Wpływ polimorfizmu DNA pomiędzy homologami na formowanie mejotycznych crossing-over w skali całogenomowej i na poziomie gorących miejsc rekombinacji u Arabidopsis thaliana

Abstract

Rekombinacja mejotyczna crossing-over jest kluczowym procesem polegającym na wzajemnej wymianie fragmentów chromosomów homologicznych, który prowadzi do tworzenia nowych kombinacji alleli w organizmach hybrydowych. Podczas rekombinacji mejotycznej, polimorfizm DNA pomiędzy homologami może mieć wpływ na częstość i rozkład crossing-over wzdłuż chromosomów. Jednak efekt ten pozostaje wciąż słabo poznany. Aby zbadać związek między polimorfizmem, a rekombinacją w skali całego genomu zoptymalizowałam metodę genotypowania przez sekwencjonowanie (GBS), która umożliwia mapowanie zdarzeń crossing-over w różnych krzyżówkach Arabidopsis thaliana. Porówanie chromosomowego rozkładu crossing-over w liniach typu dzikiego i w tle mutantów msh2, które nie są zdolne do wykrywania błędnie sparowanych zasad w DNA, ujawniło znaczące różnice. Polegają one na tym, że miejsca bardziej polimorficzne, położone w regionach przycentromerowych są mniej aktywne rekombinacyjnie w mutancie msh2, natomiast crossing-over zachodzi z wyższą częstością w regionach subtelomerowych, które zawierają znacznie mniej polimorfizmów. Ponadto, opracowałam nowe narzędzie do badania rozkładu crossing-over na poziomie gorących miejsc rekombinacji, które nazwaliśmy typowaniem nasion (ang. seed-typing). Metoda ta umożliwia zarówno pomiar częstości crossing-over, jak i precyzyjne mapowanie miejsc zajścia poszczególnych zdarzeń rekombinacyjnych. Korzystając z tego podejścia, zidentyfikowałam bardzo polimorficzny interwał ChP z trzema gorącymi miejscami rekombinacji: Aro, Coco i Nala. Nasze wyniki pokazują, że centra gorących miejsc rekombinacji są praktycznie pozbawione polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. SNP), ale obecność SNP w ich bezpośredniej bliskości stymuluje aktywność crossing-over w danym miejscu. Ponadto, zmiany strukturalne otaczające badany interwał chromosomowy nie mają wpływu na częstość rekombinacji, jeśli nie obejmują bezpośrednio gorących miejsc rekombinacji. Przy użyciu linii A. thaliana z naturalną delecją w Coco lub po wygenerowaniu sztucznej delecji przy pomocy CRSIPR/Cas9, potwierdziliśmy, że u Arabidopsis nie występuje współzawodnictwo między blisko zlokalizowanymi gorącymi miejscami rekombinacji. Dodatkowo, zbadaliśmy związek pomiędzy SNP, MSH2 i rekombinacją poprzez mapowanie crossing-over w tle mutanta msh2. Ujawniło to interesującą tendencję polegającą na tym, że bardziej polimorficzne gorące miejsca rekombinacji są mniej aktywne po wyłączeniu systemu rozpoznawania błędnie sparowanych zasad (tj. w mutancie msh2). Bezpośredni wpływ polimorfizmów został sprawdzony w liniach, które są heterozygotyczne tylko w badanym interwale. Linie te, wykazywały wyższą częstość rekombinacji w badanym interwale w porównaniu z pełni homozygotycznymi liniami wsobnymi. Efekt ten nie był widoczny w roślinach posiadających mutację w genie MSH2, co sugeruje, że MSH2 promuje zachodzenie crossing-over w gorących miejscach rekombinacji otoczonych regionami o wysokiej gęstości SNP. Meiotic crossover recombination is a fundamental process relying on reciprocal exchanges of DNA fragments between homologous chromosomes, which enables to create novel allelic combinations in hybrid organisms. During meiotic recombination, the DNA polymorphism between parental chromosomes can be detected and influence the crossover frequency and distribution along chromosomes. However, this effect remains still poorly understood. To investigate the relation between polymorphisms and recombination at the genome-wide scale, I optimized the genotyping-by-sequencing (GBS) method that enables crossover mapping in different Arabidopsis thaliana hybrids. Comparison of crossover distributions in wild type and in msh2 mutants, defective in DNA mismatch recognition, revealed the remodeling of crossover landscapes from the diverse pericentromeres towards the less-polymorphic sub-telomeric regions in the msh2 mutant. Furthermore, I also developed a new tool to study crossover distribution at the hotspot level in Arabidopsis, called seed-typing. It provides both, a precise measurement of the crossover frequency and mapping of crossover breakpoints at the fine scale. Taking advantage of this approach, I identified highly polymorphic ChP interval with three recombination hotspots: Aro, Coco and Nala. Our results demonstrate that the hotspot centres are practically devoid of polymorphisms but the presence of SNPs around hotspots stimulate their crossover activity. We also show that structural changes surrounding the interval have no effect on the crossover frequency unless they directly involve recombination hotspots. We also confirmed lack of short-distance hotspot competition in Arabidopsis using a line with a natural deletion in Coco and after deleting a part of Coco by CRISPR/Cas9. The detailed protocol for efficient generation of desired mutations in different Arabidopsis accessions is also included in this dissertation. The relation between polymorphisms, MSH2 and recombination was investigated by crossover mapping in the msh2 background at the hotspots level. It revealed an interesting trend that more polymorphic hotspots are less active after disabling mismatch recognition system (i.e., in the msh2 mutant). The direct effect of polymorphisms was examined in lines, which are heterozygous only within the tested interval. They showed higher crossover rates when compared to inbred lines. This effect was not observed in sibling plants carrying the msh2 mutation, which highlights that MSH2 promotes crossover recombination in hotspot polymorphic regions.