrogenów specyficznych dla naczelnych. Retrogeny HSPA2, RHOB i CALML5 wskazano jako retrogeny powiązane z nowotworami odległych ewolucyjnie gatunków kręgowców. Ponadto, wskazano retrogeny powiązane z nowotworami, które są specyficzne dla badanych gatunków kręgowców a także retrogeny, które mogą działać jako ważne niekodujące RNA regulujące geny znane jako pełniące role w komórkach nowotworowych. Wyniki uzyskane w ramach niniejszej pracy umożliwiły po raz pierwszy w tak dużej skali spojrzeć na profil ekspresji retrogenów w nowotworach w kontekście ewolucyjnym. The process of retroposition, in which mature mRNA is reverse transcribed into cDNA and reintegrated into the genome, results in the creation of an additional copy of an existing gene (parental gene). Such copies, called retrocopies or retrogenes, are often embedded in introns of other genes, called host genes. Retrocopies, previously described as non-functional elements, are now recognized as important in the context of evolution, and their role in shaping genomes, transcriptomes and proteomes is becoming increasingly evident. An increasing amount of data from high-throughput experiments is allowing the identification of new functional retrogenes. Very often, they regulate the expression level of their parental genes by acting as miRNA sponges or antisense transcripts, and may participate in epigenetic regulation, modification of alternative splicing or in the formation of fusion transcripts. The phenomenon of retroposition has been particularly intensified during the evolution of primates. The relationship between the exceptionally high number of human retrocopies, compared to other animal species, and neoplastic transformation in our species is not well understood. Therefore, the main aim of the study was to investigate to what extent the intensive process of retroposition in primates can be linked to increased, compared to other species, processes of human carcinogenesis. The study material consisted of transcriptomic data from human, dog and chicken. The expression of retrogenes associated with tumors was also experimentally verified in human cell lines, in a panel of cDNA from different organs of the studied species and in fresh-frozen tumor samples and surrounding tissues collected from dogs and rats. The expression of selected retrogenes was silenced in human cell lines to examine the effect on the expression of the parental gene or the host gene. Based on the results of the differential expression analysis, 135 retrogenes with altered expression in human tumors were identified. Of these, more than three times as many belong to primate-specific retrogenes. The retrogenes HSPA2, RHOB and CALML5 were identified as retrogenes associated with cancers of evolutionarily distant vertebrate species. In addition, we identified cancer-associated retrogenes that are specific to the vertebrate species studied, as well as retrogenes that may act as important non-coding RNAs regulating genes known to play a role in cancer cells. The results of this work allow, for the first time on such a large scale, to consider the expression profile of retrogenes in cancers in an evolutionary context.